專利名稱：具有毛囊誘導潛能的真皮乳頭組織的制備方法
技術領域：
本發明涉及一種制備具有毛囊誘導潛能的真皮乳頭組織的方法，該方法包括以下步驟將從本領域中已知的原代培養基中的毛囊分離的真皮乳頭和下真皮鞘細胞增殖，并且在補充有高濃度的氨基酸、維生素和生長因子的繼代培養基中培養增殖的細胞。
背景技術：
據認為，脫發(光禿)是遺傳的，并且發生于當毛囊開始緩慢地產生更細和更短的毛發，或完全停止產生毛發的時候。脫發有許多種形式，從斑禿至雄激素性脫發，也已知為男性或女性型禿發。
在過去，脫發典型地是通過將合成的或人造的頭發植入頭皮的毛囊根球(boot bulbs)的各種方法來治療的，但是這樣的人造頭發植入的方法幾乎總是無效，經常導致患者健康問題和進一步的自然毛囊損失。當前，已經采用了兩種治療脫發的方法藥物治療和人發移植。藥物治療可以增進頭發生長并且阻止將來的頭發損失，但是在長期使用以后停止藥物治療，它就與例如皮膚刺激和加速頭發損失相聯系。另一方面，人發移植包括從頭發生長區獲得自然頭發，并且將它們移植至光禿區。移植的頭發作為完整的發囊而安置于移植區，并且成為了可以經歷正常生長周期的永久性頭發。然而，可以移植的頭發數目非常有限，并且假設每一個手術移植2,000根頭發，那么進行超過三次這樣的手術似乎并不可能。此外，它是一個繁重和昂貴的過程，需要熟練醫師的專門技術，以及患者的動機和忍受力。這個治療通常不對具有雄激素性脫發的女性施用，因為該頭發的損失過于彌散。
因而，當前所采用的用于治療脫發的方法具有眾多的局限性，因此，已經報道了許多通過體外培養毛囊形成細胞并且移植它們，以克服這樣的問題的研究。
Arase等已經公開，當拔出的囊與分離的真皮乳頭細胞一起在體外培養時，毛囊細胞移向真皮乳頭，并且形成新的毛球(Arase S.et al.，SkinPharmacol.7(1-2)12-5，1994)，這暗示了毛囊的形成和維持是通過外根鞘(ORS)細胞和真皮乳頭細胞之間的復雜和緊密的相互作用而實現的，并且如果這樣的相互作用可以再現，那么就有可能重構毛囊。此外，Cohen和Oliver已經表明，真皮乳頭細胞在毛囊的生長中扮演著關鍵性的角色(Cohen J.，J Embryol Exp Morphol.9117-27，1961；Oliver RF.，J Embryol ExpMorphol.15(3)331-47，1966；和Oliver RF.，J Embryol Exp Morphol.18(1)43-51，1967)。
Reynold等報道，當將真皮乳頭細胞分離并且體外培養時，在約3至4個傳代數以后，真皮乳頭細胞逐漸地失去它們的先天毛囊誘導潛能(Reynolds AJ et al.，Development.122(10)3085-94，1996)，同時Inamatsu等發現，當在上皮細胞的廢培養基中培養大鼠的毛囊真皮形成細胞時，該真皮乳頭細胞保持它們的毛囊誘導的能力(Inamatsu M.et al.，J InvestDermatol.111(5)767-75，1998)。
Jahoda和Reynolds等報道，作為將大鼠觸須毛(vibrissa hair)的真皮乳頭細胞分離和培養，以及將等于或少于3個傳代數的培養的細胞植入大鼠的小耳皮膚傷口(small ear skin wound)和背部的結果，從移植面反常地出現了顯示觸須毛型的特征的大毛纖維(large hair fibers)(Jahoda CA.，Development.115(4)1103-9，1992；和Reynolds AJ.等，Development.115(2)587-93，1992)，并且Gharzi等已經公開，當在與真實皮膚類似的膠原凝膠基質中培養大鼠觸須毛的外根鞘和下真皮鞘時，在這兩個細胞層之間插入真實真皮乳頭，并且將它移植在大鼠的背部，就可以誘導真皮乳頭的形成(Gharzi A.et al.，Exp Dermatol.12(2)126-36，2003)。此外，Kevin等已經證實，包圍真皮乳頭的下真皮鞘細胞和真皮乳頭細胞都具有毛囊誘導能力(Kevin J.et al.，J Invest Dermatol.1211267-1275，2003)。最近，下真皮鞘細胞已經活躍地應用于毛囊的形成研究中。
本發明者開發了一種真皮乳頭組織體外重構(re-constitution)的有效方法，該組織對于毛囊的生長和維持至關重要，該方法包括以下步驟在本領域中公知的原代培養基中增殖從毛囊分離，具有毛囊誘導潛能的真皮乳頭和下真皮鞘細胞，并且在包含高濃度的氨基酸、維生素和生長因子的繼代培養基中，培養增殖的細胞。本發明方法使不采用任何基質或基底，通過細胞的自聚集(auto-aggregation)而形成一些真皮乳頭組織成為可能。
發明概述因此，本發明的一個目的就是提供一種真皮乳頭組織體外制備方法，該方法以不采用任何基質或基底，通過細胞自聚集而形成一些真皮乳頭組織為目的。
根據本發明的一個方面，所提供的制備真皮乳頭組織的方法包括以下步驟1)從毛囊分離真皮乳頭和下真皮鞘細胞；2)在原代培養基中培養分離的細胞一直到5至6個傳代數，該原代培養基包含600至1,900mg/l的氨基酸和12至36mg/l的維生素；3)在包含2,000至3,000mg/l的氨基酸和40至60mg/l的維生素的繼代培養基中，通過培養在步驟(2)中所獲得的細胞，而誘導該細胞的自聚集，其中該繼代培養基不含血清，并且補充有0.1至10,000ng/ml的生長因子；并且4)通過離心來收獲在步驟(3)中獲得的自聚集的細胞，并且在步驟(3)的培養基中培養它們。
附圖簡述結合附圖，本發明的以上和其它目的和特征就會從本發明的以下描述而變得顯而易見。該附圖分別地表示為
圖1毛囊的結構；圖2從哺乳動物的皮膚分離在生長階段完全成熟的毛囊的過程；圖3從分離的毛囊分離真皮乳頭和下真皮鞘細胞，并且在原代培養基中培養它們的過程；圖4當連續傳代培養時，原代培養的真皮乳頭和下真皮鞘細胞的照片；圖5照片表示通過誘導培養的真皮乳頭細胞的自聚集，而形成細胞聚集體的過程，其中A表示在培養皿中90％或更多的培養的毛囊真皮形成細胞(真皮乳頭和下真皮鞘)；B，在采用用于聚集的培養基置換培養基以后，超過3個月的所培養的細胞；C，通過自聚集的細胞聚集體形成的初始階段；D，在聚集幾乎結束以后，在從培養皿分離以懸浮于培養基中之前，聚集的細胞；E，同時形成于培養皿內部幾個位置的多個細胞聚集體；和F，通過蘇木精/曙紅組織染色的一部分細胞聚集體；圖6用于觀察在比較例1和測試例2中，毛球和毛囊之間相互作用的程序；圖7照片表示當沒有真皮乳頭的毛囊和毛球在膠原凝膠基質中相隔一段距離而共培養時，通過這兩個組織之間的相互作用而體外形成新的毛球結構的過程；和圖8照片表示對毛囊真皮形成細胞進行培養，以及通過誘導細胞自聚集而制備的組織(箭的頭部)與沒有毛球的毛囊(箭頭)共培養6天以后，新的毛球(箭頭)的體外形成過程。
發明詳述在培養毛囊的真皮乳頭和下真皮鞘細胞中，本發明的制備方法的特征在于，在包含600至1,900mg/l的氨基酸和12至36mg/l的維生素的常規培養基(原代培養基)中培養真皮乳頭和下真皮鞘細胞，并且在高濃度的不含血清的培養基(繼代培養基)中，培養原代培養的細胞，該繼代培養基包含有2,000至3,000mg/l的氨基酸和40至60mg/l的維生素，并補充了0.1至10,000ng/ml的生長因子。
本發明的繼代培養基與常規培養基的不同之處在于1)它不包含任何血清；2)它包含了2至5倍更高濃度的氨基酸和維生素；和3)它進一步包含毛囊生長和維持所需的生長因子。
在本發明的方法中，真皮乳頭和下真皮鞘細胞是從完全生長的毛囊分離，并且在根據本領域中常規方法的普通細胞培養基中進行原代培養的。用于本發明中的原代培養的細胞培養基可以選自，但不局限于，由DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)、DMEM/F-12、F-12、McCoy’s5A、RPMI1640、Williams’medium E、IMDM(Iscove’s Modified Dulbecco’sMedium)等所組成的組。該真皮形成細胞(真皮乳頭和下真皮鞘細胞)能夠通過一系列原代培養一直到5至6個傳代數而增殖，直至該細胞被判定已經失去了發囊誘導能力為止。然后將原代培養的細胞在繼代培養基中培養，該培養基是包含比普通培養基高2至5倍濃度的氨基酸和維生素，以及補充的生長因子，而不采用任何基質或基底的高濃度培養基。其結果是，約80％這樣制備的單層培養細胞形成了能夠再生真皮形成細胞的特征的自聚集體(auto-aggregate)。例如，如果在25cm2的培養皿中接種1×106個細胞，就會形成數百個自聚集體。
由于本發明中所采用的繼代培養基包含比以上普通培養基高2至5倍的氨基酸和維生素，就能夠克服在真皮乳頭和下真皮鞘細胞的培養過程中損耗養分和氧的問題，改善細胞的分化特征，這會導致幫助真皮乳頭組織的形成。
優選地，根據本發明的繼代培養基包含如下的高濃度的氨基酸30至200mg/l以下中的每一種L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-胱氨酸·2HCl、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、和L-賴氨酸；30至210mg/l以下中的每一種L-苯丙氨酸、L-色氨酸和L-酪氨酸；和50至600mg/l以下中的每一種其余的必需氨基酸。
此外，本發明的繼代培養基優選包含如下高濃度的維生素0.02至1mg/l以下中的每一種生物素、D-泛酸鈣和作為可溶性維生素B的核黃素；3至16mg/l以下中的每一種氯化膽堿、葉酸、煙酰胺、吡哆醇·HCl和硫胺素·HCl；10至15mg/l的i-肌醇；和0.02至0.03mg/l的維生素B12。更優選地，本發明的培養基進一步包含0.03至0.07mg/l的谷胱甘肽，400至600mg/l的谷氨酰胺，和1,500至3,000mg/l的D-葡萄糖。
此外，更優選地，本發明的繼代培養基包含3,000至3,500mg/l的碳酸氫鈉(NaHCO3)和2,000至2,500mg/l的具有pH緩沖效應的HEPES(N-[2-羥乙基]哌嗪-N′-[2-乙磺酸])；1.0至2.0mM的Ca和0.5至1.0mM的Mg，它們是細胞-細胞黏著必需的微量元素；0.25至0.7nM的以下中的每一種細胞代謝必需的微量元素Cu、Fe、Mn、和Zn；和4,000至5,000mg/l的氯化鈉，以調節滲透壓在280至310mOsm/kg。
此外，為了延長毛囊培養時期的目的，本發明的繼代培養基進一步包含氫化可的松(HC)、胰島素(I)、鐵傳遞蛋白(T)和亞硒酸鈉(S)。例如，繼代培養基優選包括10至100μg/l的氫化可的松，5至20mg/l的胰島素，5至20mg/l的鐵傳遞蛋白，和0.005至0.02mg/l的亞硒酸鈉。
特別地，所采用的繼代培養基優選包含165mg/l的CaCl2、0.0001mg/l的CuSO4·5H2O、0.0001mg/l的Fe(NO3)·9H2O、330mg/l的KCl、0.076mg/l的KNO3、98mg/l的MgSO4、0.0001mg/l的MnCl2·4H2O、4,800mg/l的NaCl、3,360mg/l的NaHCO3、111mg/l的Na2HPO4、0.0002mg/l的ZnSO4·7H2O、2,000mg/l的D-葡萄糖、110mg/l的丙酮酸鈉、2,383mg/l的HEPES、15mg/l的酚紅、50mg/l的L-丙氨酸、100mg/l的L-精氨酸、50mg/l的L-天冬酰胺、60mg/l的L-天冬氨酸、182.4mg/l的L-胱氨酸·2HCl、150mg/l的L-谷氨酸、584mg/l的L-谷氨酰胺、60mg/l的L-甘氨酸、62.1mg/l的L-組氨酸、210mg/l的異亮氨酸、210mg/l的L-亮氨酸、292mg/l的L-賴氨酸·HCl、60mg/l的L-蛋氨酸、132mg/l的L-苯丙氨酸、80mg/l的L-脯氨酸、84mg/l的L-絲氨酸、190mg/l的L-蘇氨酸、32mg/l的L-色氨酸、208mg/l的L-酪氨酸、188mg/l的L-纈氨酸、0.026mg/l的生物素、0.026mg/l的D-泛酸鈣、8mg/l的氯化膽堿、16mg/l的葉酸、14.40mg/l的i-肌醇、8mg/l的煙酰胺、8mg/l的吡哆醇·HCl、0.8mg/l的核黃素、3mg/l的硫胺素·HCl和0.026mg/l的維生素B12。
本發明中所采用的繼代培養基優選包含比本領域中常規培養基高2倍濃度的氨基酸和維生素，用以為細胞代謝和維持細胞活性提供能量。代謝為乳酸，并且作為能量源而扮演較不重要角色的D-葡萄糖更低。影響ATP合成量的繼代培養基中L-谷氨酰胺的濃度固定為4mM。此外，該繼代培養基包含作為微量元素的0.7nM的鋅、0.25nM的鐵、0.4nM的銅，和0.5nM的錳，并且分別包含濃度為40mM和10mM的具有pH緩沖能力的碳酸氫鈉和HEPES。本發明的繼代培養基包含鈣和鎂作為胞間粘附必需的礦物質，終濃度分別為1.5nM和0.8nM，并且還包含4,500mg/l的氯化鈉，以調節滲透壓至從280至310mOsm/kg的范圍。
此外，本發明的繼代培養基進一步包含作為鐵源的10mg/l的鐵傳遞蛋白；作為無機鹽的0.01mg/l的亞硒酸鈉；作為激素的10μg/l的氫化可的松，10mg/l的胰島素和0.2重量％的清蛋白；和0.1至10,000ng/ml的生長因子。本發明中可以采用的生長因子可以包括，但是不局限于肝細胞生長因子(HGF)、血管內皮生長因子(VEGF)、血小板衍生生長因子(PDGF)、骨形態發生蛋白(BMP)等。更優選地，該繼代培養基包含作為生長因子的20ng/ml的HGF。
如果采用包含培養基的血清用于毛囊器官的培養，毛囊的初始生長速率快，但是它趨向于早退化并且受傳染(Randall VA.et al.，J InvestigDermatol Symp Proc.8(1)39-45，2003)。然而，由于本發明的繼代培養基不包含任何血清，就沒有感染的危險，并且因此，它能夠有效地用作培養和儲藏毛囊器官的培養基。
此外，通過重碳酸鹽和代謝物之間的緩沖相互作用，本發明的繼代培養基能夠維持不變的pH，這對于細胞培養是重要的因素。也就是，由于本發明的繼代培養基具有比普通培養基，例如Williams’medium E，更高的氨基酸濃度，隨著氨基酸的最終代謝物氨的濃度的增加，就有可能增加pH。但是，作為緩沖劑而加入的重碳酸鹽將培養基的pH維持在7.2至7.5的范圍。
在本發明的繼代培養基中的硫酸銅，通過毛囊中所存在的銅依賴性酶—過氧化物歧化酶(SOD)和抗氧化劑的作用，抑制了由于自由基離子而導致的凋亡，并且通過其它銅依賴性酶的作用而抑制了5α-還原酶-1和2，從而刺激了天然生長因子和胞外基質的合成。此外，鋅是用于鋅指轉錄因子活化的重要無機成分。
根據本發明制備的真皮乳頭自聚集體具有的尺寸(約100-200μm)類似于天然真皮乳頭的尺寸，并且由于它是采用天然細胞粘接來制備的，因此表現了強的直接細胞-細胞相互作用。此外，對具有蘇木精/曙紅的聚集體部分的組織學觀察表明，細胞是緊密聚集的。特別是，由于該聚集體不需要任何外部刺激或用于細胞附著和增殖的基質，它能夠大量生產。更多制備的這樣的聚集體表現了高的毛囊誘導能力，這可以通過細胞移植有效用于治療脫發和對毛囊特征的體外研究。
以下實施例意欲進一步說明本發明，而不限制它的范圍。
制備例1繼代培養基的制備根據表1a至1d中所述的以下組成，制備1升的包含比現有普通培養基更高濃度的氨基酸和維生素的培養基，并且向其中加入10mg/l的胰島素，10mg/l的鐵傳遞蛋白，0.01mg/l的亞硒酸鈉，10μg/l的氫化可的松和0.2重量％的清蛋白(2g/l)，以制備繼代培養基。
表1a
表1b
表1c
表1e
實施例1毛囊的分離毛囊是通過外科手術從Sprague-Dawley大鼠的觸須毛上獲得的。該分離的觸須毛是在裝有用于毛囊的普通培養基Williams’medium E(GibcoBRL，N.Y.，U.S.A.)的管中儲藏的。在將包含毛囊的皮膚經包含青霉素G(10個單元/ml)、鏈霉素(10μg/ml)和兩性霉素(25μg/ml)的PBS溶液清洗以后，采用刀將外部脂肪和真皮組織除去，以分離毛囊。具有最大生長期毛的毛囊是利用光學顯微鏡而選自分離的毛囊。此時，在毛囊的生長周期上的判斷是通過觀察毛球的結構來決定的。外部脂肪和真皮組織是采用1cc注射器的針，通過顯微操縱來從分離的生長期毛囊上除去的，以僅僅分離完全的生長毛囊(圖2)。
實施例2真皮乳頭和下真皮鞘細胞的分離和原代培養為了便于真皮乳頭組織的附著，將400μl的胎牛血清(FBS)加入35mm的細胞培養皿中，并且該皿的底部隨其均勻地濕潤。隨后，當通過光學顯微鏡觀察到毛球組織出現在分離的毛囊的更低部位時，采用注射器針從那里將組織中的真皮乳頭分離，并且將包圍真皮乳頭的下真皮鞘分離。將每個分離的真皮乳頭和下真皮鞘放置在由FBS潤濕的培養皿上，并且在37℃培養箱中保藏。當每個分離的組織附著于培養皿的底部時，往那里加入作為原代培養基的DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle Medium；GibcoBRL)。此時，為了增強組織附著性的目的，通過考慮最初添加的FBS的量而將FBS的最終濃度調節至20％。將培養基仔細地加入培養皿中，并且不以新鮮的來置換，直至細胞從組織流出為止。當細胞開始流出時，用補充了10％FBS的DMEM來置換培養基(圖3)。
實施例3真皮乳頭組織的制備在補充了10％FBS的DMEM中，將原代培養真皮乳頭和下真皮鞘細胞連續培養(圖4)。當培養細胞一直到超過5至6個傳代數，以至于真皮乳頭和下真皮鞘細胞幾乎失去它們的毛囊誘導能力時，將細胞進行單層培養，直至細胞達到培養皿約90％為止(圖5的A)。在此以后，為了誘導細胞聚集的分化，采用在制備實施例1中制備的不含血清的高濃度培養基的繼代培養基，置換該培養基，并且往那里添加20ng/ml的HGF(rhHGF，R&D system)(圖5的B)。該培養基以約5天間隔而被新鮮的置換。從培養以后約4個星期開始出現細胞聚集(圖5的C)，并且完全聚集的細胞團自然地從培養皿懸浮進入培養基(圖5的D和E)。從開始懸浮細胞聚集體的點，每次置換培養基，就將廢培養基從在前的培養物收集并且在500rpm離心3min，以回收細胞聚集體。將細胞聚集體再懸浮于新鮮的培養基中并且保藏在培養容器中，以維持它們的培養狀態，直至它們在隨后的實驗中使用為止。
如由圖5的D和E可知，根據本發明的方法所制備的真皮乳頭自聚集體與自然的真皮乳頭在尺寸上相類似(約100-200μm)，并且表現了強的直接胞間相互作用。
測試例1真皮乳頭組織的可凝集性的證實為了證實根據實施例1至3中所述方法而制備的真皮乳頭組織的可凝集性，通過蘇木精/曙紅組織染色方法來觀察它的接觸部分(contactsection)。
結果，如圖5的F中所示，發現細胞微小地聚集，并且這樣形成的聚集體表現了高的密實性，不易通過外部刺激而被破壞。
比較例1采用天然真皮乳頭組織的毛囊的形成如圖6中所述，將24孔板的每個孔盛放約700μl的膠原溶液，并且在37℃培養箱保藏1hr，以誘導凝膠化。將在實施例2中制備的真皮乳頭和沒有毛球的毛囊保持300μm的間隔而放置于膠原凝膠上，并且培養5至10分鐘，以附著在凝膠表面。在再次將700μl的膠原溶液傾注在其上并且進行凝膠化以后，將K-SFM培養基(Gibco BRL，N.Y.，U.S.A.)往那里加入。在此以后約1星期，外根鞘細胞受誘發并且包圍真皮乳頭。據觀察，在約15天以后，外根鞘細胞數目增加至足以形成毛球結構(圖7)。
比較例2采用人造真皮乳頭組織的毛囊的形成為了證實是否實施例3中所制備的真皮乳頭組織能夠事實上誘導毛囊的形成，根據與比較例1中所述的相同方法來進行該實驗，不同在于，采用實施例3的真皮乳頭組織來代替自然真皮乳頭組織。
結果，據觀察，由于本發明中所制備的真皮乳頭組織和沒有毛球的毛囊細胞之間的相互作用，細胞開始從毛囊流出并且在約1星期以后，形成了新的毛球狀結構(圖8)。
因此，據發現，根據本發明所制備的真皮乳頭組織具有與自然真皮乳頭組織相同的毛囊誘導能力。
雖然關于以上具體實施方案而描述了的本發明，應當認識到的是，本領域中的技術人員可以對本發明進行不同的更改和變化，該更改和變化也落入通過所附權利要求所定義的本發明的范圍內。
權利要求
1.一種真皮乳頭組織的制備方法，所述方法包括以下步驟1)從毛囊分離真皮乳頭和下真皮鞘細胞；2)在包含600至1,900mg/l的氨基酸和12至36mg/l的維生素的原代培養基中培養所述分離的細胞；和3)通過在包含2,000至3,000mg/l的氨基酸和40至60mg/l的維生素的繼代培養基中培養在步驟(2)中所獲得的細胞，來誘導所述細胞的自聚集，其中所述培養基不含血清并且補充有0.1至10,000ng/ml的生長因子。
2.權利要求1的方法，該方法進一步包含收獲在步驟(3)中所獲得的自聚集細胞和在步驟(3)的培養基中培養它們的步驟。
3.權利要求1的方法，其中步驟(2)中的原代培養基選自由DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)、DMEM/F-12、F-12、McCoy’s 5A、RPMI 1640、Williams’medium E和IMDM(Iscove’s Modified Dulbecco’sMedium)培養基所組成的組。
4.權利要求1的方法，其中將所述細胞在步驟(2)中培養，一直到5至6個傳代數。
5.權利要求1的方法，其中步驟(3)中的所述生長因子選自由肝細胞生長因子(HGF)、血管內皮生長因子(VEGF)、血小板衍生生長因子(PDGF)、骨形態發生蛋白(BMP)所組成的組。
6.權利要求1的方法，其中步驟(3)中的所述繼代培養基包含30至200mg/l以下中的每一種L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬胺酸、L-胱氨酸·2HCl、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、和L-賴氨酸；30至210mg/l以下中的每一種L-苯丙氨酸、L-色氨酸和L-酪氨酸；50至600mg/l以下中的每一種L-丙氨酸、L-谷氨酸、L-甘氨酸、L-組氨酸、L-蛋氨酸、L-脯氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、和L-纈氨酸；0.01至2mg/l以下中的每一種生物素、D-泛酸鈣和核黃素；3至16mg/l以下中的每一種氯化膽堿、葉酸、煙酰胺、吡哆醇·HCl和硫胺素·HCl；10至15mg/l的i-肌醇；0.02至0.03mg/l的維生素B12；400至600mg/l的谷氨酰胺；1,500至3,000mg/l的D-葡萄糖，3,000至3,500mg/l的碳酸氫鈉(NaHCO3)；2,000至2,500mg/l的HEPES(N-[2-羥乙基]哌嗪-N’-[2-乙磺酸])；1.0至2.0mM的Ca；0.5至1.0mM的Mg；0.25至0.7nM以下中的每一種Cu、Fe、Mn和Zn；4,000至5,000mg/l的氯化鈉和0.1至10,000ng/ml的HGF。
7.權利要求1的方法，其中步驟(3)中的繼代培養基進一步包含氫化可的松、胰島素、鐵傳遞蛋白、亞硒酸鈉和清蛋白。
8.權利要求1的方法，其中所述真皮乳頭組織是由真皮乳頭和下真皮鞘細胞所組成的聚集體。
9.通過權利要求1至8任何一項的方法獲得的真皮乳頭組織。
全文摘要
依照本發明的用于制備真皮乳頭組織的本發明方法，使形成一些具有毛囊誘導能力的真皮乳頭組織成為可能，并且因此，本發明能夠通過細胞移植，而有效地應用于脫發的治療。
文檔編號C12N5/071GK101068920SQ200580040933
公開日2007年11月7日 申請日期2005年11月29日 優先權日2004年11月29日
發明者樸正克, 李斗勛, 尹熙勛, 申連浩, 金映真 申請人:來福科德有限公司, 樸正克