專利名稱：用于檢測對多烯特異的細胞色素p450羥化酶的引物的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種用于檢測對多烯特異的細胞色素P450羥化酶的引物和一種采用該引物檢測產生多烯的細菌菌株的方法。更具體地說，本發明直接提出了一種如下序列(I)的正向簡并引物和一種如下序列(II)的反向簡并引物，其與存在于多烯-特異CYP(細胞色素P450羥化酶)編碼序列中的保守區域互補；(I)5′-TGGATCGGCGACGACCGSVYCGT-3′(II)5′-CCGWASAGSAYSCCGTCGTACTT-3′在上述序列中，S代表鳥嘌呤或胞嘧啶，V代表腺嘌呤、鳥嘌呤或胞嘧啶，Y代表胸腺嘧啶或胞嘧啶，和W代表胸腺嘧啶或腺嘌呤。
背景技術：
在本說明書中，多烯是有機化合物的通用名，其包含在其化學式中幾個碳-碳雙鍵。通常，多烯抗生素被稱為多烯大環內酯。換句話說，一種多烯抗生素意指一種抗生素至少包含在大環內酯抗生素之中三個共軛的雙鍵，該大環內酯抗生素具有巨大環狀的內酯化學結構。
多烯抗生素具有巨大內酯環結構，其包含20至40碳原子并且在分子中包括大約4(4)至7(7)個共軛雙鍵。而且，多烯抗生素具有抗真菌活性。多烯抗生素由于共軛雙鍵而特異吸收UV并且根據共軛雙鍵的數目被分成四烯、五烯、六烯、七烯等。包括假絲酵母的酵母、霉菌和毛滴蟲等可適用于作為多烯抗生素和兩性霉素B，匹馬菌素和戊霉素等，其被臨床使用。
到目前為止，大多數多烯抗生素是已知的，一般通過放線菌生物合成。放線菌是革蘭氏陽性土壤微生物，其形成孢子并且產生細絲型菌絲體而且根據環境的變化而產生特殊形式的分化。放線菌是一種能產生各種具有有益生理活性的材料的菌株，例如抗生素或抗腫瘤物質。
已知的多烯化合物具有顯著的針對真菌例如霉菌和酵母的抗真菌活性，其通過鍵合真菌細胞膜的固醇并且形成通道而導致由于泄漏細胞內的成分例如K+，Mg2+等而引起真菌代謝障礙。因此，多烯化合物對不具有固醇的微生物沒有作用。
即使多烯化合物由于副作用例如強烈的毒性，而被限制用作藥物，由于它們顯著的抗真菌活性仍需要研發新的和改進的多烯大環內酯抗生素。
對于合成典型的多烯化合物例如制霉菌素、兩性霉素、匹馬菌素、假絲菌素等的放線菌的研究非常活躍。而且，有關放線菌多烯生物合成的基因簇堿基序列近來已經被完全破譯了。
該基因簇包括PKS(聚酮合成酶)基因、轉移、調節、后-聚酮修飾，其對多烯生物合成通常是需要的。
一般，在多烯化合物的生物合成中，聚酮生物合成是重復的碳鏈反應，被預處理并且隨后進行后-聚酮修飾。在這些過程中，通過CYP(細胞色素P540羥化酶)的位點-特異羥基化反應，對于使多烯具有抗真菌活性是必需的。
CYP包括氧結合位點的保守區域和血紅素配體區，并且參與各種抗生素的活化前體和對低溶解性材料的解毒。而且，CYP是一種催化各種氧化反應的酶，其采用各種化合物。例如聚酮、脂肪酸、甾醇作為基質。
除了多烯-特異CYP的基因具有存在于常規的CYP基因中的氧結合位點和血紅素配體區的保守序列之外，還具有附加的保守區域。該附加保守區域的堿基序列如圖2所示。
為了研發新的多烯大環內酯，需要研發一種能鑒別產生多烯的菌株的有效方法。
雖然與多烯生物合成有關的基因已經被研究，但是，與常規的菌株選擇方法相反，通過檢測多烯生物合成所必需的特異基因的存在，已試圖鑒別出一種新的能產生多烯的菌株。這樣的方法被稱為基于基因組的電子(silico)藥物研發方法。
電子藥物研發方法是為了檢索有用微生物，該微生物能夠從微生物的基因信息來合成抗生素或有用材料，以替代分離能產生多烯化合物的微生物以及從分離的微生物中檢測相應的基因的先前方法。這種方法能鑒別那些不能合成抗生素或有用材料的微生物，因為不管是否具有合成抗生素或有用材料的能力，各種條件沒有被優化。
因此，在該技術領域中，迫切地需要發展基于基因組的電子技術，該技術通過獲得多烯-特異CYP基因的信息并擴增樣本中的CYP基因而檢測出具有抗真菌和抗病毒活性的菌株。
發明公開技術問題因此，本發明的主要目的是為了提供一種具有如下序列(I)的正向簡并引物和一種具有如下序列(II)的反向簡并引物，其與多烯-特異CYP(細胞色素P450羥化酶)編碼序列中的保守區域互補，并且能夠有效地用于保守區域的擴增；(I)5′-TGGATCGGCGACGACCGSVYCGT-3′(II)5′-CCGWASAGSAYSCCGTCGTACTT-3′在上述序列中，S代表鳥嘌呤或胞嘧啶，V代表腺嘌呤、鳥嘌呤或胞嘧啶，Y代表胸腺嘧啶或胞嘧啶，和W代表胸腺嘧啶或腺嘌呤。
本發明的簡并引物被用于在細菌菌株中的CYP基因特異部分的選擇性擴增和檢測。該引物與多烯-特異CYP基因的保守區域結合，并因此能夠被用作PCR引物以檢測能夠進行多烯生物合成的菌株。
本發明的另一目的是為了提供一種用于檢測能產生多烯的細菌菌株的方法，該方法包括下列步驟i)加入與多烯-特異CYP編碼序列的保守區域互補的簡并引物，4(4)種脫氧核苷酸和針對細菌菌株基因的DNA聚合酶；和ii)通過檢查DNA復制是否發生而鑒別是否細菌菌株能產生多烯。
技術方案本發明的上述目的能夠通過提供一種具有如下序列(I)的正向簡并引物和一種具有如下序列(II)的反向簡并引物而實現，這兩種引物與多烯-特異CYP(細胞色素P450羥化酶)編碼序列的保守序列互補(I)5′-TGGATCGGCGACGACCGSVYCGT-3′；and(II)5′-CCGWASAGSAYSCCGTCGTACTT-3′在上述序列中，S代表鳥嘌呤或胞嘧啶，V代表腺嘌呤、鳥嘌呤或胞嘧啶，Y代表胸腺嘧啶或胞嘧啶，和W代表胸腺嘧啶或腺嘌呤。
一個簡并引物是一個DNA片段，其中，某些堿基位置包含多于一種可能的堿基。該簡并引物可用于擴增各種相似的序列。
本發明的簡并正向引物PEH-I為5′-TGGATCGGCGACGACCGSVYCGT-3′；其中，S代表G或C，V代表A、G或C，Y代表T或C。本發明的簡并反向引物PEH-2為5′-CCGWASAGSAYSCCGTCGTACTT-3′；其中W代表T或A，S代表G或C，Y代表T或C。
為了生產用于克隆多烯-特異CYP基因的簡并PCR引物，與多烯生物合成有關的該CYP基因序列應該被相互比較和分析。與多烯生物合成有關的CYP基因序列如圖2所示。
本發明的另一目的能夠通過提供一種用于檢測產生多烯的細菌菌株的方法而實現，該方法包括下列步驟i)加入與多烯-特異CYP編碼序列的保守區域互補的簡并引物，4(4)種脫氧核苷酸；脫氧腺苷5′-三磷酸(dATP)，脫氧胞苷5′-三磷酸(dCTP)，脫氧鳥苷5′-三磷酸(dGTP)，脫氧胸苷5′-三磷酸(dTTP)，和針對細菌菌株基因的DNA聚合酶；和ii)通過檢查DNA復制是否發生而鑒別是否細菌菌株能產生多烯。
多烯-特異CYP編碼基因保守區域的擴增，通過采用本發明的引物而實現。而且，通過進行電泳可以獲知是否多烯-特異CYP編碼基因存在于細菌菌株中。
本發明者通過采用本發明的簡并引物進行PCR而檢測多烯-特異CYP和包含多烯生物合成基因的放線菌。PCR之后，擴增的基因片段在包含多烯生物合成基因的菌株所獲得的PCR產品的大約350bp位點被檢測。然而，從不包含多烯生物合成基因的菌株中獲得的PCR產品中在大約350bp位點沒有檢測到基因片段。
有益效果如上所述，一個新的多烯-特異CYP基因可以從能夠產生多烯-特異CYP而通過常規研究方法無法獲知的細菌菌株，例如自營假放射菌(P.autotrophica)和S.benihana的基因通過采用本發明的簡并引物進行PCR而被檢測出來。
附圖簡要說明
圖1顯示了具有抗真菌和抗病毒活性的多烯抗生素的化學結構。
圖2顯示了多烯-特異CYP氨基酸序列的保守區域。
圖3顯示了PCR產品的瓊脂糖凝膠電泳結果。
圖4顯示了自營假放射菌的堿基序列，其通過克隆被估計為多烯-特異CYP的大約30bp的PCR片段而被分析。
最佳實施方式本發明的實際和優選實施例將在如下實施例中加以詳細的說明。本發明不限于它們并且通過本領域技術人員可以有各種修飾和改進。
實施例1簡并引物的生產放線菌的CYP具有相似的氨基酸序列并且在氧結合位點和血紅素配體區具有高度特異的相似性。而且，除了這兩個區域之外，另一個高度-保守區域存在于參與多烯生物合成的CYP蛋白中。
為了檢測多烯-特異CYP，簡并引物通過僅與多烯生物合成有關的CYP蛋白高度-保守區域的氨基酸序列信息而被制備。所采用的制備本發明簡并引物的高度保守區域如圖2中實線所示。
實施例2檢測多烯-特異CYP和培育細菌菌株的方法三種(3)放線菌鏈霉菌M145，阿維鏈霉菌(ATCC31267)和波賽鏈霉菌(ATCC29050)不包含多烯-生物合成基因，兩種(2)細菌菌株結節鏈霉菌(KCTC 9035)和諾爾斯鏈霉菌(KCTC 1083)生產多烯，和兩種(2)稀有的放線菌自營假放射菌(KCTC 9441)和Sebekiabenihana(KCTC 9660)能否生產多烯是未知的，它們被用作檢測多烯-特異CYP的菌株。
每個菌株在R2YE液體培養基中生長進入菌絲體類型并在-20℃中冷凍并用20％甘油存儲。存儲液接種在YEME液體培養基(蔗糖34Og、酵母提取物3g、Bacto-蛋白胨5g、麥芽提取物3g、葡萄糖10g、D.W.1L)中以獲得用于分離各個DNA基因組的菌株。在28℃培養5天后通過離心分離器(8000rpm)獲得相應的菌株。
實施例3PCR的性能一對在實施例1中產生的本發明的簡并引物，Taq聚合酶、2′-脫氧腺苷5′-三磷酸(dATP)、2′-脫氧胞苷5′-三磷酸(dCTP)、2′-脫氧鳥苷5′-三磷酸(dGTP)和2′-脫氧胸苷5′三磷酸(dTTP)，被加入到實施例2中培養的放線菌中。隨后，放線菌通過采用Rapid Thermocycler(Idahotechnology，USA)在96℃中變性30秒并且與引物在40℃退火30秒和在72℃中延伸35秒。所述循環在PCR中重復30次。
發明模式實施例4多烯-特異CYP檢測結果PCR產品進行電泳之后，在被報道作為多烯產生菌株的結節鏈霉菌和諾爾斯鏈霉菌中檢測出在350bp位點的擴增基因片段。然而，在不包含多烯生物合成基因的鏈霉菌、阿維鏈霉菌和波賽鏈霉菌中沒有檢測到預期大小的擴增DNA片段。
上述結果表明利用本發明的簡并引物能夠選擇性地檢測出多烯-特異CYP基因，盡管存在著大多數放線菌中各種種類相似CYP。
具體地，被估計為多烯-特異CYP的擴增基因片段，從一種未知的能進行多烯生物合成的稀有放線菌自營假放射菌的基因PCR產品中在大約350bp位點被檢測出。
實施例5在自營假放射菌中被假定為多烯-特異CYP的擴增序列的分析自營假放射菌的大約350bp的擴增片段，采用pGEMT-easy載體(Promega，USA)克隆并分析。結果顯示擴增的基因片段是一種與已經公知的常規多烯-特異CYP基因高度相似的新的多烯-特異CYP基因。
工業實用性常規研究方法是非常費力且耗時的，因為檢查一個菌株的多烯化合物生產能力需要培養菌株和檢查多烯化合物形成的步驟。而且，檢查一種培養條件復雜而困難的菌株多烯化合物的生產能力就要求更多的時間和精力。
各種類型菌株生產多烯化合物的能力，可以通過采用本發明的簡并引物和檢測方法而能夠更快和更簡便地予以檢查。
序列表文件附件HSPA0403.APP
序列表<110>Hanson biotech(株式會社韓孫生物科技)<120>Isolation of cryptic polyene hydroxylase gene viapolyene-specific degenerate PCR<130>HSPA0403.KR<160>5<170>KopatentIn 1.71<210>1<211>159<212>PRT<213>Candicidin<400>1Leu Leu Leu Ile Ala Gly His Glu Thr Thr Ala Asn Asn Ile Gly Leu1 5 10 15Gly Val Val Thr Leu Leu Ser His Arg Glu Trp Ile Gly Asp Asp Arg20 25 30Leu Val Glu Glu Leu Leu Arg Leu His Ser Val Ala Asp Met Val Ala35 40 45Leu Arg Val Ala Val Asp Asp Val Glu Ile Ala Gly Gln Thr Ile Arg50 55 60Lys Gly Glu Gly Ile Val Pro Leu Leu Ala Ser Ala Asn His Asp Thr65 70 75 80Glu Ala Phe Gly Cys Pro His Ala Phe Asn Pro Glu Arg Thr Glu Arg85 90 95Arg His Val Ala Phe Gly Tyr Gly Val His Gln Cys Leu Gly Gln Asn100 105 110Leu Val Arg Val Glu Met Glu Ile Ala Tyr Arg Lys Leu Phe Glu Arg115 120 125Ile Pro Glu Leu Arg Leu Ala Val Pro Glu Asp Gln Leu Ala Tyr Lys130 135 140Tyr Asp Gly Ile Leu Phe Gly Leu His Glu Leu Pro Val Arg Trp145 150 155<210>2<211>159<212>PRT<213>Pimaricin<400>2Leu Leu Leu Ile Ala Gly His Glu Thr Thr Ala Asn Asn Ile Ala Leu1 5 10 15Gly Val Val Thr Leu Leu Ala Asn Pro Gln Trp Ile Gly Asp Asp Arg20 25 30Ala Val Glu Glu Thr Leu Arg Phe His Ser Val Ala Asp Leu Val Ser35 40 45Leu Arg Val Ala Val Gln Asp Val Glu Ile Ala Gly Gln Leu Ile Lys50 55 60Ala Gly Glu Gly Ile Val Pro Leu Val Ala Ala Ala Asn His Asp Glu65 70 75 80Asn Ala Phe Glu Cys Pro His Ala Phe Asp Pro Ser Arg Ser Ala Arg85 90 95
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1.一種具有如下序列(I)的正向簡并引物和具有如下序列(II)的反向簡并引物，其與多烯-特異CYP(細胞色素P450羥化酶)編碼序列的保守區域互補；(I)5′-TGGATCGGCGACGACCGSVYCGT-3′(II)5′-CCGWASAGSAYSCCGTCGTACTT-3′在上述序列中，S代表鳥嘌呤或胞嘧啶，V代表腺嘌呤、鳥嘌呤或胞嘧啶，Y代表胸腺嘧啶或胞嘧啶，和W代表胸腺嘧啶或腺嘌呤。
2.一種檢測生產多烯化合物的細菌的方法，所述方法包含以下步驟i)加入與多烯-特異CYP編碼序列的保守區域互補的簡并引物，4種脫氧核苷酸和針對細菌基因的DNA聚合酶；和ii)檢查所述保守區域的復制。
3.根據權利要求2所述的方法，其中，所述步驟i)的簡并引物是具有如下序列(I)的正向簡并引物和具有如下序列(II)的反向簡并引物(I)5′-TGGATCGGCGACGACCGSVYCGT-3′(II)5′-CCGWASAGSAYSCCGTCGTACTT-3′在上述序列中，S代表鳥嘌呤或胞嘧啶，V代表腺嘌呤、鳥嘌呤或胞嘧啶，Y代表胸腺嘧啶或胞嘧啶，和W代表胸腺嘧啶或腺嘌呤。
4.根據權利要求2所述的方法，其中，所述步驟ii)是通過電泳過程進行的。
5.根據權利要求2所述的方法，其中，所述步驟ii)是通過PCR過程進行的，其中，采用被熒光標記的脫氧核苷酸。
全文摘要
本發明涉及用于檢測對多烯特異的細胞色素P450羥化酶的引物和利用引物檢測生產多烯的細菌菌株的方法。更具體地，本發明涉及具有如下序列(I)的正向簡并引物和具有如下序列(II)的反向簡并引物，其與存在于多烯－特異CYP(細胞色素P450羥化酶)編碼序列中的保守區域互補；(I)5′－TGGATCGGCGACGACCGSVYCGT－3′和(II)5′－CCGWASAGSAYSCCGTCGTACTT－3′，其中S代表鳥嘌呤或胞嘧啶，V代表腺嘌呤、鳥嘌呤或胞嘧啶，Y代表胸腺嘧啶或胞嘧啶，和W代表胸腺嘧啶或腺嘌呤。
文檔編號C12Q1/68GK101065496SQ200580033877
公開日2007年10月31日 申請日期2005年9月26日 優先權日2004年10月4日
發明者韓奎范, 金相允, 樸賢洙, 明智成, 樸南實, 金英秀 申請人:株式會社韓孫生物科技