產生和分泌修飾的肽的方法

專利名稱：：產生和分泌修飾的肽的方法產生和分泌修飾的肽的方法
技術領域：
：本發明涉及在重組宿主細胞中生產異源多肽。本發明更特別涉及由一或多種lantibiotic-合成酶具體是脫水酶LanB修飾的肽、如生物活性肽的產生和分泌。有許多種生物學活性肽是已知的，如激素、生長因子、酶抑制劑、抗原、抗生素和離子載體。已經表明肽的環化對于獲得生物學活性肽等的穩定類似物是一種頗為有價值的方法。另外，通過構象限制，可以獲得肽與其結合配體(例如受體或酶)之間增強的或被調節的相互作用(Lietal.(2002)Curr.Top.Med.Chem.2，325;Osapayetal.(1997)J.Med.Chem.40,2241;RewY.etal.(2002)J,Med.Chem.45，3746-3754)。硫醚環可以有助于增強肽的穩定性，增強對蛋白水解的抗性(Bierbaumetal.(1996)Appl.Environm.Microbiol.62,385;VanderMeeretal.(1993)J.Bacteriol.175,2578)及調節受體相互作用(Osapayetal.(1997)J.Med.Chem,40，2241)。Lantibiotic是具有分子內硫醚環的細菌肽。它們的大多數具有抗生素活性并且在Lantibiotic中均存在羊毛硫氨酸殘基即含硫醚的氨基酸，由此而得名。Lantibiotic是由革蘭氏陽性菌產生的并主要作用于革蘭氏陽性菌(參見Chatterjee，C,etal.(2005)Ozem&v105,633-684)。Lantibiotics源自核糖體合成的前肽，這些前肽在翻譯后被修飾產生含有(甲基)羊毛硫氨酸和/或脫水殘基的肽。脫水丙氨酸和脫水三丁酸甘油酯分別得自lantibiotic酶介導的對絲氨酸和蘇氨酸的脫水。由硫醚氨基酸羊毛硫氨酸(Lan)和3-甲基羊毛硫氨酸(MeLan)形成的分子內硫醚橋或環得自lantibiotic酶介導的脫水殘基與半胱氨酸的連接。熟知的lantibiotics包括枯草菌素和食品防腐劑乳酸鏈球菌肽，它們的結構非常相似。硫醚環保護lantibiotics免于蛋白水解。例如，lantibiotic乳酸鏈球菌肽在經胰蛋白酶處理后仍保留活性。硫醚環對于一些lantibiotic活性是必需的。乳酸鏈球菌肽中硫醚環A或C的幵環導致膜通透能力喪失。乳酸鏈球菌肽的環A對于其自身誘導自體合成的能力及對于乳酸鏈球菌肽通過與脂質II的相互作用而阻斷細菌肽聚糖合成的能力是必需的。在這些情況中必須具有硫醚環而非二硫環，因為硫醚環由二硫鍵的置換導致抗微生物活性喪失。鑒于硫醚環可有助于生物學活性肽的穩定性和活性，已經提議lantibiotic合成酶(lantibiotic-synthesizingenzymes)可有禾!ji也用于在通常不含有硫醚橋的肽中導入硫醚環，以改良所述肽的穩定性和/或改變其活性(Kuipersetal.2004.J.Biol.Chem.279,22176-22182)。已經描述了Lantibiotic合成酶可組構為膜結合的復合物(Siegersetal.1996.J.Biol.Chem.271，12294-12301;Kiesauetal.1997.J.Bacteriol,179，1475-1481;Sahletal.1998.Annu.Rev.Microbiol.52:41-7)。這種復合物由lantibiotic轉運蛋白(LanT)、脫水酶(LanB;也稱作脫水酶)和環化酶(LanC)組成。在一些lantibiotics的情況中，一種雙功能的酶(LanM)既進行脫水又進行環化步驟。核糖體合成的前原肽(prepropeptide)中N末端的lantibiotic前導肽是lantibiotic酶的識別信號，用脫水酶或既可進行脫水又可進行環形成的酶開始。據信前導肽與lantibiotic復合物結合，使得所述前原肽與lantibiotic酶非常接近。所述酶復合物提示所述脫水和環形成酶與轉運蛋白的附著是必需的，因為否則lantibiotic前原肽會不經修飾而被輸出，或者修飾的肽積聚在細胞中。在大多數情況中，lantibiotic的轉運完全依賴于lantibiotic轉運蛋白。已經表明乳酸鏈球菌肽轉運蛋白(NisT)的破壞導致完全修飾的前乳酸鏈球菌肽積聚在細胞內部(Qiaoetal.1996.FEMSMicrobiol.Lett.144,89-93)。Kuipers等先前揭示了lantibiotic轉運蛋白NisT可以分泌未修飾的lantibiotics和所述前導肽與非lantibiotic肽的融合體，并且脫水酶和lantiHotic轉運蛋白的組合在沒有環化酶的情況中也起作用(Kuipersetal.2004.J.Biol.Chem.279，22176-22182)。通常的理解是由lantibiotic酶復合物修飾的肽也是通過所述復合物中可利用的專門的轉運蛋白來轉運的。然而，仍需要加工含有羊毛硫氨酸橋的肽的形成和分泌而不需要完整的復合物的其他方式，特別是用于重組產生生物學活性肽。本發明現在令人驚奇地顯示出可以在宿主細胞中通過分離的lantibiotic脫水酶如LanB對感興趣的肽進行脫水，所述的脫水酶因此不是常規lantibiotic酶復合物的一部分，并且這種修飾的肽可以由除了專門的lantibiotic轉運蛋白之外的蛋白質輸出系統分泌。另外，本發明顯示出在不存在(被破壞的)LanT的情況中，LanBC也可以脫水和環化。這可以通過構建如下多肽而實現，所述多肽包含感興趣的肽，在該感興趣的肽前面的lantibiotic前導肽和非lantibiotic輸出信號。本發明提供了一種編碼多肽的核酸構建體，所述多肽包含1)由非lantibiotic輸出系統識別的非lantibiotic輸出信號；2)由lantibiotic脫水酶識別的lantibiotic前導肽，以及位于所述輸出信號和所述前導肽的C末端的3)含有一或多個絲氨酸或蘇氨酸殘基的感興趣的肽，其可以在翻譯后由所述脫水酶脫水。這種構建體在包含必需的脫水酶和非lantibiotic輸出系統的宿主細胞中的表達可有利地用于具有新的生物學活性和/或改良的穩定性的經修飾的肽的重組產生。因此，與其中LanBCT復合物負責所述肽的修飾和輸出的常規lantibiotics相反，本發明表明a)LanB和LanBC獨立于BTC復合物起作用，b)所述修飾的肽可以由非-lantibiotic輸出系統輸出。這種可供選擇的輸出系統不太可能與脫水酶和環形成酶(如果存在的話)一起形成復合物。因此令人驚奇的是由lantibiotic酶識別和修飾的多肽可以靶定于非lantibiotic輸出系統。由本發明的核酸編碼的多肽包含lantibiotic前導肽，其使得所述肽可以由脫水酶并優選也由可形成羊毛硫氨酸-橋的環化酶識別。在一個實施方案中，本發明多肽中的前導肽具有可衍生自己知lantibiotic前導肽的氨基酸序列比對的lantibiotic前導共有基序。lantibiotic前導肽的氨基酸序列可得自公開的數據庫。表1A和IB示出lantibiotic前導肽的示例性比對。技術人員例如使用公共或可商購有基序。AlignX使用ClustalW算法對蛋白質和核酸序列進行多重序列對比，其示出了同源性、序列復雜性、系統樹和點陣同源性圖。AlignX接受序列的標準的、特征富集型的文本文件，如GenBank、EMBL和GenPept文件。在一個實施方案中，使用ClustalW算法從表1所示序列中衍生所述共有基序。優選前導肽共有基序衍生自至少5個、優選至少10個、更優選至少15個已知前導肽序列的比對。隨后使用本文揭示的方法核實由此獲得的共有基序的前導肽活性，即由lantibiotic脫水酶的識別及絲氨酸或蘇氨酸脫水。例如，可以使用下文實施例1的方法并加以下述的修改將進行核實的前導肽序列克隆進pNG411TPPI1中以置換乳酸鏈球菌肽前導序列。序列ITSISRASVA的脫水可以使用Maldi-TOFMS進行監測。所述前導肽共有序列可包含共有基序Xl-D/E-E-V/L-S/T-D/E-X2-E-L-D/E，其中XI是任何疏水性氨基酸，X2是任何氨基酸。例如其包含序列LEEVSEQELD。在另一個實施方案中，前導肽包含共有基序F-D/E/N-L-D-X3，其中X3是L、I或V。例如其包含序列LFDLDL或FNLDV。另一方面，針對lantibiotics變異菌肽(ChenPetal.FEMSMicrobiolLett,2001;195(2):139)、Pep5(NeisSetal.FEMSMicrobiolLett.1997;149(2):249)和乳酸鏈球菌肽(VanderMeeretal(1994)J.Bid,Chem.269，3555-3562)已經報道了一些保守的前導肽殘基對于lantibiotic生物合成是必需的，而其它殘基對于理想的生物合成速度是重要的。在--個優選的實施方案中，本發明提供的多肽包含lantibiotic的前導肽，例如選自如下一組的lantibiotic的前導肽乳酸鏈球菌肽A、乳酸鏈球菌肽Z、枯草菌素、槲皮素S、槲皮素A、鏈霉菌素、表皮素、vall-leu6-表皮素、gallidermin、變異菌肽(mutacin)1140、變異菌肽B-Ny266、變異菌肽III、變異菌肽I、pep5、epilancinK7、epicidin280、乳鏈球菌素481、variacin、變異菌肽II、鏈球菌素A-FF22、salivaricinA、lactocinS、cypemycin、植物乳桿菌菌素(plantaricin)C、actagardine、Ala(O)-actagardine、乳鏈球菌素3147A1、乳鏈球菌素3147A2、葡萄球菌素C55b、葡萄球菌素C55b、植物乳桿菌菌素Wa、植物乳桿菌菌素Wb、溶細胞素L1、溶細胞素Ls、ruminococcinA、carnocinUI49、macedocin、bovicinHJ50、nukacinISK-I、sublancin168、butyrivibriocinOR79A、肉桂霉素、耐久霧素、ancovenin、mersacidin、sapB(見表2)，或者可以通過合意的lantibiotic修飾酶對位于下游的感興趣肽迸行識別并修飾的任何這些前導肽的同系物。所述同系物示出與表1和2中示出的前導肽序列之一具有至少70%、優選至少80%、更優選至少90%，如92%、95%或者甚至98%的序列相同性。例如，所述前導肽可以是截短的或突變的lan他iotic前導肽，其仍能誘導感興趣的肽的翻譯后修飾。所述前導肽不需要具有通過lantibiotic轉運蛋白如LanT誘導轉運的能力，因為這種功能是由本發明多肽中存在的非lantibiotic輸出信號導致的。在本發明一特殊方面，所述前導肽是乳酸鏈球菌肽前導肽或者其截短或突變形式，其中在N末端的至多4個氨基酸和/或在C末端的任何1至多5個氨基酸被突變。根據本發明，位于被修飾的感興趣蛋白質中的氨基酸殘基上游的lantibiotic前導肽允許至少由lantibiotic脫水酶識別以及隨后對所述殘基的脫水。為了保證所述脫水酶確實可接近被修飾的殘基，前導序列與被修飾的殘基之間的距離應不太大。然而，前導肽與感興趣肽之間的、幾個(例如2—10個)氨基酸殘基的片段可促進所述肽的輸出。本發明的多肽包含至少由脫水酶識別的lantibiotic前導肽，由此感興趣的肽的至少一個絲氨酸或蘇氨酸殘基在包含所述脫水酶并表達所述多肽的宿主細胞中進行翻譯后脫水。如下文示出，所述脫水的多肽可以通過非lantibiotic輸出信號而被靶向宿主細胞的非lantibiotic輸出系統。一些輸出系統也是切除輸出信號的信號肽酶。在任何情況中，前導肽和輸出信號(如果存在的話)可以在分泌后從修飾的肽中被除去。根據氨基酸序列，可以用蛋白酶處理肽以除去前導肽和/或非lantibiotic輸出信號。例如，乳酸鏈球菌肽前導肽末端具有精氨酸殘基，因此可以用胰蛋白酶除去。通過改造可以在所述前導肽的C末端加入特異性切割位點，而不干擾LanB或LanC功能。在這種情況中，特別有用的蛋白酶包括凝血酶和腸激酶。可以使用的其它蛋白酶是lysC、ArgC、AspN、GluC和糜蛋白酶。也包括化學裂解，例如在甲硫氨酸殘基之后使用CNBr-切割。當然，蛋白酶或化學試劑的切割位點可以使用例如定向誘變而在本發明多肽的任何希望的位點導入。優選地，所述脫水酶是LanB或LanM，例如選自NisB、Ep舊、SpaB或PepB的脫水酶。結果，感興趣的肽中的至少一個絲氨酸或蘇氨酸殘基分別被轉變為脫水丙氨酸或脫水丁酸甘油酯(dehydrobutyrine)。在一個實施方案中，所述lantibiotic前導肽不僅由脫水酶識別，也由環化酶(LanC)識別，所述環化酶是催化脫水殘基與半胱氨酸的環化或結合的lantibiotic合成酶。優選地，所述環化酶選自NisC、EpiC、SpaC或PepC。由于感興趣的肽除了絲氨酸或蘇氨酸殘基之外還包含至少一個半胱氨酸殘基，其可以與脫水的絲氨酸或蘇氨酸殘基結合，這樣產生感興趣的含有(甲基)羊毛硫氨酸的肽。所述半胱氨酸可位于相對于所述絲氨酸或蘇氨酸殘基而言的N或C末端。優選地，所述半胱氨酸與被修飾的絲氨酸或蘇氨酸殘基間隔至多20個氨基酸，優選至多10個、更優選至多5個氨基酸。這種硫醚橋可用于賦予肽增加的(生物)穩定性，并影響所述肽的生物學活性。在一個實施方案中，所述脫水和環化步驟均在宿主細胞中進行。當然，表達多肽的宿主細胞還應含有一種環化酶，所述酶催化所述環化步驟。與脫水酶一樣，宿主細胞可天然地含有一種內源環化酶，或者所述環化酶可以通過用編碼(異源)環化酶的可表達的構建體轉化宿主細胞而表達。然而，也可以首先分離由宿主細胞脫水的肽(或者部分環化的脫水的肽的混合物)，隨后在體外誘導環形成。乳鏈球菌素M的體外環化酶活性已經由vanderDonk研究小組所證實(Xie，L.,etal.(2004)Science303，679-681;專利US2005/0164339Al,vanderDonketal)。在一個實施方案中，將脫水的肽在體外用環化酶處理。為了使所述環化酶識別分泌的、脫水的肽，優選所述肽仍包含lantibiotic前導序列。因此，如果希望脫水的肽在體外環化，則所述肽應由也編碼內部的而不是N末端前導肽序列的核酸編碼。另外，在N末端前導肽的情況中，所述前導肽在所述肽轉運后與內部輸出信號一起通過前導肽酶被切除。在另一個實施方案中，脫水的肽的環化不是通過lantibiotic環化酶方式而是通過非酶方式優選在pH8.0保溫1小吋而在細胞外進行的(Okeleyetal.2000Org.Lett.2，3603-3606;Burrageetal.2000.Chein.Eur.J.6,1455-1466)。根據本發明，本發明多肽中存在的非lantibiotic輸出信號是將肽轉運穿過宿主細胞脂質雙層的輸出系統信號。優選地，所述非lantibiotic輸出系統具有廣泛的底物特異性。由此允許輸出眾多不同的肽，包括具有(局部)限制結構如含有一或多個硫醚環的肽。在一個實施方案中，所述非lantibiotic輸出信號是Sec-依賴性分泌系統的信號。Sec(代表分泌)系統被認為是最重要的蛋白質輸出途徑，因為大多數蛋白質均使用這個系統并且其存在于迄今為止研究的所有生物體中。所述系統由一些成分組成，所述成分在大腸桿菌中已經廣泛鑒定。大腸桿菌中的Sec-系統由蛋白質SecA、SecB、SecD、SecE、SecF、SecG、SecY、YajC和YidC組成。SecA識別一個特異性N末端信號序列并將前體靶向SecYEG轉運蛋白以進行轉運。SecB是一種胞質伴侶蛋白，保持前體處于可轉運構象并與SecA的C末端相互作用。在導向和轉運步驟已經發生后，分泌的前蛋白從SecYEG孔中釋放，并通過其信號肽與細胞膜結合。I型信號肽斷SPase)是一種基本的膜結合的內肽酶，可以切除信號肽，使其釋放分泌蛋白質至其最終目的地。在本發明的一個實施方案中，一種多肽包含由Sec-系統的SecA蛋白識別的N末端信號序列，允許修飾的肽由Sec-依賴性系統輸出。本領域己知Sec-信號序列，見例如Tjalsmaetal.2000MolecularandMolecularBiologyReviews64，515-547所述。特別感興趣的是較大的、由乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)分泌的蛋白質Usp45的信號肽序列SPu^。這個信號肽包含27個殘基，通常是革蘭氏陽性菌信號肽。Usp45的N末端區域(包括SPUsp，在一些情況中包括成熟蛋白質的一些氨基酸)已經用于驅動異源蛋白質在乳酸乳球菌中的分泌，這些異源蛋白質例如a-淀粉酶、牛纖溶酶、IL-2和IL-6、Nuc、BLG、NSP4和脂肪酶(見LeLoirY，etal.ApplEnvironMicrobiol.2001;67(9):4119-27及其中引用的參考文獻)。如以下實施例所示，在包含Sec-輸出系統及脫水酶NisB的細菌宿主細胞中，編碼本發明多肽的核酸構建體的表達導致感興趣的脫水的肽的產生和分泌，其中本發明多肽包含Sec-輸出信號、乳酸鏈球菌肽前導肽和該感興趣的肽。這些數據表明通常存在于N末端的lantibiotic前導肽當并非位于N末端時也發揮作用。先前已經示出lantibiotic前導肽的較短N末端延伸不干擾lantibiotic前導肽對lantibiotic酶介導的修飾的誘導。具有枯草菌素前導肽的幾個氨基酸MDTYRYI的較短N末端延伸不干擾該前導肽誘導SpaB-介導的脫水的能力(Stein,T.&Entian，K,D.2002.Rapidcommunicationsinmassspectrometry.16，103-110)。另一出版物公開了6個組氨酸的N末端延伸(Xie,L.etal.2004.Science303,679-681)仍允許乳鏈球菌素M驅動的脫水和環化。然而，沒有預料到lantibiotic前導肽仍發揮lantibiotic酶信號功能，即作為脫水酶和環化酶及雙功能LanM酶中每一種的信號，盡管事實是其與肽的N末端由一長得多N末端序列分隔開，所述N末端序列代表允許把向非Iantibiotic輸出系統的不相關輸出信號。簡而言之，令人驚奇的是當lantibiotic前導肽存在于所述肽內部時可以發揮作用。將兩個不同的Sec-輸出信號序列置于彼此之后(Chen,H.etal.1996.J.Bacteriol.178，6658-6664)，以研究這兩個序列的偏好。隨后具有不同輸出信號序列的兩種蛋白質也已經融合在彼此之后，在這種情況中內部信號序列是有功能的(Coleman,J.etal.1985.Cell43，351-360)。已經產生了信號序列的嵌合體，所述信號序列靶向不同的轉運系統(Henry，H.etal.1997.Jf.CellBiol.136，823-832)。某些天然存在的蛋白質含有一個以上的信號序列，例如N和C末端信號序列(Gerber，L.etal.1992.J.Biol.Chem.267,12168-12173)。然而，尚未描述lantibiotic前導肽與非lantibiotic輸出信號序列的組合。在本發明另一個實施方案中，雙精氨酸轉運(TAT)系統用于輸出由lantibiotic合成酶修飾的肽。TAT系統是一種細菌蛋白質輸出途徑，具有顯著的分泌完全折疊的蛋白質的能力，輔因子的結合不抑制轉運(Halbigetal.，1999;Santinietal.,1998)。因此，TAT輸出系統可有利地用于本發明含有硫醚環的肽的輸出。TAT系統可內源地存在于宿主細胞(例如枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis))中，或者其可以在通常不含有TAT系統的宿主細胞例如乳酸乳球菌宿主細胞中異源表達。將蛋白質耙定于TAT裝置所需要的輸出信號序列(也稱作TAT前導肽)較長，而且疏水性低于Sec特異性輸出信號(Cristobaletal.1999)。TAT特異性輸出信號中疏水性區域由于較多的甘氨酸和蘇氨酸殘基的存在而明顯較短。植物和原核生物TAT特異性輸出信號的特點是均存在共有基序(S/T-R-R-X-F-L-K)(US2003/0219870和Berksetal.MolMicrobiol.2000;35(2):260)。這個序列基序位于已知和可疑TAT底物的輸出信號中的氨基末端區域/疏水性核心邊界。一或兩個精氨酸殘基的突變顯著降低蛋白質轉運的效力。在本發明的一個實施方案中，非lantibiotic輸出信號具有TAT輸出系統的特征性序列基序，其包括連續的精氨酸殘基。優選地，所述輸出信號含有上述共有序列。然而，也可以使用這個共有序列的變體，已經有報道這些變體是TAT途徑的底物(Fauiyetal.BiochimBiophysActa.2004Jun1;1699(1-2):155-62)。可用的輸出信號例如是與YwbN輸出相關的TAT前導肽。其它實例是與PhoD輸出相關的Tat前導肽(Jongbloedetal.(2004)MolecularMicrobiology54,1319-1325)及來自選自如下蛋白質的編碼基因的TAT前導肽大腸桿菌TorA、Sufi、YacK、YdhX、YdcG、WcaM、YcdB、Yael、HyaA、HybO、HybA、NapG、NrfC、YagT、YdhX、BisZ、NapA、DmsA、Yn伍、YnfF、FdnG、FdoG、YahJ、AmiA、AiC、YcdB、YedY、FhuD或Yael。所述輸出信號也可以衍生自編碼這些序列的任何同源物的基因。在一個實施方案中，本發明的多肽不僅包含TAT輸出信號，還包含已知是TAT途徑底物的蛋白質(或其片段)。如果所述TAT底物存在于感興趣的肽的上游，則其可通過沿TAT輸出系統"牽引(pullitalong)"而增強感興趣的(修飾的)肽的輸出。優選地，所述TAT信號序列及TAT底物衍生自相同的蛋白質。例如，多肽包含YwbN信號序列和其自身YwbN蛋白，隨后是前導序列和感興趣的肽。在本發明的另一方面，可以使用非lantibioticABC(ATP結合盒)型輸出系統。例如，可以使用殺菌素輸出系統如leucocinA和lactococcinA輸出系統。這些系統的輸出信號在VanBelkumetal.1997.Mol.Mic.23，1293-1301中描述。因此，可以使用多種非lantibiotic輸出信號將本發明多肽導向非lantibiotic輸出系統。所述非lantibitiotic輸出信號可位于多肽的N或C末端。然而，優選輸出信號位于lantibiotic前導序列的上游，以避免不希望的輸出信號的脫水或者干擾感興趣的肽的脫水。輸出信號的修飾可干擾經修飾的肽的輸出。因此，優選所述多肽從N末端至C末端包含l)非lantibiotic輸出信號，2)lantibiotic前導肽，及3)感興趣的肽。令人驚奇地，本發明揭示了當lantibiotic前導序列前方有非lantibiotic輸出信號時仍起作用。然而，本發明也涵蓋了其中輸出信號位于lantibiotic前導肽下游的多肽。例如，本發明提供了一種多肽，其包含乳酸鏈球菌肽前導序列，隨后是Sec信號序列及感興趣的肽。在一個實施方案中，非lantibiotic輸出信號隨后直接是lantibiotic前導肽(或者如果前導肽位于輸出信號上游也如此)。可以設想如果N末端輸出信號與lantibiotic前導肽由間隔序列分隔，這樣將增加所述多肽被修飾的機會。在這種情況中，前導序列可更易由脫水酶識別，即使所述多肽已經經過所述輸出系統也如此。因此，在另一個實施方案中，輸出信號與前導肽由一個間隔序列分隔，例如由長度為2—250個氨基酸殘基如2—50個或2—10個氨基酸的間隔序列分隔。所述間隔序列也可以更大，如200—220個氨基酸。間隔序列可包含任何氨基酸序列，例如通常在信號序列之后的一部分前原肽序列。在一個實施方案中，使用間隔序列提供具有有用的肽序列的多肽。有用的序列可編碼肽標記，其有助于多肽由宿主細胞產生和分泌后的檢測、分離或固定。這種標記為本領域所已知。熟知的例如是His-標記和Myc-標記。在一具體實施方案中，輸出信號與前導肽由編碼細胞錨(anchor)的序列分隔，所述細胞錨允許經修飾的肽在宿主細胞表面上展示。編碼細胞錨的序列為本領域所己知。例如WO02/101026揭示了AcmA型蛋白質錨序列，其使得融合蛋白可以與微生物細胞壁物質結合。細胞錨的其它實例是枯草芽孢桿菌的水解酶(Ghuysenetal.1994.FEBSLett342，23-28;Margotetal.1996.Microbiology142，3427-3444)或者葡糖胺酶(Rashidetal.1995.Microbiology141,2391-2404)的重復序列。也可以使用可以與細胞壁共價結合的LPxTG標記(Tjalsmaetal.2000MicrobiologyandMolecularBiologyReviews64,515-547)。一或多個有用的間隔序列可交替位于感興趣的肽的下游。應明了所述感興趣的肽可以是由脫水和環形成lantibiotic酶修飾的任何肽。通常，感興趣的肽被設計為這樣，其中在一或多個絲氨酸或蘇氨酸殘基翻譯后脫水之后，脫水的殘基可以與半胱氨酸結合(通過宿主細胞或者在體外)，由此形成硫醚環結構。因此，可以在所述肽中任何希望的位置導入穩定環結構。特別感興趣的是具有生物學活性的肽，例如意圖用于治療的肽，因為導入一或多個硫醚環通常增加所述肽的生物穩定性。另外，環結構可用于改變肽的生物學活性，例如受體結合親和性或酶特異性。感興趣的肽例如是激素、酶抑制劑、酶激活物、受體配體、抑制肽、lantibiotic蛋白、病毒蛋白、真核細胞(eukcaryotic)蛋白、其突變體(例如特別設計成允許在特定位置進行修飾)、模擬物、相似物或功能等同的片段。這種肽例如是抗利尿素、特利加壓素(terlipressin)、cispressin、昆蟲神經肽(allatostatin)I、血管緊張素I、anthopIeurin-A、抗炎肽I、dermaseptin、bombin-樣肽、histatin-5、indolicidin、magaininl、心房鈉尿因子、緩激肽、腦鈉尿肽、C-型鈉尿肽、血管鈉尿肽(vasonatrin)、S睡眠誘導肽、a-樹突毒素(dendrotoxin)、章魚唾腺精(eledoisin)、echistatin、a-內啡肽、卩-內啡肽、抵御素(defensin)I、分泌素、urocortin、urocortinll、小的作用于心臟的肽A和B、ceratotoxinA、cerebellin、charybdotoxin、月旦囊收縮素、conopressinG、a-conotoxinEl、corazonin、leu-腦啡肽、蛋內啡肽、催產素、exendin-3、致實驗性變應性致腦炎月太(experimentalallergicencephalitogenicpeptide)、實驗'性自身免疫性腦脊髓炎互補肽、促性腺激素釋放素II、tocinoicacid、亮丙瑞林(leupn)lide)、降鈣素、ACTH、促腎上腺皮質激素抑制肽、促腎上腺皮質激素釋放因子、促生長素抑制素、人胰腺多肽、肽XY、胰高血糖素、a-神經激肽、LHRH1和2、腦源性酸性成纖維細胞生長因子、腦源性堿性成纖維細胞生長因子、胰島素、甲狀旁腺素、纖維蛋白原結合抑制肽、成纖維細胞生長因子抑制肽、甘丙肽(galanin)、胃抑制性多肽、大胃泌素I、五肽胃泌素、轉化生長因子a、人生長激素、生長激素釋放因子、鳥苷素(guanylin)、helospectinI、細胞間粘附分子、tachyplesinI、HIV抗原性月太gpl20、HIV抗原性肽I片段(gp41)、HIV抗原性肽5、HIV蛋白酶抑制劑、胰島素樣生長因子-I、IGFII69-84、白細胞介素片段、白細胞介素II片段、leukokininI、leukopyrokinin、mastoparan、黑色素濃縮激素、蜂毒肽(melittin)、促胃動素(motilin)、神經肽Y、osteocalcin(N-乙酰-)卩內啡肽、ras原癌基因相關肽、白蛋白、紅細胞生成素及片段、阿糖苷酶、短桿菌肽A、B、C禾PS、a-半乳糖苷酶、alteplase、抗凝血酶III、抑肽酶、天冬酰胺酶、becaplermin、骨形態發生蛋白7、過氧化氫酶、cecropinB、纖維素酶、絨毛膜促性腺激素P、絨毛膜促性腺激素a、木瓜糜蛋白酶、糜蛋白酶、大內皮素、肉毒梭菌毒素A和B型、膠原、膠原酶、鏈球菌DNA酶(dornase)a、eptacoga、etanercept、exendin-4、因子VIII、因子IX、因子X、因子XIII、纖連蛋白、纖維蛋白原、filgrastim、促濾泡素(fomtropin)ou促濾泡素卩、生長激素釋放激素、垂體腺苷酸環化酶活化多肽、透明質酸酶、水蛭素II、伊米苷酶(imiglucerase)、白細胞介素2、干擾素a-4、干擾素-(3、內源因素、轉化酶、lepirudin、重組人類黃體刺激激素(lutropin)J3、溶菌酶、金屬蛋白酶抑制劑、神經垂體素運載蛋白(neurophysin)、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、血纖維蛋白溶酶原、魚精蛋白、凝血酶原、protirelin、SC3、se畫relin、鏈球菌DNA酶、鏈激酶、甲狀腺球蛋白、尿激酶、表皮生長因子、轉化生長因子、白灰制菌素(leucinostatins)、神經生長因子、glutenexorphins、pardaxin、短桿菌酪肽(tyrocidin)、肥大細胞脫粒肽、腫瘤壞死因子、RGD肽、蛙皮素(bombesin)、胸腺素、紅細胞生成素(EPO)、胸腺生成素、caerulein、dermorphin、tachikinin、cecropin、生長抑制因子、血管活性腸輔因子、urotensinI和II、使用其中存在絲氨酸/蘇氨酸及如果希望的話半胱氨酸殘基的半隨機化引物獲得的任何病毒多肽或肽。所述肽也可以是lantibiotic殺菌素(的上述突變體)、非-lantibiotic殺菌素(突變體)，例如bavaricinMN、腸球菌素(enterocin)P、mesentericinY105、pediocinPA-I、lactacinF、lactococcinG、植物乳桿菌菌素EF、植物乳桿菌菌素JK、lactococcinA、lactococcin972、植物乳桿菌菌素A、curvacinA、divercinV41、腸球菌素A、muntcidin、sakacinP、leukocinA、carnobacteriocinB2、closticin574、circuIarinA、microcinJ25、gassericinA或AS48。lantibiotic或殺菌素可包含或不包含其自身前導肽。當然，如果其除了上述lantibiotic前導肽之外還包含其自身前導肽，則由脫水酶識別的前導肽與被修飾的殘基之間的距離變得相對較大。為此，優選除去其自身前導肽，由此在整個多肽構建體中僅存在一個lantibiotic前導肽。在某些情況中，例如在自身前導肽較小的情況中，例如在circularinA、microcinJ25、gassericinA和AS48的情況中，存在另外的前導序列也許對感興趣的肽的修飾無負面影響。甚至可以認為存在不同的前導肽(例如lantibiotic前導肽以及殺菌素前導肽)是有利的，因為這樣可以進行不同的修飾酶的識別和修飾。從上文描述及下文實施例可以明了，本發明還提供了一種在宿主細胞中生產多肽的方法，所述方法包括將編碼本發明多肽的重組核酸提供給宿主細胞，使得所述宿主細胞表達和分泌編碼的多肽。為了使得感興趣的編碼的肽進行希望的脫水，所述宿主細胞應至少包含能識別編碼的前導肽并使得所述編碼的多肽脫水的脫水酶，并包含能分泌所述脫水的多肽的非lantibiotic輸出系統。所述宿主細胞可進一步包含一種環化酶，以允許在細胞內形成硫醚環。所述宿主細胞可天然地含有修飾酶(即脫水酶和/或環化酶)，或者所述宿主細胞可以具有編碼所述酶的核酸。將重組核酸提供給宿主細胞的方法為本領域所己知。見例如Sambrook,Fritsch&Maniatis(1989)MolecularCloning,AlaboratoryManual;2ndEdition.,CSHLPress所述。編碼修飾酶的基因如NisB基因，可以與編碼本發明多肽的核酸構建體一起置于單個表達質粒上。它們也可以置于兩個不同質粒上，例如置于具有不同的復制機制的質粒上。或者，將編碼修飾酶或多肽的一或兩個重組核酸導入宿主細胞的染色體中。同樣，非-lantibiotic輸出系統可內源地存在于宿主細胞中或者使用重組DNA技術提供給宿主細胞。更特別地，所述非-lantibiotic輸出系統內源地存在于宿主細胞中。根據本發明，宿主細胞可以是原核細胞或者真核細胞，如酵母。在一個實施方案中，宿主細胞是革蘭氏陽性原核細胞，如乳球菌(丄actoco"w^p)。乳球菌是革蘭氏陽性的兼性厭氧微生物。它們也被分類為乳酸菌(LAB)。在一具體方面，宿主細胞是乳酸乳球菌(丄actococcw/ac"力，先前稱作乳酸鏈球菌(5^e;tococci^/acto入例如可以使用乳酸乳球菌菌株NZ9000。在另一個實施方案中，用芽孢桿菌作為宿主細胞。例如，使用內源性含有Tat輸出系統的的枯草芽孢桿菌宿主細胞。附圖簡述圖1:NisB脫水的肽經sec系統的輸出。使pNG4HTPPI1的乳酸乳球菌NZ9000生長、對其進行誘導并進一步培養過夜，所述乳酸乳球菌含有pNGnisB和含有編碼USP信號序列后接乳酸鏈球菌肽前導序列后接編碼ITSISRASVA的序列。將培養基樣品通過MaldiTOFMS分析，示出由乳酸鏈球菌肽前導序列后接ITSISRASVA組成的未修飾的肽以及具有1、2、3和4處脫水的變體(圖1A)。為了證實1個蘇氨酸和3個絲氨酸的脫水，對肽樣品先用乙硫醇進行處理之后進行質譜分析(Maldi-TOFMS)。乙硫醇處理使得質量增加63Da(圖1B)。含有pILnisB和pNG411TPPI1的乳酸乳球菌NZ卯00導致脫水水平顯著增加(圖1C)。圖2:NisB脫水的LHRH變體經Sec系統的輸出。將黃體生成素釋放激素肽(LHRH)的兩種變體LHRH1，QHWSYGCRPG和LHRH2，QHWSYSLRCG克隆在乳酸鏈球菌肽前導序列的后面，所述前導序列位于USP信號序列的C末端。使含有pILnisB和pLP-LHRHl或pLP-LHRH2的乳酸乳球菌NZ9000在基本培養基中生長至OD0.4，誘導，培養過夜，上清通過質譜分析法進行分析。對于LHRH1，觀察到相應于附著于一次脫水的(onetimedehydrated)LHRHl的前導肽的大峰(3507Da)，及相應于未修飾的LHRH1的小峰(3528Da)(圖2A)。對于LHRH2，最顯著的峰是沒有添加半胱氨酸的未修飾的LHRH2(3572Da)或添加半胱氨酸的未修飾的LHRH2(3691Da)及一次脫水的LHRH2(3554Da)的峰。另夕卜，觀察到兩次脫水的LHRH2(3535Da)的小峰(圖2B)。圖3:NisB脫水的紅細胞生成素變體經Sec輸出系統的輸出使含有質粒pILnisB及含有質粒pLPepo(編碼Sec信號序列后接乳酸鏈球菌肽前導序列后接epo片段YASHFGPLGWVCK)的乳酸乳球菌NZ9000在基本培養基中生長至OD0.4，誘導并進一步培養過夜。對所述宿主細胞培養上清進行ZipTip(C18ZipTip,Millipore)方法(procedure)制備樣品，之后進行MaldiTOF分析。觀察到未修飾的肽(3799Da)和一次脫水的肽(3781Da)。圖4:使用內部Sec輸出信號序列經Sec輸出系統輸出多肽建立含有pILnisB及另一個質粒的乳酸乳球菌NZ9000,其中所述質粒編碼乳酸鏈球菌肽前導肽后接sec信號序列后接ITSISRASVA，在GM17培養基中生長至OD0.4，離心沉淀并再懸浮于基本培養基中，誘導并進一步培養過夜。對宿主細胞培養上清進行ZipTip(C18ZipTip,Millipore)方法制備樣品，之后進行MaldiTOF分析。圖5:乳酸鏈球菌肽前導肽在YwbN的TAT輸出信號序列之后內部發揮作用將乳酸乳球菌培養物在GM17上生長，在OD600等于0.4時誘導并進一步生長過夜。將經溶菌酶處理的細胞煮沸并進行凝膠電泳。A組用含有指示菌株LL108及胰蛋白酶的上層瓊脂對凝膠的過夜覆蓋。NZ9000pIL5BC(l);NZ卯OOpIL5BCpNGssPhoDnisA(2);NZ9000pIL5BCpNGssYwbNnisA(3);商業的乳酸鏈球菌肽(0.5嗎)(4);前乳酸鏈球菌肽(prenisin)(5)。B組用含有LU08而無胰蛋白酶的上層瓊脂覆蓋。標記(6);NZ9000pIL5BCpNGssYwbNnisA(7);乳酸鏈球菌肽(8);前乳酸鏈球菌肽(9)。圖6:使用在前乳酸鏈球菌肽的N末端TAT輸出系統分泌信號YwbN從枯草芽孢桿菌輸出前乳酸鏈球菌肽對細胞進行誘導，使培養物生長至靜止期/靜止期晚期。多肽分泌程度使用抗乳酸鏈球菌肽前導肽抗體通過Western印跡分析。泳道1:在染色體上含有nisRK的枯草芽孢桿菌；泳道2、5:含有pNGssYwbNisA的枯草芽孢桿菌；泳道3、4:含有pNGssYwbNnisA和pIL5BC的枯草芽孢桿菌。本發明通過如下實施例舉例說明。實施例1A:三肽基肽酶II的含有脫水丙氨酸的抑制性肽的產生和經See輸出系統的分泌這個實施例公開了感興趣的肽的NisB介導的脫水及分泌，所述感興趣的肽的N末端之前為乳酸鏈球菌肽lantibitiotic前導肽，所述前導肽的N末端與Sec輸出信號序列USP的C末端融合。未描述抑制性五肽的釋放。感興趣的肽的脫水通過對分泌的蛋白質進行質譜分析測定，因為每次脫水均導致分子量降低18Da。已知五肽RADhaVA(Dha是指脫水丙氨酸，即脫水的絲氨酸)抑制三肽基肽酶II(TPPII)。材料:質粒pNGnisB，衍生自pNZ8048，其中在nis啟動子之后直接是且無反向重復，所述質粒編碼lantibiotic乳酸鏈球菌肽的脫水酶NisB。在pNGnisB中，nisB基因前面沒有反向重復，這與在產生乳酸鏈球菌肽的NZ9700菌株的染色體上的情況不同。nisB基因直接在乳酸鏈球菌肽啟動子的控制下。NisB可以使與乳酸鏈球菌肽前導肽的C末端融合的肽中存在的絲氨酸和蘇氨酸脫水。質粒pNG411TPPII編碼USP信號序列(VanAsseldonketal.1990Gene95,155-160;VanAsseldonketal.1993Mol.GenGenet.240,428-434)在C末端后接乳酸鏈球菌肽前導序列后接序列ITSISRASVA。其在乳酸鏈球菌肽啟動子控制下，具有四種脫水可能性(以黑體字標示)Sec輸出信號序列-乳酸鏈球菌肽前導肽-ITSISRASVA。ITSIS是前乳酸鏈球菌肽的頭五個殘基。它們在RASVA之前以增強輸出。所述多肽的全部序列是MKKKIISAILMSTVILSAAAPLSGVYAMSTKDFNLDLVSVSKKDSGASPRITSISRASVA。注意，為了釋放RADhaVA五肽，優選的是在RASVA之前含有切割位點(例如甲硫氨酸殘基)的不同構建體。乳酸乳球菌NZ9000宿主細胞含有編碼NisRK的基因，其參與乳酸鏈球菌肽介導的乳酸鏈球菌肽啟動子的活性的誘導。實驗含有pNGnisB并含有pNG411TPPH的乳酸乳球菌NZ9000在基本培養基上生長至OD0.4(Rinketal，2005)，誘導并進一步培養過夜。對宿主細胞培養上清進行ZipTip(C18ZipTip，Milhpore)方法制備樣品。為了證實脫水，在用乙硫醇處理之后對肽樣品進行質譜分析(Maldi-TOFMS)。乙硫醇處理導致分子量增加62Da。結果對上清的分析結果示出未修飾的肽由與ITSISRASVA融合的乳酸鏈球菌肽前導肽組成，峰相應于經歷四次脫水步驟的這種肽(每次減少18Da，因為H20消失)，通過出現四個質譜分析峰而得到證實(圖1A，表3)。對脫水的肽進行乙硫醇修飾證實三次脫水，通過出現每次脫水增加45Da(—18DaH20+63Da乙硫醇)的峰而得到證實(圖1B，表3)。表3:通過NisB的脫水及通過sec系統的輸出<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>結論在沒有所有其它lantibiotic酶的情況中，當ITSISRASVA與乳酸鏈球菌肽前導序列的C末端融合時，胞內NisB使得這種肽中的絲氨酸和蘇氨酸脫水，其中所述前導序列與USP信號序列的C末端融合。另外，這種脫水的肽被輸出，之后USP信號序列被切除。USP信號序列與細胞膜保持結合。因此，lantibiotic酶修飾的肽可以通過非lantibiotic輸出系統(在本例中為sec系統)輸出。實施例IB:三肽基肽酶II的含有脫水丙氨酸的抑制性肽改進的脫水、產生和經Sec輸出系統的分泌這個實施例與實施例1A幾乎相同，但是使用與質粒pNGnisB不同的質粒pILnisB。pILnisB衍生自載體pIL253(Simon，D.,andChopin，A.(1988)Biochhnie70,559-566)。在pILnisB中，在nis啟動子與nisB之間不存在反向重復。含有pILnisB和含有pNG411TPPI1的乳酸乳球菌NZ卯00在基本培養基中生長至OD0.4，誘導并進一步培養過夜。對宿主細胞培養上清進行ZipTip(C18ZipTip,MUlipore)方法制備樣1=1叩o結果觀察到峰(乳酸鏈球菌肽前導肽的峰，所述序列C末端為ITSISRASVA序列)，其分別相應于未修飾的肽(3338Da)、一次脫水的肽(3320Da)、兩次脫水的肽(3302Da)、三次脫水的肽(3284Da)，并觀察到相應于四次脫水的肽的主峰(3266Da)(圖1C)。結論這個實施例證實NisB-脫水的肽經USP信號序歹ij(被切除)指導的sec系統的輸出，所述肽由在其C末端為ITSISEASVA肽的乳酸鏈球菌肽前導肽組成。通過雙向機制復制的pILnisB質粒與通過滾環機制復制的衍生自pNZ8048的前導構建體質粒的組合導致較高程度的NisB-介導的脫水。實施例2:前乳酸鏈球菌肽經Sec輸出系統的輸出這個實施例表明與Sec輸出信號序列的C末端結合的前乳酸鏈球菌肽的胞內NisB介導的脫水，隨后脫水的融合肽由Sec介導的分泌及Sec信號序列的裂解，使得脫水的前乳酸鏈球菌肽釋放到細胞外。實驗:構建質粒(pNG411，衍生自pNZ8048)，其編碼與前乳酸鏈球菌肽融合的USP信號序列。將含有pNGnisB和pNG411的乳酸乳球菌NZ9000誘導過夜，將細胞離心沉淀并對20ml上清進行TCA沉淀。將沉淀以小體積再懸浮，進行ZipTip方法和MaldiTOFMS。觀察到相應于未修飾的前乳酸鏈球菌肽的質量峰。另外，觀察到相應于完全脫水的前乳酸鏈球菌肽的質量峰。對樣品進行乙硫醇修飾導致相應于完全脫水的前乳酸鏈球菌肽的質量峰完全消失。這表明前乳酸鏈球菌肽在沒有NisT和NisC的情況中可以在細胞內由NisB修飾，隨后由于N末端USP信號序列而被輸出。USP信號序列在細胞外被切除。實施例3:NisB脫水的LHRH變體經sec系統的輸出在這個實施例中，證實了脫水的黃體生成素釋放激素(LHRH)變體通過sec系統從乳酸乳球菌中輸出。LHRH是具有序列pGluHWSYGLRPG-NH2的十肽。將兩種變體LHRH1，QHWSYGCRPG和LHRH2，QHWSYSLRCG克隆在乳酸鏈球菌肽前導序列之后，所述前導序列位于USP信號序列的C末端。在除去前導肽之后，即當谷氨酰胺是最N末端殘基時，谷氨酰胺可以自發地轉變為LHRH中存在的pGlu。LHRH變體1和2均可以被酰胺化。實驗含有pILnisB及pLP-LHRHl或pLP-LHRH2的乳酸乳球菌NZ9000在基本培養基中生長至OD0.4，誘導并進一步培養過夜。對宿主細胞培養上清進行ZipTip(C18ZipTip,Millipore)方法制備樣品，之后進行MaldiTOF分析。結果在培養基中檢測到仍附著有乳酸鏈球菌肽前導肽的LHRH變體。對于LHRH1(乳酸鏈球菌肽前導肽仍與其附著)，觀察到相應于一次脫水的LHRH1(3507Da)的大峰，并測得相應于未修飾的LHRHI(3528Da)的小峰(圖2A)。對于LHRH2(乳酸鏈球菌肽前導肽仍與其附著)，最顯著的是未修飾的無半胱氨酸添加(3572Da)和有半胱氨酸添加(3691Da)及一次脫水(3554Da)的峰。另外，觀察到兩次脫水的LHRH2(3535Da)的小峰(圖2B)。結論LHRH1和LHRH2可以通過NisB脫水，隨后通過sec系統從乳酸乳球菌中輸出。實施例4:NisB脫水的紅細胞生成素變體的脫水和經see系統的輸出紅細胞生成素(EPO)是一種糖蛋白激素，是骨髓中紅細胞前體的生長因子。其增加血液中的紅細胞數。合成的紅細胞生成素可作為通過重組DNA技術生產的昂貴的可注射治療劑而獲得。已知EPO的小模擬肽(參見JohnsonDL，JolliffeLK;NephrolDialTransplant.2000Sep;15(9):1274-7所述)。許多這些模擬肽含有保持肽的受體相互作用所需的構象有關的二硫鍵。在這個實施例中，形成二硫鍵的一個半胱氨酸由絲氨酸置換，因此目的在于脫水并通過脫水的絲氨酸與剩余的半胱氨酸的結合而引起硫醚鍵形成。在由pNG8048衍生的稱作pLPepo的質粒上建立含有USP信號序列后接乳酸鏈球菌肽前導肽后接EPO片段(下劃線處)的構建體。完整的序列是MKKKIISAILMSTVILSAAAPLSGVYAMSTKDFNLDLVSVSKKDSGASPRYASHFGPLGWVCK實驗將含有pILnisB及含有pLPepo的乳酸乳球菌NZ9000在基本培養基中生長至OD0.4，誘導并進一步培養過夜。將宿主細胞培養上清進行ZipTip(C18ZipTip,Millipore)方法制備樣品，之后進行MaldiTOF分析。結果MaldiTOF分析揭示了相應于無半胱氨酸添加-epo(3799Da)和有半胱氨酸添加的未修飾的前導肽-epo(3918Da)的峰，及相應于一次脫水的前導肽-印o(3781Da)的峰(圖3)。結論在不存在所有其它lantibiotic酶的情況中，當YASHFGPLGWVCK這種肽與乳酸鏈球菌肽前導肽的C末端融合(所述前導肽與USP信號序列的C末端融合)時，細胞內的NisB使得這種肽中的絲氨酸脫水。另外，這種脫水的肽被輸出，之后USP信號序列被切除。USP信號序列保持與細胞膜結合。因此，在sec系統的情況中，lantibiotic酶修飾的肽可以通過非lantibiotic輸出系統輸出。實施例5:脫水的肽經Sec系統的輸出在這個實施例中證實了當Sec信號序列存在于內部而非在N末端時，脫水的肽可以通過Sec系統從乳酸乳球菌中輸出。實驗建立含有pILnisB和另一種質粒的乳酸乳球菌NZ9000，所述另一種質粒編碼乳酸鏈球菌肽前導肽后接sec信號序列后接ITSISRASVA，在GM17培養基中生長至OD0.4，離心并重懸于基本培養基中，誘導并進一步培養過夜。對宿主細胞培養上清進行ZipTip(C18ZipTip,Millipore)方法制備樣品，之后進行MaldiTOF分析。全長肽具有如下序列MSTKDFNLDLVSVSKKDSGASP脂KKKIISAILMSTVILSAAAPLSGVYAITSISRASVA結果<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>脫水的肽可以通過Sec系統輸出。顯然，乳酸鏈球菌肽前導肽在細胞內存在于N末端及sec信號序列不在N末端的事實不消除sec信號序列的功能性。對于由乳酸鏈球菌肽前導序列-sec信號序列-ITSISRASVA組成的肽，來自Sec信號序列的C末端片段并后接ITSISRASVA的部分脫水的肽被輸出。由6個C末端Sec信號氨基酸后接ITSISRASVA組成的、經2禾n3次脫水的肽證實ITSISRASVA部分的至少兩個殘基是被脫水的，因為sec信號片段僅有一個可脫水的殘基。實施例6:當乳酸鏈球菌肽前導肽存在于TAT轉運系統的YwbN的N末端信號序列后面而在多肽內部中時，其用作經NisB和NisC修飾的信號在這個實施例中，我們證實了當前乳酸鏈球菌肽存在于TAT信號序列后面時，乳酸鏈球菌肽前導肽引發乳酸鏈球菌肽的修飾。我們使用不具有TAT輸出系統的細菌宿主細胞乳酸乳球菌。對含有修飾酶NisBC及由TAT信號序列后接前乳酸鏈球菌肽組成的多肽的乳酸乳球菌進行誘導、破壞，在凝膠上分析勻漿物。在凝膠上分離之后，將乳酸鏈球菌肽敏感的乳酸乳球菌108涂層進行及不進行胰蛋白酶處理。胰蛋白酶使得前導肽被切除，釋放活性乳酸鏈球菌肽。活性乳酸鏈球菌肽通過暈圈變為可觀察的，所述暈圈反映阻止覆蓋的乳酸乳球菌108生長的乳酸鏈球菌肽的存在。凝膠上暈圈的最高位置反映完整多肽的大小，證明在胰蛋白酶處理之前TAT信號序列仍附著于完全修飾的前乳酸鏈球菌肽。克隆將PhoD和YwbN的信號序列通過擴增克隆在nisA的前面，使用枯草芽孢桿菌的染色體DNA作為引物的模板ssPhoD.fw5'TCGGTCTCTCATGGCATACGACAGTCGTTTTGTm=63°CBsaiissPhoDrev5'AAAGTACTAGCATTTACTTCAAAGGCCCCAACCTm=66°CscaissYwbN.fw5'GCGAAGACGCCATGAGCGATGAACAGAAAAAGCCTm=63。CBpiissYwbN.rev5'AAAGTACTACGCAGTCTGAACAAGCGGTm=63°C獲得期望的168bp(ssPhoD)和132bp(ssYwbN)片段。隨后，將ssPhoD用Bsall消化，將ssYwbN用Bpl消化。將獲得的片段克隆入先用Ncol和EcoRV消化的pNG8048E中。將nisA基因用如下引物擴增前導肽引物.fWl5'TTAGTACTAAAGATTTTAACTTGGATTTGGTATCTGTm=60°C引物995'GCAATATCAGTAATTGCTTTATCAACTGCTm=63。C將獲得的135bp的片段用Seal和aflin消化，克隆進用Seal和Xbal消化的pNGssPhoD禾QpNGssYwbN中。將獲得的質粒稱作pNGssPhoDnisA和pNGssYwbNnisA。實驗乳酸乳球菌培養物在具有5.0pg/ml紅霉素(pILBC的選擇標記)和5.0|ig/ml氯霉素(pNGssPhoDnisA或pNGssYwbNnisA的選擇標記)的GM17上生長。在OD600二0.4時，將培養物用乳酸鏈球菌肽(乳酸乳球菌菌株NZ9700上清的1/1000)誘導并進一步生長。收獲靜止期晚期的細胞。將1ml細胞離心，溶解于含有溶菌酶的50pl的50mMTrispH6.8中，在55'C保溫20分鐘。加入50^的2XSB，將樣品在100。C煮沸5分鐘。取20^1樣品置于tricirie凝膠上。在電泳后，將該凝膠用水徹底洗滌以除去SDS。將該凝膠分為兩部分。一部分用含有指示菌株L1108(乳酸乳球菌pORI280，紅霉素和氯霉素敏感的)(MethodsinCellScience20,35-50)及0.01mg/ml胰蛋白酶(圖5A)的上層瓊脂覆蓋。另一部分用上層瓊脂和L1108但無胰蛋白酶覆蓋(圖5B)。將平板保溫過夜。結論顯然，當NisBC存在于YwbN信號序列的后面時能修飾前乳酸鏈球菌肽。胰蛋白酶切除乳酸鏈球菌肽前導肽，同時切除與乳酸鏈球菌肽前導肽附著的YwbN信號序列。最高暈圈的位置表明在NisBC修飾期間，YvvbN信號序列附著于前乳酸鏈球菌肽(圖5A)。將前乳酸鏈球菌肽和乳酸鏈球菌肽本身在凝膠上電泳，在較低位置產生暈圈。陰性對照組不產生暈圈，因此無其它蛋白質或肽導致暈圈形成。具有PhoD信號序列的全長肽產生較淡的暈圈(圖5A)。除了具有乳酸鏈球菌肽本身的泳道之外，在沒有胰蛋白酶的情況下未觀察到暈圈(圖5B)。實施例7A:YwbN的TAT信號序列在從枯草芽孢桿菌中輸出乳酸鏈球菌肽中的應用在這個實施例中，將YwbN的TAT信號序列克隆在前乳酸鏈球菌肽的N末端。將編碼所述多肽的序列在作為宿主細胞的枯草芽孢桿菌中表達，測定從枯草芽孢桿菌中的輸出。芽孢桿菌含有內源的TAT輸出系統。克隆及方法首先，將nisRK插入枯草芽孢桿菌168菌株(AEM70,5704-7)中。整合載體pTPnisRK通過用DNAPhusion聚合酶擴增染色體上的nisRK而構建，使用如下引物AAAGAATTCCCTGTTACTGGAGATGGAGAAGP-NisR.fwlTm=61°CEcoRIAAACCCGGGCAATTTTCAGAATCTATTCAGAAACNisKrevlTm=56°CXmal將用Xmal消化的擴增片段克隆進用Snabl和Xmal消化的pBMl中。這樣產生質粒pTPnisKK，其在芽孢桿菌中不復制。在芽孢桿菌的AmyE基因座中進行整合。芽孢桿菌轉化體對紅霉素有抗性，當其在X-gal上生長時是藍色的。通過將培養物在無紅霉素的條件下生長48小時進行切除。含有lacZ的質粒序列被切除且在AmyE基因座仍存在NisRK的那些細胞當在LacZ、Em敏感型且淀粉酶陰性的條件下生長時是白色的。隨后，建立具有染色體上的nisRKoxi、含有pNGssYwbNisA的枯草芽孢桿菌BsnisRK和含有pNGssYwbNnisA和pIL5BC的BsnisKK。pNGssYwbNnisA編碼YwbN的信號序列后接前乳酸鏈球菌肽。pIL5BC編碼NisBC。實驗使用抗乳酸鏈球菌肽前導肽抗體(J.Biol.Chem.279,22176-22182)通過Western印跡分析分泌情況。將培養物持續生長直至靜止期/靜止期晚期，將6—8ml培養物進行離心。收集上清，加入TCA至終濃度為10。/。TCA。將樣品在冰上沉淀2小時，或在4eCo/n。將沉淀溶解于lOOplMQ中。從這個溶液中取15pl，加入15pl2XSB。將20^置于tricine凝膠上。結果和結論對于含有pNGssYwbNisA的BsnisRK(圖6的泳道2、5)及含有pNGssYwbNnisA和pIL5BC的BsnisRK(圖6的泳道3、4)，預期大小的胞外肽可以通過Western印跡證實，其在無質粒的BsnisRK的上清中不存在。這個結果證實YwbN的非-lantibioticTAT信號序列指導前乳酸鏈球菌肽在不存在或存在硫醚環形成酶NisBC的條件下從枯草芽孢桿菌中的輸出。實施例7B:修飾的肽經TAT輸出系統從枯草芽孢桿菌中輸出這個實施例描述了前乳酸鏈球菌肽在枯草芽孢桿菌中的修飾和輸出。為了進一步提高修飾的多肽通過TAT系統的分泌效率，將額外的序列導入實施例7A描述的多肽中。在YwbN信號序列與乳酸鏈球菌肽前導肽序列之間，插入編碼YwbN蛋白質自身的序列。確信YwbN信號序列與YwbN"輔助序列"的組合存在可促進位于其C末端的肽的輸出。在枯草芽孢桿菌染色體中插入nisRK和nisBC。用稱作pNGYwbN-nis的質粒轉化這個菌株，該質粒編碼包含(從N末端至C末端)YwbN信號序列(非-lantibiotic輸出信號)、YwbN(輔助序列)、乳酸鏈球菌肽-前導肽(lantibiotic前導肽)和乳酸鏈球菌肽(感興趣的肽)的多肽。將含有nisRKBC和pNGYwbN-nis的建立的枯草芽孢桿菌宿主細胞在平板上生長過夜。用含有pNGnisP的誘導的乳酸乳球菌(乳酸乳球菌NZ9700上清的1/1000)覆蓋該細胞。在隨后保溫過夜后，形成暈圈，反映輸出的乳酸鏈球菌肽的釋放，其是通過NisP從YwbN和乳酸鏈球菌肽前導肽中切下的。通過將含有nisRKBC和pNGYwbN-nis的枯草芽孢桿菌生長過夜、用含有pNGnisP的乳酸乳球菌處理培養基而獲得進一步的證據。通過質譜分析法分析該培養基，以鑒別相應于完全修飾的乳酸鏈球菌肽的峰。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>表2Sap-BEpilaacin-K7Nibin-A/ZNisinQSubtilin/EricinS/-AEpidenuin/(Vall-LeuGl鄰ide加inGaUidarzninMutacin-lUO/m/ILscticia-幼1TiuDcatadLactidn-461VariacinMutacin-IIStraptococcin扁A-FP22Salivaxicin-ASublancinLactodn-SHuminococcinAButyrivibriodnOR79ABacteriocinJ46SalivaricinAJSt鄰tinBovicinHJ50Plantaricin-WdUcdciu-3147A1Staphylococcin-C85GPlantaricin.WBLacticin-3147A2Stapliylococein-C55ClCytolysin-I丄Cytolyain-LSCinnamycinSME1TKEEAMGDVEDLEEKKDNMENNNELEAQSGVETQKSDLSPQDLVSVSKKDSGASPROLVSVSKTDSGASTEMSKF加FDLDWKVSKQDSK1TPQMBAVKEKNDLPNLDVKVNAKESNDSGABPRMEAVKEKNELFDLDVKVNAKE5NDSGAEPRMSNTQIJUEVLGTErrFDVQEDLFAFDTTDTnVASNDDPDTRMEEQNSFNLLQEVTESGLDLILGALQBVTESELDULGAMTNAFQALDEVTDAELDAILGGMEKNNEVINSIQEVSLEELDQIIQAMNAMKNSKDIOJNAIEEVSEKELMEVAGGMETEKKVLDELSLHASAKMGAADVESSMNADMKNDVLTLTNPMEEKELESMMNATENQIFVETVSDQELEMUGGMKISKIEAQARKDFFKKIDTNSNLLNVNGAMNKNEIETQPVTWLEEVSDQNFDEDWGAMKSSFliEKDIETBQVTWFEEVSEQEFDDDIKiAMTKTSRRKNAIANYLEPVDEKSINBSPGAGDPEARMKEKNMKKNDTIELQLGKYLEnDMIELAEGDESHGGMKNELGKFLEENELELGKFSESDMLEITDDEVY八AMENLSWPSFEELSVETSMEAIQGSGDVQAEMLNKENQENYYSNKLELVGPSFEELSLEEMEAIQGSGDVQAEMTASILQQSWDADFRAALLENPAAFGAaAAALPTPVKAQDQASLDPWTKDIAATEAFAMSQEAflRSWKDPFSRENSTQNPAGNPFSELKEAQMDKLVGAGDNEA權利要求1.一種編碼多肽的核酸構建體，所述多肽包含1)非lantibiotic輸出信號，其由非lantibiotic輸出系統識別；2)lantibiotic前導肽，其由至少一種lantibiotic脫水酶識別，以及位于所述輸出信號和所述前導肽的C末端的3)感興趣的肽，其含有一或多個絲氨酸或蘇氨酸殘基的，可以由所述脫水酶進行翻譯后脫水。2.權利要求1的核酸，其中所述lantibiotic前導肽使得由LanB或LanM脫水酶識別成為可能。3.權利要求1或2的核酸，其中所述感興趣的蛋白質進一步包含至少一個半胱氨酸殘基，該半胱氨酸殘基可以與脫水的絲氨酸或蘇氨酸殘基以酶促或化學的方式結合。4、權利要求3的核酸，其中所述lantibiotic前導肽進一步使得由lantibiotic環化酶、優選由LanC或LanM識別成為可能。5.權利要求3或4的核酸，其中所述至少一個半胱氨酸殘基與所述絲氨酸或蘇氨酸殘基通過至少0—30個氨基酸殘基，優選0—20個殘基，更優選2—6個殘基分隔。6.權利要求5的核酸，其包含共有基序序列Xl-D/E-E-V/L-S/T-D/E-X2-E-L-D/E,其中XI是任何疏水性氨基酸，X2是任何氨基酸；或者其包含共有基序序列F-D/E/N-L-D-X3，其中X3是L、I或V。7.權利要求1—6任一項的核酸，其中所述lantibiotic前導肽包含可衍生自表1所示序列比對的共有基序。8.權利要求1—7任一項的核酸，其中所述lantibiotic前導肽是選自如下lantibiotic的前導肽乳酸鏈球菌肽A、乳酸鏈球菌肽Z、枯草菌素、槲皮素S、槲皮素A、鏈霉菌素、表皮素、vall-leu6-表皮素、gallidermin、變異菌肽1140、變異菌肽B-Ny266、變異菌肽III、變異菌肽1、pep5、epilancinK7、印icidin280、乳鏈球菌素481、variacin、變異菌肽II、鏈球菌素A-FP22、salivaricinA、lactocinS、cypemycin、禾直物乳桿菌菌素C、actagardine、Ala(O)-actagardine、乳鏈球菌素3147Al、乳鏈球菌素3147A2、葡萄球菌素C55a、葡萄球菌素C55b、植物乳桿菌菌素Wa、植物乳桿菌菌素Wb、溶細胞素Ll、溶細胞素Ls、ruminococcinA、carnocinU149、macedocin、bovicinHJ50、nukacinISK-I、sublancin168、butyrivibriocinOR79A、肉桂霉素、而寸久霉素、ancovenin、mersacidin、sapB(見表2)，或者至少由lantibiotic脫水酶識別的上述物質的功能性衍生物。9.權利要求l一8任一項的核酸，其中所述非lantibiotic輸出信號是具有廣泛底物特異性的蛋白質轉運系統的信號。10.權利要求l一9任一項的核酸，其中所述非lantibiotic輸出信號是選自如下一組的轉運系統的信號Sec-依賴性分泌系統，雙-精氨酸轉運(TAT)系統和非-lantibioticABC轉運系統。11.權利要求1一10任一項的核酸，其中所述非-lantibiotic輸出信號位于lantibiotic前導肽的N或C末端。12.權利要求1—11任一項的核酸，其中所述非-lantibiotic輸出信號和所述lantibiotic前導肽由間隔序列分隔，優選編碼長度為2—250個氨基酸的間隔序列。13.權利要求12的核酸，其中所述間隔序列允許所述多肽的分離、固定或純化。14.權利要求1一13任一項的核酸，其中所述感興趣的肽選自如下一組生物活性肽，激素，酶，抑制蛋白質，治療蛋白質，lantibiotic蛋白質，病毒蛋白質，或這些蛋白質的突變體或功能相等物。15.宿主細胞，其具有權利要求1一14任一項的核酸。16.權利要求15的宿主細胞，其中所述宿主細胞是原核細胞或真核細胞，優選是革蘭氏陽性原核細胞，更優選是乳球菌(L^tococa^鄉.)或芽孢桿菌(5acz'腸17.—種在宿主細胞中生產多肽的方法，包括提供權利要求15或16的宿主細胞，允許所述宿主細胞表達和分泌編碼的多肽，其中所述宿主細胞至少包含能修飾所編碼多肽的lantibiotic脫水酶和能分泌所述經修飾的多肽的非-lantibiotic輸出系統。18.權利要求17的方法，其中所述宿主細胞進一步包含lantibiotic環化酶，其允許在所述宿主細胞中產生包含硫醚環的感興趣的肽。全文摘要本發明涉及在重組宿主細胞中生產異源多肽。更特別地，本發明涉及由一或多種lantibiotic合成酶修飾的肽如生物學活性肽的產生和分泌。本發明提供了一種編碼多肽的核酸構建體，所述多肽包含1)由非lantibiotic輸出系統識別的非lantibiotic輸出信號，2)至少由lantibiotic脫水酶如LanB識別的lantibiotic前導肽，以及在所述輸出信號和所述前導肽的C末端的3)含有一或多個絲氨酸或蘇氨酸殘基的感興趣的肽，其可以通過所述脫水酶進行翻譯后脫水。本發明還提供了一種在宿主細胞中生產多肽的方法，包括提供具有本發明核酸構建體的宿主細胞，使得所述宿主細胞表達和分泌所編碼的多肽，其中所述宿主細胞包含能修飾所述編碼的多肽的至少一種脫水酶及能分泌所述經修飾多肽的非lantibiotic輸出系統。文檔編號C12P21/02GK101115838SQ200580047868公開日2008年1月30日申請日期2005年12月7日優先權日2004年12月7日發明者A·J·M·德里森,A·奎珀爾斯,G·N·莫爾,O·P·奎珀爾斯,R·林克申請人:應用超微系統股份有限公司