專利名稱：Dna收集粘貼片及從其中分離dna的方法
技術領域：
本發明涉及一種用于DNA收集的粘貼片及用其提取DNA的方法，更具體地說，涉及一種DNA收集粘貼片及用其有效地收集DNA的方法，該粘貼片能夠在不使用血液或頭發的情況下方便地分離粘附于人皮膚的角蛋白，以便收集人的基因并使用PCR技術擴增基因，從而鑒別親生子女和調查犯罪。
背景技術：
一般來說，DNA(脫氧核糖核酸)，人體中含有遺傳信息的分子，儲存于23對人染色體中。就遺傳信息而言，DNA由編碼蛋白質的外顯子和非編碼區的內含子組成。內含子區域，尤其是ALU序列，對個體具有特定的重復結構，這取決于其遺傳譜系。正是由于這個原因，人們采用基因指紋圖譜來篩選分散于基因組的相近或相同的序列，即微衛星或VNTR(數目可變的串聯重復序列)。
目前，在從人體收集DNA方面，已經公開了使用血液或頭發的方法。然而，這些方法存在一些問題。此類技術的過程比較復雜，而且通常讓人感到不舒服。
此外，還開發了用于DNA收集的粘貼片來采集易于從人體脫落的皮膚角蛋白。由于將含有DNA的角蛋白從粘貼片的粘性成分中專門提取出來很難，常規粘貼片有問題。具體地說，當分離DNA時，粘合劑在正常情況下可與DNA凝聚，因為粘合劑的有效成分是類似DNA的聚合物。
因此，本發明人演示了通過涂上韓國專利申請第2000-74853號(以下稱為“常規發明”)中的涂劑溶液制備的粘貼片，該涂劑溶液包含EDTA(乙二胺四乙酸)、Tris和SDS(十二烷基磺酸鈉)。所得到的粘貼片可以專門從人體皮膚角蛋白收集DNA。然后，使用酚提取法從粘貼片分離DNA產物。遺憾的是，即使使用粘貼片和酚提取法，該方法也并未令人滿意地提高DNA產率(與常規方法相比)。
發明內容
技術問題為了解決上述問題，本發明人成功地提出了以下發明。本發明的一個目的是提供用于DNA收集的粘貼片，該粘貼片可提高DNA產率。
本發明的另一個目的是提供使用DNA收集粘貼片來有效地純化DNA的方法，該方法有利于方便地分離粘附于人皮膚的角蛋白，以獲得人類基因。
技術解決方案確切地說，本發明包括以下幾個步驟(1)制備粘貼片；(2)從人皮膚收集角蛋白；(3)純化DNA；(4)通過進行PCR來擴增DNA；(5)鑒別個體的多種基因和遺傳信息。
為了達到本發明的目的，在從人體收集用于分析基因的角蛋白前，貼上并揭開粘貼片，該粘貼片通過涂上包含EDTA(乙二胺四乙酸)、Tris和SDS(十二烷基磺酸鈉)和Peyonine的涂劑溶液制備。然后，將所得到的粘貼片與涂劑溶液在30～45℃下反應40～80分鐘。反應后，加入蛋白酶K并在40～68℃下反應30～100分鐘。
使用本發明的DNA收集粘貼片分離DNA的方法包括以下步驟I)在人用商品化粘貼片的一面涂上涂劑溶液，以制備DNA收集粘貼片，該涂劑溶液包含0.05～1mol EDTA(pH 8.0)、0.002～0.015mol Tris(pH 8.0)、30～40vol％SDS(約1～1.4mol)和3％Peyonine；ii)在人皮膚上貼上并揭開粘貼片，以收集人角蛋白；iii)加入蛋白沉淀劑以從所得到的角蛋白純化DNA；iv)進行PCR以擴增所得到的DNA；v)檢查PCR產物以鑒定DNA樣本中的各種基因和遺傳信息。
有利效果如上所述，根據本發明的DNA收集粘貼片及用其收集DNA的方法，其優點是能夠在不使用血液或頭發的情況下容易地分離粘附于人皮膚的角蛋白。進一步地，本發明能夠方便地分離人類基因并使用PCR技術擴增基因。所以，本發明可達到鑒別親生子女、調查罪犯等效果。因此，DNA收集粘貼片及用其收集DNA的方法可以在遺傳工程領域進行工業應用。
通過下面結合附圖進行的詳細描述將更清楚地理解本發明的上述和其它目的、特點和其它優點。所附圖形包括圖1顯示了從粘貼片中分離DNA的過程的示意圖。
圖2對比顯示了從本發明的粘貼片和常規粘貼片制備DNA的PCR產物的產率。
圖3對比顯示了從本發明的粘貼片使用蛋白質沉淀劑分離DNA制備的PCR產物和通過酚提取分離DNA制備的PCR產物。
具體實施例方式
下面根據以下步驟更清楚地說明本發明。
步驟1制備DNA收集粘貼片本發明所使用的粘貼片是含有無毒粘性成分的人用產品，可以在市場上買到。這種商品化的粘貼片通過在含有粘合劑的一面涂上包含EDTA(乙二胺四乙酸)、Tris和SDS(十二烷基磺酸鈉)和Peyonine的涂劑溶液來制作DNA收集粘貼片。
應適當調整涂劑劑量。如果過高，DNA收集粘貼片將很難貼在人體上。相反，如果過低，將很難從粘合劑中分離人角蛋白。優選地，用70～85％(更優選75％)的涂劑溶液覆蓋貼面。也應適當地控制涂劑的厚度以便粘合劑與人體接觸。優選地，涂布劑厚度小于3mm。
在涂劑溶液中，EDTA起除去鎂離子和弱化細胞膜的作用，因為鎂是維持細胞膜全部結構所必需的，并且進一步地通過抑制細胞內酶來幫助收集完整的DNA。此外，Tris，一種緩沖系統，無毒、便宜并適合反復使用。SDS，一種清潔劑，通過除去脂類分子來幫助細胞溶解，并且引起細胞膜離解。為了制備正常發揮作用的涂劑溶液，將0.05～1mol EDTA(pH 8.0)和5～15mol Tris(pH 8.0)與3％Peyonine和SDS混合，并通過加入蒸餾水將其調整至30～40vol％，總體積7,000～8,000ml。優選地，0.1mol EDTA和10mol Tris與3％Peyonine和SDS混合，并通過加入蒸餾水調整至37.5vol％，總體積7,500ml。
步驟2收集人角蛋白上面制備的本發明的粘貼片可貼在人體任意區域。優選地，粘貼片可應用于角質區，例如肘、腋、臂、踝和面部。本發明的粘貼片不受持續時間的影響。貼上后，本發明的粘貼片可以立即收集適量的樣本。
步驟3純化DNA從上面制備的粘貼片，可收集人角蛋白，然后如下純化DNA。
(i)首先，從粘貼片剪下合適大小的粘附部分(約4cm×6cm)并浸入具有與涂劑溶液相同的組分和比例的DNA提取液中。該組分和比例有助于粘貼片的粘性成分和所收集的人角蛋白之間的離解。因此，涂劑溶液容易溶入DNA提取液。
所得到的涂劑溶液在浸入狀態下于30℃～45℃(優選30℃)孵育40～80分鐘，更優選地，于37℃下孵育60分鐘。如果在低于30℃的溫度下孵育，涂劑溶液的溶解率將下降。由于DNA提取液和涂劑溶液的活性較低，粘貼片的粘性成分和所收集的人角蛋白之間的涂劑溶液回收較少。結果，DNA的回收率下降至低于60％，因而無法完成進一步的分析。相反，如果在超過45℃的溫度下孵育，粘性成分、聚合物物質可能從粘貼片溶解到DNA提取液中，并且會降低DNA提取液和涂劑溶液的活性。結果，與人角蛋白相比較，粘性成分的回收率顯著增加，因而無法完成進一步的DNA分析和PCR擴增。
同時，如果孵育少于40分鐘，會由于溶解時間太短而不能完全分離粘貼片的粘性成分和人角蛋白。進一步的DNA分析和PCR擴增可能難于完成。如果孵育超過80分鐘，粘貼片的粘性成分將在DNA純化的最終乙醇提取階段一起離解。進一步的DNA分析可能難于完成。因此，孵育應在合適的條件下進行。
(ii)孵育后，加入蛋白酶K(一種蛋白降解酶)以除去蛋白質。此時，于40～68℃下蛋白酶反應30～100分鐘，優選地，于5℃下反應90分鐘。如果反應超過100分鐘，則由于從皮膚一起分離后DNA酶的作用，DNA的回收量將下降。如果反應少于30分鐘，則蛋白質沒有充分除去。相反，如果反應低于40℃或高于68℃，蛋白酶K(其為對溫度敏感的蛋白質降解酶)的活性將下降，。從人體收集的角蛋白仍將凝聚。此外，DNA的回收率下降。尤其是，如果在超過68℃的溫度下進行反應，上面分離的DNA將變性。
(iii)加入所得到的溶液一半體積的蛋白質沉淀溶液，并離心沉淀蛋白質。用吸液管來分離位于上清液的水層。之后，向產物中加入相同體積的異丙醇并再次離心獲得DNA樣本。然后，在存在諸如鈉離子之類的鹽的情況下向所得到的樣本中倒入相同體積的70％乙醇，并在-20℃的溫度下離心沉淀DNA(DNA濃縮液)。
步驟4通過PCR(聚合酶鏈反應)擴增DNA所得到的DNA用70％乙醇沖洗，然后干燥并溶于TE緩沖液中。通過進行PCR(聚合酶鏈反應)可在短時間內擴增純化的DNA。通過進行PCR也可擴增從粘著劑收集的DNA。通過此過程，甚至經過2～3個PCR循環就可以產生足夠量的DNA。
步驟5鑒定個體的多種基因和遺傳信息上面制備的DNA樣本可應用于篩選個體的多種基因和遺傳信息。此外，遺傳特征可用于鑒別親生子女或調查犯罪嫌疑人。除了篩選此類指紋圖譜外，通過此過程收集的DNA還可用于篩選遺傳疾病。具體地說，可以借助利用DNA分子間雜交原理的Southern印跡和DNA芯片技術來鑒定個體的多種基因和遺傳信息。
如上所述，DNA收集粘貼片及用其收集DNA的方法能夠在不使用血液或頭發的情況下容易地分離粘附于人皮膚的角蛋白，并且進一步方便地分離人類基因并使用PCR技術擴增基因。所以，本發明可達到鑒別親生子女、調查罪犯等效果。
也就是說，特定的DNA收集粘貼片貼在皮膚上并撕開，然后應用于有效地分離DNA，這有助于鑒定個人遺傳信息。
示例本發明實用和現在優選的實施例將通過以下示例來說明。
然而，本領域的技術人員應了解，可以在本發明的主旨和范圍內對其進行修改和改進。
<示例1>制備粘貼片和收集人角蛋白為了制備涂劑溶液，將0.1mol EDTA(pH 8.0)和10mol Tris(pH 8.0)與3％Peyonine和SDS混合，并調整至30～40vol％。然后，通過加入蒸餾水調整最終體積至7,500ml。將所得到的溶液涂于人用粘貼片的一面，并以2mm的厚度覆蓋75％的側面積，該粘貼片含有對人體無毒的粘性成分。
將涂有上述物質的粘貼片貼于手掌，10分鐘后再撕開。
<示例2>純化來自粘附于粘貼片的人角蛋白的DNA示例1中制備的粘貼片剪成4cm×6cm的方形，浸于具有與示例1相同的組分和比例的涂劑溶液，并于37℃反應60分鐘。之后，加入蛋白酶K(一種蛋白降解酶)，并于65℃孵育90分鐘。
然后，加入所得到的溶液一半體積的蛋白質沉淀溶液，并離心除去蛋白質。僅用吸液管來分離位于上清液的水層。之后，向產物中加入相同體積的異丙醇并再次離心獲得DNA樣本。然后，在存在諸如鈉離子之類的鹽的情況下向所得到的樣本中倒入相同體積的70％乙醇，并在-20℃的溫度下離心沉淀DNA(DNA濃縮液)。
<試驗示例1>檢驗在各種條件下DNA的量根據粘合劑的組分、孵育的溫度和時間以及蛋白酶K的反應溫度和時間，分析了各種條件下示例1和2中制備的粘貼片。
<表1>
來自人體的DNA量(根據粘貼片中粘合劑的組分)。
*利用紫外吸收測定DNA量。作為參考，如果在260nm處吸收度為1，則雙鏈DNA的濃度估計為50μg/ml。
<表2>
來自人體的DNA量(根據粘貼片中的孵育溫度)
*利用紫外吸收測定DNA量。作為參考，如果在260nm處吸收度為1，則雙鏈DNA的濃度估計為50μg/ml。
<表3>
來自人體的DNA量(根據粘貼片中的孵育時間)
*利用紫外吸收測定DNA量。作為參考，如果在260nm處吸收度為1，則雙鏈DNA的濃度估計為50μg/ml。
<表4>
來自人體的DNA量(根據蛋白酶K的反應時間，涂劑溶液的組分與示例1和2相同)
*利用紫外吸收測定DNA量。作為參考，如果在260nm處吸收度為1，則雙鏈DNA的濃度估計為50μg/ml。
<表5>
來自人體的DNA量(根據蛋白酶K的反應溫度，涂劑溶液的組分與示例1和2相同)
*利用紫外吸收測定DNA量。作為參考，如果在260nm處吸收度為1，則雙鏈DNA的濃度估計為50μg/ml。
<試驗示例2>本發明的粘貼片和常規粘貼片中人類DNA的產率比較為了比較示例中制備的粘貼片和常規粘貼片的DNA產率，利用ApoE基因和IL-4基因進行PCR。
i)擴增ApoE基因的引物序列描述如下正向5’-tcggccgcagggcgctgatggac-3’反向5’-cccaggcgctcgcggatggcgc-3’在下列條件下進行PCR95℃，5分鐘；95℃，20秒，70℃，1分鐘，40個循環，72℃，1分鐘；72℃，5分鐘。
ii)擴增IL-4基因的引物序列描述如下正向5’-gacccaaactaggcct-3’反向5’-cagtcctcctggggaaagat-3’在下列條件下進行PCR95℃，5分鐘；95℃，30秒，62℃，30秒，40個循環，72℃，1分鐘；72℃，5分鐘如圖2所示，使用常規粘貼片和不同組分的本發明的粘貼片來提取8個目標人的DNA。然后，通過進行PCR來擴增ApoE和IL-4基因。結果，經鑒定在本發明的粘貼片中兩者的數據均有提高。
<試驗示例3>DNA產率的比較(根據從粘貼片分離DNA的方法)為了比較根據分離DNA的方法在示例中制備的粘貼片的DNA產率，利用ST基因和DRD2基因進行PCR。
i)擴增ST基因的引物序列描述如下正向5’-ggcgttgccgctctgaatgc-3’反向5’-gagggactgagctggacaaccac-3’在下列條件下進行PCR95℃，5分鐘；95℃，20秒，60℃，40秒，40個循環，72℃，1分鐘；72℃，5分鐘ii)擴增DRD2基因的引物序列描述如下正向5’-gatgatacccacttcaggaag-3反向5’-gatgtgtaggaattagccagg-3’在下列條件下進行PCR95℃，5分鐘；95℃，20秒，60℃，40秒，40個循環，72℃，1分鐘；72℃，5分鐘如圖3所示，比較了5個目標人的DNA產率(根據本發明通過傳統酚提取使用蛋白沉淀溶液來提取DNA)。通過進行PCR來擴增ST和DRD2基因。結果，當使用本發明的提取方法時，可確信兩者的數據均有提高。
工業適用性所述DNA收集粘貼片及用其收集DNA的方法，其優點是能夠在不使用血液或頭發的情況下容易地分離粘附于人皮膚的角蛋白。進一步地，本發明能夠方便地分離人類基因并使用PCR技術擴增基因。所以，本發明可達到鑒別親生子女、調查罪犯等效果。因此，DNA收集粘貼片及用其收集DNA的方法可以在遺傳工程領域進行工業應用。
本領域的技術人員應了解，以上面的描述中公開的具體實施例為基礎，可以很容易地修改或設計其它實施例來達到本發明的相同目的。
本領域的技術人員也應了解，等同的實施例并未脫離本發明的主旨和范圍，如所附權利要求書所述。
權利要求
1.一種用于DNA收集的粘貼片，其一面涂有涂劑溶液，該涂劑溶液包含0.05～1mol EDTA(pH 8.0)、0.002～0.015mol Tris(pH 8.0)、30～40vol％SDS(約1～1.4mol)和3％Peyonine。
2.一種使用DNA收集粘貼片收集DNA的方法，其包括附加步驟(1)使用權利要求1中的DNA收集粘貼片從人體獲得皮膚角蛋白；(2)用蛋白酶K消化，以從粘貼片分離DNA；然后(3)加入所得到的溶液一半體積的試劑，以沉淀蛋白質。
全文摘要
本發明涉及一種用于DNA收集的粘貼片及用其分離DNA的方法。具體地說，所述DNA收集粘貼片涂有包含EDTA、Tris、SDS和Peyonine的涂劑溶液，當貼在人皮膚上并揭開時，可以專門分離角蛋白。進一步地，特定的DNA收集粘貼片可以有效地分離DNA，以便使用PCR技術擴增基因。因此，本發明可應用于通過指紋圖譜鑒別親生子女和調查犯罪以及篩選遺傳疾病。
文檔編號C12Q1/68GK101065500SQ200580039972
公開日2007年10月31日 申請日期2005年10月5日 優先權日2005年10月5日
發明者柳在松, 劉容佶 申請人:遺傳子銀行株式會社