用于檢測核酸的核酸片段以及檢測核酸的方法

專利名稱：：用于檢測核酸的核酸片段以及檢測核酸的方法
技術領域：
：本發明涉及用于檢測核酸試樣中的目標核酸的突變或多態性的核酸片段及片段組。具體來說，本發明涉及可同時識別存在于同一條核酸鏈上的多個不連續的區中所含的基因信息的用于檢測核酸的探針、用于檢測核酸的竟爭物和使用這些探針或竟爭物進行的目標核酸的^f全測方法以及用于^r測核酸的試劑盒。
背景技術：
：人類基因組的解讀已經完成，人類染色體的全部序列均已了解，今后人們會專注于對各個基因所具有的信息的研究。目前，對于多種疾病與基因的突變或多態性的相關性的研究已取得進展，對于基因的突變或多態性與單基因疾病、多因子疾病的病因基因的關系逐漸了解。已有報道稱很多基因中都具有多態性，是在個體識別或病因基因的探索中有用的標志。還有報道指出在紅細胞的ABO型多態性或在HLA基因中可見的多態性中，對于輸血或骨髓移植來說，其相容性對治療結果等有重要影響。在上述狀況下，人們需求可簡便且準確地檢測存在于靶基因或含有該靶基因的區域內的基因突變、基因多態性的技術。檢測上述突變或多態性的方法例如有根據目標片段整體序列信息檢測基因的突變或多態性的方法，該方法有PCR-SSCP法(例如參照Proc.Natl.Acad.Sci.USA86,2766(1989)(非專利文獻l))、PCR-PHFA法(例如參照Nucl.AcidsRes.22,1541隱(1994)(非專利文獻2))、PCR國DGGE法(例如參照Proc.Natl.Acad.Sci.USA86,232(1989)(非專利文獻3》、PCR-RSCA法和測序法等。從理論上講，這些方法中，當片段內的任何區域內存在突變或多態性時，都可以根據單鏈結構的不同、退火方法的不同、變性方法的不同、異源雙鏈結構的不同、或者使已經得到解讀的序列本身發生變化并檢測其不同，以此來了解基因突變或多態性。另一方面，作為檢測非常有限的區內的基因突變或多態性的方法，有PCR-SSP法、侵入物法、PCR-RFLP法等。這些方法中，存在裂解酶(Cleavase)的切斷反應、限制酶的切斷反應產生影響，通過檢測該影響可以了解基因突變或基因多態性。作為上述的中間方法，有PCR-SSO法、Taqman法、LightCycler法等。這些方法是基于在靶區具有突變或多態性的DNA分子與具有對應于靶區的序列的合成寡核苷酸之間的親和性不同而實施的。這些方法中，當合成寡核苷酸的結合區存在突變或多態性時，與合成寡核香酸的親和性發生變化，由此使得寡核苷酸探針的結合、聚合酶的切斷、或者焚光能量轉移的有無發生變化，通過檢測該變化可以了解基因突變或多態性。HLA(人白細胞抗原)在自身或非自身識別中發揮重要作用，該基因存在非常多的多態性。主要的基因有HLA-A、-B、-C、-DR、-DP、-DQ。移植時，預先在供者和被移植者之間檢查這些基因的型別，通過使它們相容，可以使骨髓移植等的治療效果大幅提高。目前報道的多態性的種類是各基因中都有數十至數百種。確定這些基因的等位基因是不容易的，特別是在非血緣的情況下，尋找具有相容的基因型的人是非常困難的，為此組織公眾骨髓庫，通過許多供者的登記來尋找相容者。確定HLA等的基因多態性的方法例如有PCR-SSP法、PCR-SSO法、直接測序法等(例如今日的移植第7巻SUPPL(1994)(非專利文獻4))。其中，PCR-SSO法是適合多檢樣處理的方法，得到最廣泛的應用。該方法中，設定寡核苷酸探針，該寡核魯酸探針相當于在各HLA基因內顯示多態性的多個區，由它們的反應方式來確定基因型。但是，人的基因包含來自父親的和來自母親的兩組，并且HLA基因具有非常多的多態性，因此使用以往探針進行PCR-SSO法是無法確定基因型的。例如，一方的等位基因的兩個相鄰的位置#1、#2的堿基序列分別為A和T,另一方的對應的等位基因的位置的堿基序列為T和G時，4要照通常的方法，可從W的位置檢測出A和T,從#2的位置可檢測出堿基T和G。這意味一方的等位基因位置上分別具有A和G、另一方對應的等位基因位置上具有T和T時結果檢測出同樣的堿基。即，通常的PCR-SSO法中，無法區分物理連接的狀態和非連接狀態。通常是由連續的基因轉錄、翻譯成連續的蛋白質，因此通過各等位單元了解基因的序列是很重要的。如上所述，如果各等位單元中序列未特定，則無法確定正確的多態性。關于這一點，直接測序法也同樣。Saito等人提出了一種用于檢測核酸的探針，該探針是在一個探針分子內經核酸的堿基而互相間隔地具有兩個特異性序列區(參照國際公開公報WO03/027309號(專利文獻1))。存在于該探針中的兩處特異性序列區(識別靶序列的探針區)分別在雜交條件下與檢樣核酸上的耙核酸序列形成互補鏈。與探針上的兩處特異性區互補的靶區存在于各自的鏈——檢樣核酸中時，兩個特異性的區在兩條鏈上物理間隔，所形成的互補鏈并不是具有足夠強度的雙鏈。但是，當兩處特異性區上的互補的靶區存在于同一條鏈上時，所形成的互補鏈是具有足夠強度的雙鏈。因此，通過利用上述探針，可以根據所形成的雙鏈的強度區分兩處特異性的序列區中互補的耙區是在兩條鏈上物理性間隔存在，還是在一條鏈上物理性相鄰存在。但是，為了用一個探針識別兩處序列，必須將兩處序列分別進行最佳化，研究其最佳組合。例如，當同時識別在同一條核酸鏈上存在兩處(例如一處有m個候選，另一處有n個候選時)的靶序列，如果使用單鏈探針，則在進行該探針區的最佳化時，必須制備mxn種探針。m為10、n為20時，必須制備IOx20=200種探針并進行評價。結果，最佳化作業變得繁雜，開發時間延長，必然增大開發成本。因此，人們希望獲得探針容易制備、且檢測精度高、操作性優異的方法。專利文獻l:國際公開第03/027309號說明書非專利文獻l:Proc.Natl.Acad.Sci.USA86,2766(1989)非專利文獻2:Nucl.AcidsRes.22,1541畫(1994)非專利文獻3:Proc.Natl.Acad.Sci.USA86,232(1989)非專利文獻4:今日的移植第7巻SUPPL(1994)。
發明內容本發明人等為了檢測在同一條鏈上具有多個靶序列的目標核酸而制備用于檢測核酸的探針時，發現采用不是在一個分子上具有連續的多個探針區，而是多個探針通過互相可連接的區形成相連接探針，具有與在一個分子上的情況同等或更高的檢測靈敏度。本發明根據上述認識完成。因此，本發明的目的在于提供檢測精度優異、具有2個以上的多個探針區、用于檢測核酸的核酸片段及其片段組，含有上述核酸片段組的用于檢測核酸的探針，以及使用上述探針的檢測方法。本發明的核酸片段組含有可以與多個靶序列分別雜交的多個核酸片段，各核酸片段具有可互相連接的區，且該可連接的區之間的親和性設定為比靶序列與核酸片段之間的親和性高。本發明的核酸片段在本發明的核酸片段組中使用。本發明的用于檢測核酸的4冢針含有本發明的核酸片段組。本發明的用于檢測核酸的竟爭物含有本發明的核酸片段組。本發明提供檢測目標核酸的方法，其中所述目標核酸是多個耙序列可存在于同一條核酸鏈上，該方法包含以下步驟(a)使權利要求7或8的用于檢測核酸的探針和核酸試樣在可雜交的條件下進行接觸的步驟；和(b)通過檢測上述探針與核酸試樣是否進行了雜交來判定核酸試樣中是否存在目標核酸的步驟。本發明的用于檢測核酸的試劑盒至少含有本發明的用于檢測核酸的探針和本發明的用于檢測核酸的竟爭物。本發明可提供本發明的核酸片段組在目標核酸的檢測中的應用，其中所述目標核酸是多個靶序列可存在于同一條核酸鏈上。根據本發明的另一方案，本發明的核酸片段可以是下述核酸片段可與多個靶序列雜交的多個核酸片段具有互相可連接的區域，且可連接的區域之間的親和性設定為比靶序列與核酸片段之間的親和性高。本發明的又一方案可提供含有上述核酸片段的用于檢測核酸的探針。本發明的又一方案可提供含有上述核酸片段的用于檢測核酸的竟爭物。本發明的一個方案可提供檢測目標核酸的方法，其中所述目標核酸是多個靶序列存在于同一條核酸鏈上，該方法包含以下步驟(a')準備核酸試樣的步驟；(b')準備上述用于檢測核酸的探針的步驟；(c，)使上述用于檢測核酸的探針與核酸試樣雜交的步驟；以及(d，)通過檢測上述用于檢測核酸的探針與核酸試樣之間是否有形成的特異性雜交，判定核酸試樣中是否存在目標核酸的步驟。本發明的又一方案提供用于檢測核酸的試劑盒，該試劑盒含有上述用于檢測核酸的探針和/或用于檢測核酸的竟爭物。本發明的用于檢測核酸的探針檢測具有多處基因多態性的基因的精度高，因此可用于人白細胞抗原(HLA)基因、T細胞受體基因、紅細胞型別決定基因、Rh抗原基因的檢測。附圖簡述圖l是模式表示本發明的用于檢測核酸的探針(11=2時)的圖。圖2是表示例1中使用的HLA-DR基因與用于檢測核酸的探針的關系的圖。圖3是表示例2中使用的HLA-DR基因與用于檢測核酸的探針的關系的圖。圖4是表示例3中使用的HLA-DR基因與用于檢測核酸的探針的關系的圖。圖5是表示例4中使用的HLA-DR基因與竟爭物的關系的圖。發明的詳細說明核酸片段及其組本發明的核酸片段組含有相對于多個靶序列可分別雜交的多個核酸片段的核酸片段組，各核酸片段具有互相可連接的區域，且該可連接的區域之間的親和性設定為比靶序列與核酸片段之間的親和性高。本發明的核酸片段是在本發明的核酸片段組中使用的核酸片段。這里，關于由目標核酸中選擇靶序列，可根據可獲得的基因突變或多態性的基因信息適當確定。這里所述"連接"是指反應液中多個分子鍵合，可以是任意的鍵。優選為非共價鍵，進一步優選象腺噤呤-胸腺嘧啶、鳥嘌呤-胞嘧啶的鍵那樣的氫鍵。為核酸時，連接的強度可根據序列的長度、核酸的種類適當調節。本發明中，"親和性"是表示核酸片段與靶序列、或者可互相連接的區之間的鍵合狀態的強度，如果是核酸之間，則可用Tm值(溶解溫度)表示。Tm值越高則鍵合狀態越強、越穩定。Tm值可通過常用的方法例如下述文獻所述方法測定i)WallaceR.B.,ShafferJ.,MurphyR.F.,BonnerJ.,HiroseT.,andItakuraK.(1979)Hybridizationofsyntheticoligodeoxyribonucleotidestophichi174DNA(合成的寡脫氧核糖核芬酸雜交到phichi174DNA上):theeffectofsinglebasepairmismatch(單石咸基^H晉目己的歲爻果)-NucleicAcidsRes.6(11):3543~3557;或者ii)BreslauerK丄，FrankR.,BlockerH.,MarkeyL.A.(1986)PredictingDNAduplexstabilityfromthebasesequence(/人堿基序歹寸判定DNA雙螺旋穩定性)-Proc.Natl.Acad.Sci.USA83，3746~3750.本發明中，"雜交"是指核酸之間的互補性高時可形成兩條鏈。通常設計為核酸彼此互補，也可以根據需要，在檢測上不出現問題的范圍內，可在其中含有一或多個(例如23個)錯配。可存在的錯配數量受到所要求的檢測精度以及核酸片段的長度限制。檢測時通過適當改變核酸片段與靶核酸的雜交形成條件，可以排除錯配的情況，或者調節至可允許的錯配數。用于檢測核酸的探針本發明的用于檢測核酸的探針是可以與目標核酸中的靶序列雜交的多個核酸片段，含有下述核酸片段，即，該各核酸片段具有互相可連接的區，且設定為可連接的區之間的親和性比耙序列與核酸片段之間的親和性高。例如，目標核酸具有n個靶序列，使用可與其雜交的n個核酸片段作為探針時，可互相連接的區至少存在n-l個，因此，可以使用互相結合的核酸片段的組作為探針。這里，n例如為26,優選2~4,更優選2~3，進一步優選2。其中的一個例子例如可以如圖l所示制備。本發明的核酸片段只要是與目標核酸的靶區特異't生結合的核酸性物質即可，沒有特別限定。具體例子有DNA(脫氧核糖核酸)、RNA(核糖核酸)、PNA(肽核酸)、LNA(鎖定核酸)，可以使用一種或多種，優選為DNA、PNA，更優選DNA。核酸片段可根據目標核酸的序列信息，通過采用常用的方法適當合成。對核酸片段的長度沒有特別限定，例如為5100個堿基長度，優選830個堿基、進一步優選1028個堿基。本發明中的可連接的區是指存在于可以與多個靶序列雜交的核酸片段之外的部分，并可通過特異性的親和性互相連接的區。所述區可以存在于該核酸片段的3，末端或5，末端或者兩個末端。具體來說，例如有抗原-抗體、配體-受體、或核酸-具有互補序列的核酸等組合，優選核酸-具有互補序列的核酸的組合。可連接的區為核酸時，其典型的長度為450個堿基，優選840個堿基，更優選1030個堿基。這些組合中的堿基可以是任意的序列，還可以從設計成形成預先確定的組合的堿基對的序列組中選擇。很多情況下通過將由4個堿基左右組成的序列單元組合，從具有多樣性的一系列的序列組中選擇。連接好的探針之間的Tm值(溶解溫度)比靶區和探針區的Tm值高，其溫度差為2。C以上，優選10。C以上。在不會對探針的功能產生影響的范圍內，本發明的探針可以在多個核酸片段中進一步含有可用于至少一個核酸片段上的標記物質或任意的序列或者修飾物質。本發明的用于檢測核酸的探針可以將多個核酸片段中的至少一個核酸片段固定在固相上。這種情況下所使用的固相載體只要是本發明的用于檢測核酸的探針或檢樣核酸可非特異性吸附的載體、或者可以導入官能基團并在該官能基團與核酸之間形成共價鍵的載體即可，任何材質或任何形狀的載體均可利用。具體例子有所謂的聚合物制造的微量板、管、平板上、珠子形狀的載體。本發明中，可以采用微量板、平板上或珠子形狀，但從容易采用機械化的角度考慮，特別優選珠子形狀。將本發明的核酸片段固定在固相上的方法例如有化學鍵合法[NucleicAcidsRes.,15,53735390(1987)]。具體例子有使用EDC等水溶性碳二亞胺等交聯劑，使導入了羧基的載體和向5，末端導入了氨基己基的核酸鍵合的方法。其它固定方法有通過吸附等非特異性結合，將核酸直接固定在載體上的方法。載體為聚苯乙烯制時，紫外線照射或者添加氯化鎂可以提高吸附效率(日本特開昭61-219400號/>報)。還有通過適當的方法，將核酸與蛋白質進行化學鍵合或非特異性吸附，利用該蛋白質與載體的非特異性吸附進行固定的方法等。固定在固相中的可以是檢樣核酸，固定載體和固定方法與本發明的用于檢測核酸的探針的情況相同。本發明的用于檢測核酸的探針用于檢測可存在于檢樣中的耙核酸或鑒定作為檢測對象的核酸。作為本發明的探針的檢測對象的核酸，只要是在同一條鏈中具有多個靶區的目標核酸即可，優選來自人的基因，更優選人白細胞抗原(HLA)基因、T細胞受體基因、紅細胞型別決定基因或者Rh抗原基因。在檢測或者捕獲與序列具有類似性的一系列基因組時，該上述探針也有用。即，在一系列的基因組的堿基序列中，連續的共通序列很短，因此只憑該區無法形成穩定的雙鏈。這種情況下，如果在相鄰的區存在同樣的位置，則可以通過可同時識別本發明的多個區的探針進行檢測或捕獲。用于;^測核酸的竟爭物本發明中，可以將上述核酸片段作為用于檢測核酸的竟爭物使用。將本發明的核酸片段作為用于檢測核酸的竟爭物使用時，可與目標核酸中的多個靶序列雜交的多個核酸片段的親和性設定為與使用該核酸片段作為用于檢測核酸的探針時的親和性同等或其以下。為了將靶序列與核酸片段的親和性設定成與用于檢測核酸的探針的親和性同等或以下，可以設定成使可與靶序列雜交的核酸片段與探針同等，或者使可與靶序列雜交的堿基數減少。本發明中，用于檢測核酸的竟爭物可以是為了提高目標核酸與上述用于檢測核酸的探針的雜交反應的精度，并只選擇性地檢測目標核酸而使用。通常，本發明的用于檢測核酸的竟爭物優選相對于核酸試樣為1/10的量至200倍量的范圍，進一步優選1/2的量至10(M咅量。因此，根據本發明的一個優選方案，用于檢測核酸的竟爭物中，靶序列與核酸片段之間的親和性與權利要求7或8所記載的探針中使用的核酸片段和靶序列之間的親和性相比，設定為低或同等。檢測核酸的方法如上所述，本發明可提供^^測目標核酸的方法，其中所述目標核酸是多個靶序列可存在于同一條核酸鏈上，該方法包含以下步驟(a)在可雜交的條件下，使權利要求7或8的用于檢測核酸的探針與核酸試樣接觸的步驟；和(b)通過檢測上述探針與核酸試樣是否雜交來判定核酸試樣中是否存在目標核酸的步驟。定，可以是如下方法預先將用于檢測核酸的探針之間連接，然后使核酸試樣與其雜交的方法；將一部分用于檢測核酸的探針與核酸試樣混合，然后添加其余的用于檢測核酸的探針進行雜交的方法；分別同時加入用于檢測核酸的探針與核酸試樣，進行雜交的方法等。其中，可以使用于檢測核酸的探針與核酸試樣雜交的條件可根據所使用的探針和靶核酸等而變化，通常的條件是可適當設定。雜交形成條件的具體例子是15xSSC(0.75MNaCl、75mM檸檬酸鈉)，優選此時的溫度為2580'C。本發明的核酸的檢測方法可應用在通常的基因檢測法中使用的常規方法。所述方法例如有下述(1)(5)的方法(1)預先將本發明的用于檢測的探針固定在固相上，使具有可檢測的標記的目標核酸、或者預先導入了標記的目標核酸與已固定的探針雜交，檢測殘留在固相上的標記的方法；(2)預先將目標核酸固定在固相上，使預先導入了可^f企測的標記的本發明的探針與固定的目標核酸進行雜交，檢測殘留在固相上的才示i己的方法；(3)將本發明的探針和目標核酸分別與各自的可懸浮的固相結合，將它們進行雜交，發生凝聚反應，確認該凝聚的方法；(4)將本發明的探針與目標核酸在液相中雜交，檢測由于雙鏈的形成而產生的熒光能量轉移的方法；和(5)將上述(1卜(4)任意組合而成的方法。本發明中，優選上述(l)的方法。上述(l)的方法中，目標核酸容易被已固定的本發明的探針捕獲，目標核酸以外的核酸則不被捕獲，因此通過測定固相上的標平，即可以容易地檢測出目標核酸。對本發明的用于檢測核酸的探針或檢樣核酸進行標記的方法例子包括(A)向需要標記的核酸中直接導入標記物的方法；(B)使用已標記的寡核苷酸引物，合成要標記的核酸或與要標記的核酸互補的核酸的方法；和(C)在已標記的單位核酸存在下，使用寡核苷酸引物合成要標記的核酸或與要標記的核酸互補的核酸的方法。上述(A)的方法有通過光反應，向要標記的核酸中導入生物素書亍生物，通過與酶結合的鏈親和素進4亍^r測的方法[NucleicAcidsRes.,13,745(1985)];將要標記的核酸進行磺化，使用酶標抗磺化抗體進行檢測的方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81,3466~3470(1984)]等。。例如在PCR法[Science,230,1350~1354(1985)]中，利用被標記的引物或者利用被標記的單核香酸三磷酸，可獲得被標記的延伸產物或擴增產物。另外，在利用Q卩復制酶進行的擴增法[BIO/TECHNOLOGY,6,1197(1988)]中，通過利用同樣標記的單核*酸三磷酸，可以獲得被標記的延伸產物或擴增產物。另外，在上述以外的核酸擴增方法中，通過預先對經過延伸反應或擴增反應而摻入的單核苷酸三磷酸或寡核苷酸進行標記，可以標記延伸產物或擴增產物。這里使用的標記物只要是可以在雜交操作后檢測出該物質即可，不管是放射性或非放射性。從應用的容易性、保存性、廢棄處理等角度考慮，優選非放射性的標記物。非放射性的標記物例如有生物素、2,4-二硝基苯基、洋地黃毒苷等半抗原，熒光素及其衍生物[例如熒光素異^L氰酸酯(FITC)等]、羅丹明及其衍生物[例如四曱基羅丹明異硫氰酸酯(TRITC)、德克薩斯紅等]、4-氟-7-硝基苯并呋喃(NBDF)和丹酰等熒光物質或吖啶等化學發光物質。通過這些物質對靶核酸或本發明的探針進行標記時，可通過任意公知的方法(參照日本特開昭59-93098號、日本特開昭59-93099號公報)進行標記。本發明中，檢測本發明的探針與靶核酸之間是否形成特異性的雜交，該操作可根據所存在的標記的種類適當選擇并確定。這里，標記如果可直接檢測，即，標記例如為》文射線同位素、熒光物、染料等時，可在被標記的核酸與固相結合的狀態下進行檢測操作，或者在標記物與核酸結合的狀態、或以標記物從核酸中切除的狀態游離到溶液中、然后通過與該標記相適應的方法進行檢測，繰作。標記可間接;險測時，即，標記例如為生物素、半抗原等特異性結合反應的配體時，如通常它們的>^測一樣，可以使用直接發生信號的標記或結合了酶的受體(例如生物素受體或抗體)進行檢測操作，其中所述酶催化發生信號的反應。根據本發明的一個優選方案，本發明的檢測方法進一步包含在步驟(a)之前使檢樣中的檢樣核酸擴增的步驟。即，在本發明的檢測方法中，優選在檢測之前，以才企樣核酸為模板，通過常用的基因擴增方法使檢樣核酸擴增。所述擴增方法例如有象PCR法(聚合酶鏈反應)那樣的需要溫度變化的方法、和象LAMP法(新式恒溫核酸擴增法)那樣的在恒溫下進^f于的方法。根據本發明的另一個優選方案，在步驟(a)中進一步使用本發明的用于檢測核酸的竟爭物。通過使用竟爭物，可以提高檢測精度。或對作為檢查對象的核酸進行鑒定。本發明的作為檢測對象的核酸只要是在同一條鏈中具有多個靶區的靶核酸即可，可以是任何核酸，優選來自人的基因，更優選人白細胞抗原(HLA)基因、T細胞受體基因、紅細胞型別決定基因、或Rh抗原基因。用于檢測核酸的試劑盒本發明的用于檢測核酸的試劑盒是用于檢測試樣核酸中是否存在目標核酸的耙系列的核酸，至少含有本發明的用于檢測核酸的探針和本發明的用于檢測核酸的竟爭物。本發明的試劑盒優選進一步含有用于擴增目標核酸的引物。本發明的試劑盒還可以含有進行基因擴增反應而必需的試劑、進行雜交反應而必需的試劑、以及判定基因擴增產物與本發明的探針是否形成特異性雜交而必需的試劑等。這些試劑可以適當使用常用的試劑。例如，用于判斷是否形成雜交的試劑可以是與雙鏈進行特異性反應的嵌入劑等。本發明的試劑盒用于對可存在于檢樣中的靶核酸進行鑒定或者對作為檢查對象的核酸進行鑒定。本發明的作為檢測對象的核酸只要是在同一條鏈中具有多個靶區的靶核酸即可，可以是任何核酸，優選來自人的基因，更優選人白細胞抗原(HLA)基因、T細胞受體基因、紅細胞型別決定基因、或Rh抗原基因。實施例以下通過實施例說明本發明，但本發明并不受此限定。例l:對HLA-DRB"150201和DRB1"50101、*0101、*040501以及*140701的識別使用本發明的用于檢測核酸的探針，對HLA-DRBl基因(HLA-DRB1"50201(SEQIDNO:1)和DRB1"50101(SEQIDNO:2)、沐OIOI(SEQIDNO:3)、*040501(SEQIDNO:4)以及*140701(SEQIDNO:5))進行識別。作為用于檢測核酸的探針，準備探針98-lLD(SEQIDNO:6)、98-2LD(SEQIDNO:7)和98-llUD(SEQIDNO:8)/Linl國9D(SEQIDNO:9)。它們具有識別HLA-DRB"150201基因中對應氨基酸編號69號72號的區(第一探針區)和對應84號88號的區(第二探針區)的探針序列。這里，探針98-lLD是兩個探針區之間沒有任何中斷、連續存在的序列。98-2LD是兩個區之間由4個胸苷酸(TTTT)相連接的序列。與此相對，98-llUD/Linl-9D是98-llUD、Linl-9D分別具有對應兩個區的探針區。并且，98-llUD探針區的5'—側具有6個(ACTC)的單元，Lml-9D探針序列的3，一側具有6個(GAGT)的單元。兩種〗笨針在該部分形成互補鏈，由此可以獲得臂結構，兩個探針區經由臂結構成為鄰接的形。將這些探針使用EDC等水溶性碳二亞胺進行偶聯，經由存在于寡核苷酸末端的氨基，可固定在羧基化聚苯乙烯珠上。另一方面，關于HLA-DRB1*150201、*150101基因，以摻入了各基因的質粒為模板，使用生物素標記引物進行PCR反應(這里，反應是以94。C/30秒、55。C/30秒、72。C/30秒為一個循環，實施30個循環)，得到擴增產物。對于表2中所迷的預先判定具有HLA-DRB1基因的檢樣#1~#5，使用染色體DNA得到擴增產物。在可形成雜交的條件下，使各基因的生物素標記的擴增產物分別與被固定的探針進行雜交。使鏈親和素-藻紅素(熒光物質)與其作用，洗滌，然后測定殘留于珠子上的熒光強度，其相對值的結果表示在表2中。[表l]例1中制備的各探針與DRB1基因的錯配數<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>表l表示了所使用的探針的第一區、第二區的序列與各DRB1基因之間的錯配數。本實施例中使用的探針序列是與DRB1*150201基因在兩個區均完全配對的序列，但與其它的基因則在其中一個區域存在錯配。表2表示使用由各模板DNA制備的生物素標記DNA進行雜交后，殘留在珠子上的熒光強度。由以質粒為模板DNA的實驗例可知，本發明的探針識別第一區、第二區兩者。即，對于第一區、第二區均沒有錯配的DRB"150201產生強的信號，而對于與第二區有錯配的DRB"150101顯示弱信號。另外，在其識別率方面，可知本發明的探針具有與兩種比較例的探針同等或更高的性能。使用染色體DNA作為檢樣時，本發明的探針和比較例的探針均對含有DRB"150201的檢樣顯示強烈的信號，而對于不含有該基因的檢樣產生弱信號。本發明的探針設計成笫一區、第二區存在于不同的分子上，通過可連接的區連接。如本實施例所示，具有上述結構的探針與實施例中其它形狀的探針同樣，可識別兩處堿基序列，兩個序列均配對時，其堿基對更穩定，可特異性檢測。例2:對HLA-DRBin50201和DRB"150101、*030101、*040301、*070101、*130201、*140101和*140701的識別使用本發明的用于檢測核酸的探針，對HLA-DRBl基因(HLA-DRB"150201和n50101、*030101(SEQIDNO:10)、*040301(SEQIDNO:11)、*070101(SEQIDNO:12)、*130201(SEQIDNO:13)、*140101(SEQIDNO:14)以及*140701)進行識別。用于檢測核酸的探針使用將探針98-llUD、Linl-9D、Lin2GT-l(SEQIDNO:15)、Lin3GT-l(SEQIDNO:16)四種單獨固定所得的探針；以及98-llUD和Linl-9D的混合物；98-11UD和Lin2GT-l的混合物；98-llUD和Lm3GT-l的混合物。這里，98-llUD具有對應氨基酸編號6972(第一區)的探針區，在其5'—側具有6個(ACTC)的單元。Linl-9D具有對應氨基酸編號84~88(第二區)的探針區，在其5，一側具有6個(GAGT)的單元。Lin2GT-1具有第二探針區，在其5，一側具有6個(GTAG)的單元。Lin3GT-l具有第二探針區，在其5'—側具有6個(ATGG)的單元。其中，98-llUD與Linl-9D組合時，各個單元形成互補的序列，可連接形成臂結構。按照與例1同樣的方法，將各探針以單獨或兩種混合物的形式固定在羧基化珠上。另外，以質粒或染色體DNA為模板，通過生物素標記引物進行PCR擴增，得到生物素標記PCR產物。對于各基因的生物素標記擴增產物，在可形成雜交的條件下與分別固定有探針的珠子進行雜交。使鏈親和素-藻紅素(焚光物質)與其作用，洗滌后測定殘留在珠子上的熒光強度，其相對值如表4所示。例2中制備的各探針與DRB1基因的錯配數<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>[表4]殘留在珠子上的熒光強度<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>表3表示所使用的探針的第一區、笫二區的序列與各DRB1基因之間的錯配數。本實施例中使用的探針區是與DRBP150201基因在兩個區均完全一致的序列，但與其它基因至少其中之一的區存在錯配。具有對應第一區的探針區的98-llUD與DRBin50101和n50201具有完全一致的序列，與其它基因存在錯配。使用染色體DNA作為檢樣時，對于該探針，對于含有與該探針完全一致的*150201基因的檢樣*1、*2,可得到比較高的信號。但是，對于使用質粒作為模板擴增的產物，比起完全配對的DRB"150201,對含有錯配的*040301、*070101得到了高信號，未發揮原本的探針性能。具有對應第二區的探針序列的Linl-9D、Lin2GT-l、Lin3GT-l均與DRBP070101、*130201、*150201完全一致，與*030101、*040301、*140701和*150101有2個堿基的錯配。這三種探針的探針部分的序列相同，只是單元的序列不同。這些探針中，對于完全配對和錯配基因未見信號差異。由以上可知分別單獨具有第一區、第二區的探針分子不可能同時識別兩個區。另一方面，在以染色體DNA作為檢樣時，對于同時固定的、對應兩個區的4笨針98-llUD/Linl-9D、98-11UD/Lin2GT-l、98-11UD/Lin3GT-l,在含有與兩個區完全配對的*150201的染色體DNA檢樣#1、2中產生了高信號，在不含有*150201的檢樣#3、#4中產生低信號。這里，兩個探針中所含的單元部分可形成互補序列的98-11UD/Linl-9D組合比不互補的其它兩種探針進行的識別更明確。以質粒DNA為模板時，98-11UD/Linl-9D探針只對兩個區完全配對的DRB"150201產生特異性信號，關于另外兩種探針，98-llUD探針對具有錯配的DRB"040301、*070101產生強信號，未見所期待的探針性能。由以上可知，在兩個區通過互補的單元相連接的探針中，可以猜想到兩個區經由臂結構形成相鄰的結構，結果，同時識別兩個區的探針的識別能力高。例3:對HLA-DRB"130201和HLA國DRBin30101、HLA-DRB1*1403的識別使用本發明的用于檢測核酸的探針，對HLA-DRB"130201和*130101(SEQIDNO:17)、HLA-DRB1*1403(SEQIDNO:18)進行識別。作為用于檢測核酸的探針，將只識別一個區的95-26UD(SEQIDNO:19)固定，在雜交的當時添加識別另一個區的LinGT2-2D(SEQIDNO:20)、GT2-2(SEQIDNO:21)或者GT2-2T(SEQIDNO:22)。這里，95-26UD具有對應氨基酸編號6972(第一區)的探針區，在其3，一側具有5，-CACACCTCCTCTCCACCACACCTC-3'標記序列(SEQIDNO:23)。LinGT2-2D具有對應氨基酸編號8488(第二區)的探針區，在其5，一側具有5，-GAGGTGTGGTGGAGAGGAGGTGTG-3，標記序列(SEQIDNO:24)和4個胸苷酸。GT2-2具有第二區的探針區，但在5，一側沒有任何序列。GT2-2T具有第二區的探針區，在其5'—側具有含28個堿基的胸苷酸的序列。其中，95-26UD和LinGT2-2D的組合中，其各自的標記序列互補，通過在固定95-26UD的載體上添加LinGT2-2D,可以通過形成互補鏈而獲得壁結構，形成識別第一區的部分和識別第二區的部分經由臂部分連接的結構。另一方面，在95-26UD與GT2-2或者95-26UD與GT2-2T的組合中，無法通過互補鏈形成臂結構，因此沒有形成識別第一區、第二區的部分相鄰接的結構。按照與例1同樣的方法，將95-26UD單獨固定在羧基化珠子上。生物素標記擴增產物是以摻入了各基因的質粒DNA作為模板，通過生物素標記引物進行PCR擴增來制備。使各基因的生物素標記擴增產物在可雜交的條件下與固定有95-26UD的珠子雜交。此時，液相中共存LinGT2-2D、GT2-2或GT2-2T。將鏈親和素-藻紅素(熒光物質)與其作用，洗滌后測定殘留在珠子上的熒光強度，其相對值如表6所示。<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>表5表示所使用的探針的第一區、第二區的序列分別與DRB1基因之間的錯配數。本實施例中使用的探針區是與DRB"130201基因在兩個區均完全一致的序列，但與DRBin30101在第二區存在錯配，與DRB"1403在第一區存在錯配。表6表示使用由各模板DNA制備的生物素標記擴增產物進行雜交后殘留在珠子上的熒光強度。通過與被固定的探針形成互補鏈，只要在雜交中添加可形成第一、第二區相鄰接結構的探針，即可識別第一區、第二區兩者。即，在雜交時混合具有可與被固定的探針95-26UD互補的單元、并可通過形成互補鏈來形成兩個區相鄰接的結構的LinGT2-2D,對于與笫一區、第二區均沒有錯配的DRBin30201顯示強信號，而對于與一個區有4晉配的DRBP130101、DRB"1403顯示低信號。與此相對，在雜交時添加第二區的序列相同、但不能與固定探針獲得臂結構、無法形成兩個區相鄰的結構的GT2-2和GT2-2T，與未添加的情況顯示同等的低焚光強度。本發明的探針-沒計成存在于第一區、笫二區不相同的分子上，并通過各自可連接的區相鄰接。如本實施例所示，在只將一方的區固定、將另一方添加到液相中時，如果是兩個區的堿基序列分別配對、并且兩個區形成相鄰接結構的探針，所形成的堿基對更穩定，可進行特異性檢測。例4:通過添加核酸片段提高對HLA-DRB1"30101與DRB"130201和DRB"1403的識別能力使用本發明的核酸片段作為竟爭物，對HLA-DRB1基因(HLA-DRB"130101和n30201、DRB1M403)進行識別。特異性檢測核酸序列時，為了提高其特異性，已知有使探針序列、或與檢樣序列類似的序列的核酸共存的方法。本申請的核酸片段也有望具有同樣的作用。作為用于檢測核酸的探針，將本發明所示的核酸片段固定在固相上使用。在這里，將本發明的核酸片段添加在液相中，通過使其和檢樣竟爭與探針的結合，判定是否可以提高雜交的特異性。本實施例中，預先將識別其中一個區的探針固定在固相上，在雜交時添加識別另一區的探針，也可以將兩種探針同時固定。還可以在雜交時同時添加具有可互相連接的區、識別一個區的探針和識別另一個區的探針，使其互相連接，也還可以制成預先連接的形式然后添加。將只識別第一區的95-42UD(SEQIDNO:25)進行固定，在雜交時添加只識別第二區的LinTG3-5(SEQIDNO:26),由此制備識別兩個不同的區的探針。另外，與此同時，作為竟爭物，在雜交時添加識別第一區的95-25UD(SEQIDNO:27)、識別第二區的LinGT2-2D、或者同時添加兩者。這里，95-42UD具有對應氨基酸編號69一2(第一區)的探針區，在其3，一側具有含6個(ACTC)單元的標記序列。LinTGS-S具有對應氨基酸編號8488(第二區)的探針區，在其5，一側具有含6個(GACT)單元的標記序列和4個胸苷酸。兩者具有互補的標記序列，混合時可容易地連接。作為竟爭物使用的95-25UD具有對應氨基酸編號69-72(第一區)的探針區，在其3，一側具有5，-CACACCTCCTCTCCACCACACCTC-3，標記序列(SEQIDNO:23)。LinGT2-2D的序列如例3所示，除對應第二區的探針區之外，還具有標記序列5，-GAGGTGTGGTGGAGAGGAGGTGTG-3'(SEQIDNO:24)。其中，95-42UD與LinTG3-5的各標記序列互補，通過向固定有95-42UD的載體中添加LinTG3-5，可形成互補鏈，進而形成臂結構，形成識別第一區的部分和識別第二區的部分經由臂部分鄰接的結構。另外，95-25UD與LinGT2-2D的各標記序列互補,分別添加到液相中，可通過形成互補鏈來形成臂結構，形成識別第一區的部分和識別笫二區的部分經由臂部分鄰接的結構。按照與例1同樣的方法，將95-42UD單獨固定在羧基化珠子上。生物素標記的擴增產物如下制備以摻入了各基因的質粒DNA作為模板，通過生物素標記引物進行PCR擴增制備。使各基因的生物素標記擴增產物在可雜交的條件下與固定有95-42UD的珠子雜交。此時，液相中有與被固定的探針95-42UD形成互補鏈的LinTG3-5共存，形成笫一區和第二區鄰接的探針結構。并且作為竟爭物，只存在95-25UD、只存在LinGT2-2D、或者95-25UD、LinGT2-2D兩者共存。使鏈親和素-藻紅素(熒光物質)與其作用，洗滌后測定殘留在珠子上的熒光強度，其相對值如表8所示。<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>之間的錯配數。本實施例中使用的探針區是與BRD"130101基因在兩個區均完全一致的序列，但與DRB"130201在笫二區、與DRB"14(B在笫一區、第二區存在錯配。<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>表8表示使用由各模板DNA制備的生物素標記擴增產物進行雜交后殘留在珠子上的熒光強度。未添加竟爭物時，與DRB1"30201可見交叉雜交中可見的高熒光值。而添加可形成互補鏈的竟爭物時，與未添加的相比，DRBin30201的熒光值明顯下降，這表明通過使用竟爭物，顯著抑制了交叉雜交。即，使用本發明的用于檢測核酸的探針作為竟爭物時，可抑制交叉雜交，可以提高檢測探針的識別精度。權利要求1.核酸片段組，該核酸片段組含有可與多個靶序列分別雜交的多個核酸片段，其中各核酸片段具有互相可連接的區，且該可連接的區之間的親和性設定成比靶序列與核酸片段之間的親和性高。2.權利要求l的核酸片段組，其中互相可連接的區由核酸組成。3.權利要求1或2的核酸片段組，其中多個核酸片段中的至少一個核酸片段被固定在固相上。4.權利要求3的核酸片段組，其中固相為珠狀或平面狀。5.權利要求14中任一項的核酸片段組，其中當多個靶序列存在于同一條核酸鏈上時，該核酸片段組可以與該核酸鏈雜交。6.核酸片段，該核酸片段在權利要求15中任一項的核酸片段組中使用。7.用于檢測核酸的探針，該探針由權利要求15中任一項的核酸片段組組成。8.權利要求7的探針，該探針用于檢測選自人白細胞抗原(HLA)基因、T細胞受體基因、紅細胞型別決定基因和Rh抗原基因的基因。9.用于檢測核酸的竟爭物，該竟爭物由權利要求15中任一項的核酸片段組組成。10.權利要求9的竟爭物，其中靶序列與核酸片段之間的親和性設定成比權利要求7或8的探針中使用的核酸片段與靶序列之間的親和性低或同等。11.檢測目標核酸的方法，其中所述目標核酸是多個耙序列可存在于同一條核酸鏈上，該方法包含以下步驟(a)在可雜交的條件下，使權利要求7或8的用于檢測核酸的探針與核酸試樣接觸的步驟；和樣中是否存在目標核酸的步驟。12.權利要求ll的檢測方法，其中在步驟(a)中，進一步使用權利要求9或10的用于檢測核酸的竟爭物。13.權利要求11或12的檢測方法，該方法進一步包含在步驟(a)之前，使核酸試樣中的目標核酸擴增的步驟。14.權利要求1113中任一項的方法，其中目標核酸選自人白細胞抗原(HLA)基因、T細胞受體基因、紅細胞型別決定基因和Rh抗原基因。15.用于檢測核酸的試劑盒，該試劑盒至少含有權利要求7或8的用于檢測核酸的探針和權利要求9或10的用于檢測核酸的竟爭物。16.權利要求15的用于檢測核酸的試劑盒，該試劑盒進一步含有用于擴增目標核酸的引物。17.權利要求1~5中任一項的核酸片段組在檢測目標核酸中的應用，其中所述目標核酸是多個靶序列可存在于同一條核酸鏈上。全文摘要本發明的核酸片段組含有可以與多個靶序列分別雜交的多個核酸片段，各核酸片段具有可互相連接的區，且該可連接的區之間的親和性設定為比靶序列與核酸片段之間的親和性高。本發明的核酸片段在核酸片段的組中使用。本發明的核酸片段可用作用于檢測核酸的探針或用于檢測核酸的競爭物。根據本發明，例如可以高精度地進行人白細胞抗原(HLA)基因、T細胞受體基因、紅細胞型別決定基因、Rh抗原基因的檢測。文檔編號C12M1/00GK101103107SQ20058004665公開日2008年1月9日申請日期2005年11月21日優先權日2004年11月19日發明者岡孝紀,川井信太郎,直原寬申請人:湧永制藥株式會社