專利名稱：使用編碼和分泌glp-1肽或其類似物的封裝細胞治療急性心肌梗死(ami)的制作方法
技術領域：
本申請涉及編碼和分泌GLP-1、其片段或變體或者包含GLP-I或其片段或變體的 融合肽的細胞(諸如間充質干細胞或間充質基質細胞或任何另外的合適細胞)在治療急性 心肌梗死(AMI或MI)中的應用，其中將編碼和分泌GLP-1、其片段或變體或者包含GLP-I 或其片段或變體的融合肽的細胞封裝在(球形)微囊中以防止待治療患者的免疫系統的反 應。本申請還涉及這些(球形)微囊或者含有這些細胞或(球形)微囊的藥物組合物在治 療急性心肌梗死(AMI或MI)中的應用。
背景技術：
急性心肌梗死(AMI或MI)，更經常稱為心臟病發作，是在對心臟的一部分的血液 供應中斷(最通常是由于易損斑塊的破裂引起)時發生的常見醫學疾病。所導致的缺血或 缺氧引起心臟組織的損傷和可能的死亡。AMI是醫療緊急事件，并且是全世界男性和女性死 亡的主要原因(參見例如，The World Health Report 2004-Changing History (PDF)，世界 衛生組織，120-4，ISBN 92-4-156265-X)。重要的風險因素是諸如動脈粥樣硬化性冠心病和 /或心絞痛等血管疾病的既往史、既往的心臟病發作或中風、心率失常或昏厥的任何既往事 件、較高的年齡(特別是男性超過40歲和女性超過50歲)、吸煙、過度飲酒、某些藥物的濫 用、高甘油三酯水平、高LDL( “低密度脂蛋白”)和低HDL( “高密度脂蛋白”)、糖尿病、高血 壓、肥胖和某些人的長期高水平的壓力。心肌梗死是缺血性心臟病的常見表現。2002年據WHO估計，全世界12. 6%的死亡 由缺血性心臟病引起(參見，例如，The World Health Report 2004，出處同上)。在發達 國家中缺血性心臟病是死亡的主要原因，而在發展中國家中次于AIDS和下呼吸道感染居 第三位(參見例如2006年12月7日檢索的加利福尼亞大學圣塔克魯茲分校Center for Global, International and Regional Studies (CGIRS)的 Cause of Death-UC Atlas ot Global Inequality)。在美國，心臟疾病是死亡的主要原因，造成的死亡率甚至比癌(惡性贅生物)還 高(參見例如2007年4月17日檢索的國家衛生統計中心的“Deaths and percentage of total death for the 10 leading causes of death United States"2002-2003)。在美 國冠心病是五分之一死亡的原因。大約7，200, 000名男性和6，000, 000名女性帶有某種形 式的冠心病生存。每年有1，200, 000人經受(新得的或復發的)冠心病發作，并且他們中 的約40%由于發作而死亡(參見例如2006年12月7日檢索的Heart Attack and Angina Statistics, American Heart Association (2003))。這意味著約每 65 秒，即有一名美國人 死于冠心病事件。預期在歐洲有類似的統計資料。疑似急性心肌梗死的即時治療通常包括氧、阿司匹林、三硝酸甘油酯和疼痛緩解， 通常使用硫酸嗎啡進行疼痛緩解。患者通常接受諸如心電圖(ECG、EKG)、胸部X射線和血 液測試等許多診斷測試，來檢測較高的肌酸激酶水平或肌鈣蛋白水平(肌酸激酶和肌鈣蛋白是由受損組織，特別是心肌釋放的化學標記物)。另外的治療可以包括分解阻斷血液流 向心臟的血塊的藥物治療，或者通過對受阻冠狀動脈的擴張或旁路手術來機械性地恢復流 動。冠心病監護單元收治(Coronary care unit admission)允許對諸如心率異常等并發 癥進行快速安全的治療。AMI是一種急性冠心綜合征，最通常是(但不是總是)冠狀動脈病的表現。最常見 的觸發事件是心外膜冠狀動脈中粥樣硬化斑塊的破裂，這導致凝血級聯，有時引起動脈的 完全阻塞。動脈粥樣硬化是斑塊狀膽固醇和纖維狀組織在動脈(本案情況下是冠狀動脈) 壁上的逐漸累積，通常累積數十年。血管造影中可見的血流柱不規則反映了作為數十年動 脈粥樣硬化發展結果的動脈腔變窄。斑塊可以變得不穩定，破裂，并且另外通常在數分鐘之 內升級成阻塞動脈的血栓(血塊)。當冠狀脈管系統中出現嚴重的斑塊破裂時，可能導致心 肌梗死，并通常導致下游心肌的壞死。如果血液到心臟的流動減弱持續足夠長，則觸發了稱為缺血級聯的過程，該過程 中心臟細胞通常會死亡(特別由壞死引起)并且不會重新生長。在該位置形成膠原疤 痕。最近的研究表明，凋亡在心肌梗死后的組織損傷過程中可能也起作用(參見Krijnen PA, Nijmeijer R, Meijer CJ, Visser CA, Hack CE, Niessen HW. (2002). “Apoptosis in myocardial ischaemia and infarction". J Clin Pathol 55(11) :801-11.PMID 12401816)。結果，患者的心臟可能永久性地受到損傷。缺血級聯中形成的疤痕組織還給患 者帶來可能威脅生命的心律失常的風險。減少該隨后的組織損傷的治療，對于改善AMI后 心臟的功能具有顯著益處并改善長期的患者結果。目前，在將干細胞治療用于使MI后的心肌再生方面有大量的大型研究。心肌梗死 后通過左心室心肌內植入源自其自身骨髓的干細胞而接受干細胞治療的患者顯示左心室 射血分數和舒張期末容積的改善，這在使用安慰劑時未看到。開始的梗死面積越大，注入 (infusion)的效果越明顯。但是，尚未建立合適的治療。正在進行作為ST升高MI的治療 方法的祖細胞注入的臨床試驗(參見例如khachinger V,Erbs S,Elsasser A,Haberbosch W,Hambrecht R,Holschermann H,Yu J,Corti R,Mathey DG,Hamm Cff,Suselbeck T,Assmus B, Tonn T, Dimmeler S, Zeiher AM ；REPAIR-AMI Investigators(2006), “Intracoronary bone marrow-derived progenitor cells in acute myocardial infarction，，，N Engl J Med 355(12) :1210-21, PMID 16990384.)。除此處的干細胞方法之外，對于治療AMI或MI目前存在至少三種生物材料和組織 工程化方法。但是，這些方法處于醫學研究的早期階段，所以在基于這些方法建立合適的治 療之前需要解決許多問題和要點。該領域中第一種令人感興趣的方法涉及預防心力衰竭的聚合性左心室約束器 (left ventricular restraint) 0第二種方法利用體外工程化的心臟組織，隨后將該心臟 組織植入體內。另一種方法需要將細胞和/或支架注入心肌以原位形成工程化的心臟組織(參 見例如 Christman KL, Lee RJ. "Biomaterials for the Treatment of miocardial infarction". J Am Coll Cardiol 2006 ；48 (5) :907-13. PMJD 16949479)。該方法的變形 是注入細胞以產生會有助于保護AMI或MI后的心肌(例如，通過阻止心肌細胞進行凋亡) 的因子。在最后這種方法中，已經顯示胰高血糖素樣肽-I(GLP-I)提供某些非常有前景的效果，可以利用其治療AMI或Ml。以該方法進行的許多最近的研究已經表明，胰高血糖素 樣肽-I(GLP-I)是最強效的腸降血糖素激素之一，對缺血衰竭的心臟具有潛在的有益作 用(參見 Bose AK, Mocanu MM, Carr RD, Yellon DM, Myocardial ischaemia-reperfusion injury is attenuated by intact glucagon like peptide-1(GLP-I) in the in vitro rat heart and may involve the p70s6K pathway. Cardiovasc Drugs Ther. 2007 Aug ； 21(4) :253-6 ；禾口 Nikolaidis LA, Mankad S, Sokos GG, Miske G, Shah A, Elahi D, Shannon RP. Effects of glucagon-like peptide-1 in patients with acute myocardial infarction and left ventricular dysfunction after successful reperfusion, Circulation,2004Mar 2,109(8) :962-5)。GLP-I位于胰高血糖素基因上，胰高血糖素基因是深入研究過的基因(參見例如 White, J. W.等，1986 Nucleic Acid Res. 14 (12) 4719-4730)。作為高分子量前體分子的前 原胰高血糖素(pr印roglucagon)分子在胰腺α細胞中和在空腸及結腸L細胞中合成。前 原胰高血糖素是長度為180個氨基酸的激素原，其序列除了含有胰高血糖素之外，還含有 相關結構的兩個序列胰高血糖素樣肽-I(GLP-I)和胰高血糖素樣肽-2(GLP-2)。在前原胰 高血糖素分子中，GLP-I和GLP-2之間是17個氨基酸的肽序列(更確切地說是15個氨基酸 的序列加上C末端RR切割位點)，即插入肽2 (intervening ρ印tide，IP2)。IP2序列(在前 體分子中位于GLP-I和GLP-2之間)正常情況下在GLP-I的第37位氨基酸后進行蛋白水解 切割。因此取決于細胞和環境，前原胰高血糖素分子切割成各種肽，包括GLP-I (1-37)，其未 加工形式的37個氨基酸的肽。通常而言，該加工發生在胰腺和腸中。GLP-I (1-37)序列可以 被進一步蛋白水解加工成為31個氨基酸的加工形式的活性GLP-I (7-37)，或GLP-I (7-36) 酰胺。因此，名稱GLP-I (7-37)表示所討論的片段包括當從親本肽GLP-I的N末端計數時， 第7 37位的氨基酸殘基。GLP-I是一種消化道激素，并且是最有效的內源性促胰島素劑，具有的作用包括刺 激β細胞中的腺苷酸環化酶和蛋白激酶活性。生理學上，其與來自上消化道的胃抑制性肽 一起充當降低血糖水平的腸降血糖素激素。因此，響應于食物攝入而分泌的GLP-I對例如 胃部、肝、胰腺和腦具有多種作用，這些作用共同起作用來調控血糖。因此，胰高血糖素樣肽 GLP-I (7-36)酰胺，及其未酰胺化類似物GLP-I (7-37)由于其對碳水化合物代謝的有效作 用和其對治療包括2型糖尿病在內的糖尿病的潛在應用，而相當引人注意。另外，GLP-I已經對治療急性心肌梗死(AMI)或心肌梗死(MI)顯示出有前景的效 果。如此處所述，GLP-I是天然存在的腸降血糖素，兼有無需伴隨葡萄糖輸注即可刺激葡萄 糖吸收的促胰島素性和胰島素模擬性。Nikolaidis等(參見Nikolaidis等，2004，出處同 上)發現，當將其加入標準治療時，GLP-I輸注改善患有AMI和嚴重心臟收縮障礙的患者在 成功地進行直接血管成形術(primary angioplasty)后的局部和綜合LV功能。早期研究中，對10名患有AMI并且LV分數(EF) < 40%的患者，在確定了與11名 對照患者相比成功地進行直接血管成形術后，在背景治療中增加的72小時GLP-I輸注(每 分鐘1. 5 μ g/kg)期間測試GLP-I施用的安全性和功效(參見Nikolaidis等，Circulation 2004，109 ；962-965)。在這些實驗的情況下，認為GLP-I的優點在于與AMI位置或糖尿病 史無關。因此，當在標準治療中增加GLP-I輸注時，似乎改善患有AMI和嚴重的心臟收縮 障礙的患者在成功地進行直接血管成形術后的局部和綜合LV功能(參見Nikolaidis等，Circulation 2004，出處同上)。Nikolaidis等還假設GLP-1可促進缺血事件后從心肌 頓抑的恢復。在實驗狗模型中，在左心室冠狀動脈阻塞10分鐘，然后進行M小時再灌注 時施用GLP-1。在這些實驗中，GLP-I的施用引起促胰島素作用，但不會引起高血糖(參 JAL Nikolaidis Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, January 2005,312(1)，第 303-8 頁)。根據另一方法，對體內GLP-I，特別是GLP-I (7-36)的作用，使用諸如纈氨酸吡咯 烷(VP)等DPP-IV抑制劑作為防止其降解的手段進行研究(參見Bose等，Diabetes，^卷， 2005年 1 月，和Bose等，Cardiovascular Drugs and Therapy，2007年8 月，21 (4)，第 253-6 頁)。天然GLP-1，特別是GLP-I (7_36)，在體內經歷的半衰期短。其在第8位和第9位 殘基之間被DPP-IV在數分鐘內于血漿中快速降解，產生失活的NH2-末端截短的代謝物 GLP-I (9-36)。在這種情況下，認為在體內心臟模型中GLP-I和VP保護心肌免受缺血性再 灌注損傷，證明與VP或鹽水組相比梗死的顯著降低。在對應的體外研究中，使用GLP-I和 VP治療的那些心臟再次證明與對照和VP組相比梗塞面積顯著減少(也參見Bose等，2005 和2007，出處同上)。另外的數據顯示，GLP-I可以通過直接抑制表達GLP-I受體的靶細胞的凋亡或可 能通過激活諸如促存活信號傳導途徑等存活因子而發揮對心臟的直接保護作用(也參見 Bose等，Diabetes，第M卷，2005年1月)。在該情況下，GLP-I的主要靶標是胰島，其中該 激素刺激胰島素分泌，促進β細胞增殖和再生，并且抑制胰高血糖素分泌。但是，GLP-I受 體也在胰島外部表達，證實了 GLP-I還在其它器官中起作用的可能性(參見Ahren B.等， Hormones et metabolisme，2004 年 12 月，36 (11-12)，第 842-5 頁)。再灌注中GLP-I顯示以與胰島素類似地程度增強左心室(LV)功能、心肌葡萄糖 吸收以及GLUT-I和GLUT-4易位。但是，有利地是，與胰島素相反，GLP-I的促胰島素作用 取決于環境葡萄糖濃度，減少了低血糖的風險。GLP-I還顯示對正常心臟具有直接作用， 減少收縮性，但是與胰島素的作用不同的是，GLP-I通過非Akt-I依賴性機制增加了心肌 ^f 11111 .( Tingcun Zhao 等,The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics，第 317(3)卷，第 1106-1113 頁；No. 3,2006)。GLP-I還顯示改善患有急性心肌梗死和左心室功能障礙的患者中的左心室(LV) 功能。另外GLP-I促進β細胞中磷脂酰肌醇3激酶(ΡΙ3Κ)的活性。該激酶與缺血/再 灌注損傷以及心肌預處理背景下的心肌保護明顯相關(參見Bose等，0化1^切8，第討卷， 2005 ￥ 1 月；禾口 Tingcuri Zhao 等,The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics，第 317 卷，第 1106-1113 頁；No. 3,2006)。同的 ^去，Huisamen ^ ( #JAL Huisamen Cardiovascular Journal of Africa (South Africa)，2008 年 3 4 月，19 O)，第 77-83 頁)顯示，當得到 DPP-IV 抑制 劑VP存在的支持時，GLP-I具有梗塞-免除作用(infarct-sparing effect) 0在含氧量正 常的條件下GLP-I不能直接激活心臟或心肌細胞中的Akt (也稱為蛋白激酶B)或胞外調控 的激酶Erkl/2，但是AMP-激活的激酶(AMPK)在Thr (172)上的磷酸化得到增強。另外，糖 酵解酶磷酸果糖激酶-2被劑量依賴性地激活。缺血后再灌注過程中，PKB/Akt和AMPK的 磷酸化的調控比較明顯。因此GLP-I似乎通過增強糖解而直接保護心臟防止低流量缺血。
但是，如本文已經描述的那樣由于天然GLP-I在體內被DPP-IV快速降解，天然 GLP-I的使用在體內引起某些問題。另外，GLP-I經過腎排泄。這些因素引起以下問題: GLP-I (7-36)和NH2-末端截短代謝物GLP-I (9-36)中的哪一種肽是體內的活性部分，以及 在治療應用中生理作用是否通過天然GLP-I或其片段而得以發揮。由于GLP-I在體內的快速降解，認為GLP-I僅對于諸如可能用于患有急性心肌 梗死、冠狀手術(coronary surgery)、腦血管事件或敗血癥的患者的重癥監護病房等短期 代謝控制是合適的工具。對于更長期的代謝控制，提出了諸如GLP-I受體的激動劑等腸 降血糖素模擬物(參見例如 Nauck Μ. A.，Nov-Hormones et metabolisme，2004 年 12 月， 36(11-12)，第 852-8 頁)。但是，不考慮其在體內的快速降解的話，GLP-I作為治療冠心病，特別是治療AMI 或MI的潛在藥物，似乎提供了良好的基礎。因此進行了各種嘗試來合成天然存在的GLP-1(GLP-1 (7-37))的(針對DPP-IV 而)穩定化的類似物。特別地，將第8位殘基(在體內為Ala)用諸如Gly、Ser或Thr等 另一殘基置換(Burcelin, R.等(1999)Metabolism 48,252-258) 已經對作為合成分子 的或由經基因工程化以分泌突變多肽的細胞系產生的GlyS或G8類似物進行了深入試驗 (Burcelin，R.，等(1999),Annals of the New York Academy of Sciences 875:277-285)。 向GLP-I (7-37)中引入各種其它修飾來增強其體內穩定性，并且不會損害其生物活性。但 是，所有這些方法由于涉及的相當大的問題而未實現任何治療顯著效果。然而，這些方法都不能夠長期在體內提供GLP-1。這是由于本文所討論的蛋白水解 性降解，由于GLP-I代謝和體內通常出現的正常蛋白降解。因此，目前，需要GLP-I的患者 在較長的時期中，即只要其罹患這種待治療的疾病，或更糟的是，終其一生，都不得不接受 一劑量或甚至多劑量的GLP-I或其類似物或變體。在該時期內，由于GLP-I在體內的半衰期 較短，通常在較短的間隔內就要進行施用。另外，必須通過醫師或通過患者自己施用GLP-I 的劑量。這代表了對患者和環境的主要挑戰和負擔。為了克服該問題，可以通過對患者提 供含有編碼和表達GLP-I的核酸的細胞來施用GLP-I。所述細胞的植入會確保較長期地在 體內提供GLP-I，并且由于由移植細胞分泌GLP-I，所述植入在目的位置處直接提供GLP-I。WO 99/53064公開了這樣一種策略形成多聚體GLP-I表達盒，該多聚體GLP-I表 達盒可以引入至作為公眾可獲得的永生化細胞系的各種細胞類型中，并使原代細胞培養物 分裂。實例包括來自哺乳動物的CNS的EGF-響應性神經球、bFGF-響應性神經祖干細胞， 而工作實例使用幼倉鼠腎(BHK)細胞。據稱所植入的轉染細胞已經成功地用于治療糖尿病 小鼠，使得將葡萄糖控制到基本上等同于非糖尿病對照。但是，這種植入技術不符合用于例 如糖尿病患者或已經成功地用于AMI或MI患者的常規治療的要求。另外，本領域已知，免疫系統通常識別外源細胞并且觸發免疫應答，從而保護生物 體免受所述外部物質的影響。因此能夠表達GLP-I或其任何變體或衍生物的細胞的植入可 以引起生物體中的免疫應答。治療中所述防御性應答可以引起相當大的不期望的副作用， 并且可能引起受治療生物體的嚴重并發癥，或甚至死亡。克服該問題的一種策略可以是使用自體細胞，即源自患者自身的細胞，將其遺傳 上改變為瞬時表達GLP-I，特別是GLP-I (7-36)。但是，所述方法通常限于特定患者的細胞， 并且需要在使用之前于實驗室中長期制備。但是，AMI或MI需要在心肌梗死后的數分鐘或數小時內進行治療，即短時間提供有效的藥物。總之，目前本領域不能獲得有效的AMI或MI治療，該有效的AMI或MI治療允許在 待治療的患者中發生心肌梗死之后立即提供有效的治療。換言之，現有技術不能提供反映 GLP-I已知的全部有益效果的治療，所述有益效果例如GLP-I活性強烈減少由缺血或缺氧 引起的損傷和心臟組織的可能死亡，而不需要重復地施用GLP-I肽，和/或沒有針對例如植 入的表達GLP-I的同種異體細胞的不期望的免疫應答的風險。
發明內容
因此，本發明的目的在于提供使用GLP-I類肽分子或其類似物對AMI或MI的有 效治療，所述GLP-I類肽分子或其類似物在體內長期具有生物活性，而不需要重復地施用 GLP-I肽和/或沒有引起不期望的免疫應答的風險。通過所附權利要求，特別是通過利用諸如間充質干細胞或間充質基質細胞或可用 于本發明情況的任何另外的細胞等編碼和分泌GLP-1、其片段或變體或者包含GLP-I或其 片段或變體的融合肽的細胞來治療AMI或MI或者與它們相關的疾病，從而解決本發明的目 的，其中將所述編碼和分泌GLP-1、其片段或變體或者包含GLP-I或其片段或變體的融合肽 的細胞封裝在(球形)微囊中以防止所治療患者的免疫系統的應答。在本發明的情況下，術 語“編碼...的細胞”通常是指“經工程化而含有編碼...的核酸的細胞或包含編碼...的 核酸的細胞”。優選將用于治療AMI或MI或者與它們相關的疾病的編碼和分泌GLP-1、其片段或 變體或者包含GLP-I肽或其片段或變體的融合肽的用于提供本文所述的發明方案的細胞， 封裝在(球形)微囊中以防止所治療患者的免疫系統的應答。在本發明的情況下，所述(球 形)微囊優選包含(球形)核(即所述核可以是球形或不是球形)和至少一個表面涂布層， 其中 所述(球形)核包含交聯聚合物(的混合物)和本文定義的編碼和分泌GLP-1、 其片段或變體或者包含GLP-I或其片段或變體的融合肽的細胞，或由交聯聚合物(或混合 物)和本文定義的編碼和分泌GLP-I、其片段或變體或者包含GLP-I或其片段或變體的融合 肽的細胞組成，所述細胞例如間充質干細胞或間充質基質細胞或可用于本發明的任何另外 的細胞(類型)；和·所述至少一個表面涂布層包含通常交聯的聚合物(的混合物)或由通常交聯的 聚合物(的混合物)組成。本文定義的包含編碼和分泌GLP-1、其片段或變體或者包含GLP-I或其片段或變 體的融合肽的本文所用細胞的(球形)微囊，通常包括一粒徑，本文稱之為(球形)微囊的 總直徑。通常而言，本文所用的(球形)微囊的總直徑可以根據具體的治療和施用模式而 有較大變化。在本發明的情況下，通常通過將本文所用的(球形)微囊經由例如注射或植 入施用至特定的施用位置中，從而局部地進行治療。因此，施用模式可以使本文所用的(球 形)微囊的總直徑受例如注射套管的直徑的限制。本文所用的(球形)微囊的總直徑進一 步由(球形)微囊的核的直徑和所述至少一個表面涂布層的厚度確定，因為兩個直徑通常 至少部分相互依賴，并且當然會影響(球形)微囊的總直徑。為了治療本文所定義的AMI或MI疾病和與它們相關的疾病，本申請的發明人驚奇地發現，可以使用的(球形)微囊的總直徑(粒徑)為約120 μ m 約800 μ m，優選 為約120 μ m 約700 μ m,更優選總直徑為約150 μ m 約650 μ m,還更優選總直徑為約 165 μ m 約600 μ m。特別地，對于治療AMI或MI有利的(球形)微囊的總直徑(粒徑) 為約120 μ m 約300 μ m，更優選總直徑為約150 μ m 約250 μ m，還更優選總直徑為約 165 μ m 約225 μ m，最優選總直徑為約180 μ m 約200 μ m，例如為約180μπι、185μπι、 190 μ m或200 μ m。包括所述總直徑的(球形)微囊通常會保持在所選注射位置的心肌中， 不會遷移到周圍組織中。這使得在治療期間在注射位置處提供的GLP-I和/或其變體或衍 生物的連續表達時間足夠長，從而提供GLP-I已知的全部有益效果，例如其強烈減少由缺 血或缺氧引起的損傷和心臟組織的可能死亡的活性。在本文情況下，術語“球形”以其最寬泛的意義理解。球形顆粒優選理解成具有類 似球的形狀，由此該形狀可以是對稱或不對稱的，例如(球形)微囊和/或其核可以具有橢 球形狀。在次佳實施方式中本發明所用的微囊或核可以不是本文意義內的球形，但是可以 具有任意形狀，例如在微囊表面上具有突出或凹進部分。在本公開中無論何處提及“球形” 微囊或核，同樣也可以提供、制備或使用“非球形”微囊或核。本文定義的(球形)微囊優選包含(球形)核(即，所述核可以是球形或不是球 形)，其中所述(球形)核包含交聯聚合物(的混合物)以及編碼和分泌GLP-1、其片段或 變體或者包含GLP-I或其片段或變體的融合肽的細胞，或由交聯聚合物(或混合物)和編 碼和分泌GLP-1、其片段或變體或者包含GLP-I或其片段或變體的融合肽的細胞組成，以用 于治療本文定義的AMI或MI疾病，或者與它們相關的疾病，所述細胞例如為間充質干細胞 或間充質基質細胞或可用于本發明情況的任何其它細胞(類型)。在本發明的情況下，(球形)微囊的(球形)核的通常交聯的聚合物形成其空穴中 包埋細胞的支架結構，所述細胞例如為間充質干細胞或間充質基質細胞或可用于本發明情 況的任何其它細胞(類型)。可以將這些細胞單獨或通常作為聚集體包埋在支架結構中，例 如作為約10個細胞 約10,000個細胞，例如約10個細胞 約500個細胞、約10個細胞 約1，000個細胞或約10個細胞 約10，000個細胞、更優選10個細胞 約100個細胞或10 個細胞 約1000個細胞的聚集細胞(的庫)。優選的是，(球形)核包含均勻分布的交聯 聚合物和均勻分布的本文定義的包埋細胞。優選的是，根據下述方法制備包括支架結構和 本文定義的包埋細胞的核。在該情況下，極為重要的是當制備根據本發明使用的(球形) 微囊時，將(球形)微囊的封裝細胞，例如間充質干細胞或間充質基質細胞、自體細胞或可 用于本發明情況的任何其它細胞(類型)完全包埋在聚合物基質中。包埋細胞，例如間充質干細胞或間充質基質細胞或可用于本發明情況的(球形) 微囊的本文定義的任何其它細胞(類型)，在核中存在的濃度為約1X105、約IX IO6或約 1 X IO7個細胞/ml交聯支架聚合物 5 X IO8個細胞/ml交聯支架聚合物，更優選的濃度為 約1 X 105、約1 X IO6或約1 X IO7個細胞/ml交聯支架聚合物 1 X IO8個細胞/ml交聯支架 聚合物，最優選的濃度為1 X 105、約1 X IO6或約2 X IO7個細胞/ml交聯支架聚合物 6 X IO7 個細胞/ml交聯支架聚合物。包埋在(球形)微囊的(球形)核中的細胞通常取決于如上定義的(球形)核的 直徑。舉例而言，總直徑為約160 μ m的示例的創造性(球形)微囊在其(球形)核中可 以包含許多包埋細胞，如間充質干細胞或間充質基質細胞或本文定義的任何其它細胞(類型)，例如每個(球形)核進而每個(球形)微囊中包含約例如10個細胞 100個細胞、優 選約30個細胞 80個細胞，例如約60個細胞 70個細胞。因此，施用約60，000個創造 性(球形)微囊通常一次將約3百萬 4百萬個細胞提供至待治療的位置。本發明使用的(球形)微囊的核具有的直徑(粒徑)通常不超過本文定義的 (球形)微囊的總直徑的直徑。通常而言，本發明使用的(球形)微囊的核具有的直徑為 約50 μ m 約220 μ m，優選直徑為約100 μ m 約200 μ m,同樣優選直徑為約115 μ m 約 185 μ m,更優選直徑為約130 μ m 約170 μ m,還更優選直徑為約145 μ m 約155 μ m,例如 約 120 μ m、125 μ m、130 μ m、135 μ m、140 μ m、145 μ m、150 μ m 或 155 μ m。特別優選的是,本發 明使用的(球形)微囊的核具有的直徑比本文定義的(球形)微囊的總直徑小約1 μ m 約80 μ m,更優選比本文定義的(球形)微囊的總直徑小約15 μ m 約70 μ m,并且最優選 比本文定義的(球形)微囊的總直徑小約30 μ m 約60 μ m。換言之，本發明使用的(球 形)微囊的核的直徑具有的尺寸可以為約50 μ m、約60 μ m、約70 μ m、約80 μ m、約90 μ m、 ^ 100 μ m> ^ ΙΙΟμ 、^]130μ >^ 135μ >^ 140 μ m> ^ 145 μ m、 約 150 μ m、約 155 μ m、約 160 μ m、約 165 μ m、約 170 μ m、約 175 μ m、約 180 μ m、約 185 μ m、約 190 μ m、約 195 μ m、約 200 μ m、約 205 μ m、約 210 μ m、約 215 μ m,或甚至約 220 μ m,或可以包 括選自此處所提及任何兩個具體值中的任何范圍。本文定義的(球形)微囊的核包括本文定義的編碼和分泌GLP-1、其片段或變體或 者包含GLP-I或其片段或變體的融合肽的細胞，以用于治療如本文定義的AMI或MI疾病， 或者與它們相關的疾病。位于所述核周圍的所述細胞，例如間充質細胞或間充質基質細胞， 或在本發明情況下可用于(球形)核的任何其它細胞(類型)，或者突出支架結構的細胞可 引起免疫問題，因為免疫系統會將這些微囊識別為外源成分，因此，這些微囊會受到免疫系 統攻擊。雖然可以通過降低初始溶液中的細胞濃度來避免該效應，但是本發明通過增加核 的細胞比例(cell portion)來改善微囊的功效。核中的細胞濃度越高，則所得待移植的微 囊的總體積越小，即微囊可在注射位置所起的作用越有效。為了避免當使用在(球形)微囊 的(球形)核中的高濃度細胞時的免疫問題，本發明提供施涂在(球形)核上的至少一個表 面涂布層。即使細胞位于的位置非常接近于核邊緣，該表面涂布層也不允許發生免疫應答， 原因在于由于表面涂布層充當屏障，這些細胞對于宿主免疫系統而言是不可及的。該表面 涂布層通常由如本文定義的通常的交聯聚合物(的混合物)組成，不含有任何細胞。根據特 別優選的實施方式，以上定義的(球形)核涂布有至少一個或多于一個的表面涂布層，例如 1個、2個、3個、4個、5個、5 10個或更多個的表面涂布層，更優選1個、2個或3個表面涂 布層，最優選僅具有一個表面涂布層。通常而言，各表面涂布層圍繞核具有均勻的厚度。本 發明使用的(球形)微囊的表面涂布層的厚度，幾乎可以任意變化，并且通常為約Iym 約80 μ m,更優選為約15 μ m 約70 μ m,最優選為約20 μ m 約40 μ m,例如約30 μ m。本文所用的(球形)微囊的(球形)核(以及可選地，(球形)微囊的所述至少 一個表面涂布層)包含交聯聚合物(的混合物)或由交聯聚合物(的混合物)組成。在 該情況下，對于形成如本發明定義的(球形)微囊的(球形)核和所述至少一個表面涂布 層((球形)核和至少一個表面涂布層相互獨立)，可以使用本領域已知并且適于封裝的任 何藥學上可接受的(交聯)聚合物。優選的是，所使用的所述聚合物在一方面在其交聯狀態下對于從外部供應氧和營養物是可滲透的，另一方面，允許由核的細胞所編碼和分泌的 肽從微囊擴散到患者組織或體液中。另外，交聯聚合物防止身體免疫系統的成分通過基質 侵入。舉例而言，可以使用的聚合物例如有合成水溶性(生物)聚合物、半合成水溶性(生 物)聚合物和例如來自天然聚合物等的天然水溶性(生物)聚合物，例如所選擇的蛋白質 或基于蛋白質的聚合物(例如膠原蛋白、白蛋白等)、聚氨基酸(例如聚L-賴氨酸，聚-L-谷 氨酸等)、多糖和其衍生物(例如羧甲基纖維素、纖維素硫酸酯、瓊脂糖、(例如物種海帶 (Laminarales)、外子藻(Ectocarpales)、墨角藻(Fucales)的)包括褐藻的藻酸鹽在內的 藻酸鹽、角叉菜膠、透明質酸、肝素和相關的硫酸葡萄糖胺(glycosamino sulfate)、右旋糖 苷和其衍生物、殼聚糖和其衍生物)。還可以使用合成聚合物，例如脂肪族聚酯(例如聚乳 酸、聚羥基乙酸、聚羥基丁酸等)、聚酰胺、聚酸酐、聚原酸酯、聚磷腈、熱塑性聚氨酯、聚乙烯 醇、聚羥基甲基丙烯酸乙酯、聚甲基丙烯酸甲酯和聚四氟乙烯等。另外，本文因而可以使用嵌段聚合物，即源自兩種或更多種上述聚合物的組合的 聚合物。所述嵌段聚合物可由本領域技術人員根據諸如孔徑、交聯度、毒性、處理、生物相容 性等所需性質進行選擇。在本發明的情況下將任何的此處聚合物定義為“化學上不同的聚 合物”，即這些聚合物中的每一種通常不顯示與此處任何其它聚合物相同的摩爾質量和結 構。相反，“化學上相同的聚合物”是指，聚合物顯示相同的摩爾質量和結構。最后，此處聚合物的混合物也包括在本文中，其中所述混合物中含有的聚合物的 量可由本領域技術人員根據諸如本文所述的性質等所需性質進行選擇。在這方面，如果所 得聚合物混合物的總摩爾質量以及混合物中的單一聚合物的相應摩爾百分比與其它聚合 物混合物相同，則將聚合物的混合物視為與另一聚合物混合物化學上相同(“化學上相同的 聚合物”)。優選的是，本文所用的(球形)微囊的(球形)核(以及可選地，(球形)微囊的 所述至少一個表面涂布層)的交聯聚合物(的混合物)包含藻酸鹽或由藻酸鹽組成。由于 藻酸鹽的生物相容性和交聯性，如果根據本發明將其用作用于形成(球形)核和/或至少 一個表面涂布層的聚合物，則是特別有利的。從化學角度來看，藻酸鹽是源自被β-D-甘露 糖醛酸和α-L-古洛糖醛酸的雜聚區域分隔開的β-D-甘露糖醛酸和α-L-古洛糖醛酸的 均聚基團的陰離子多糖。藻酸鹽是水溶性的，并且在諸如鈉或鉀等單價陽離子的存在下形 成高粘度溶液。當單鏈藻酸鹽與二價、三價或多價陽離子(例如鈣、鋇或聚賴氨酸)相互作 用時形成交聯的水不溶性水凝膠。優選的是，對于封裝使用經純化的藻酸鹽(例如根據DE 198 36 960，通過參考將其具體內容并入本文)，更優選的是在生理鹽水溶液中的藻酸鉀或 藻酸鈉。所述藻酸鹽通常顯示的平均摩爾質量為約20kDa 約10，OOOkDa,更優選摩爾質 量為約IOOkDa 約1，200kDa。用于形成本發明所用的(球形)微囊的核和/或至少一個 表面涂布層的藻酸鹽，可以作為溶液提供，更優選作為水溶液提供，例如待使用的藻酸鹽的 0.2% (w/v)的藻酸鹽水溶液的粘度可以為約2mPas 約50mPas，更優選為約3mPas 約 lOmPas。如果根據本發明使用藻酸鹽，則優選富含α-L-古洛糖醛酸的藻酸鹽。換言之，優 選含有至少50% α-L-古洛糖醛酸(和少于50%的β-D-甘露糖醛酸)的藻酸鹽。更優 選的是，所使用的藻酸鹽含有50% 70%的α-L-古洛糖醛酸和30% 50%的β-D-甘 露糖醛酸。適于制備本發明使用的(球形)微囊的藻酸鹽可通過從某些藻類物種提取而獲 得，所述藻類物種包括，但不限于，諸如海帶(Laminarales)、外子藻(Ectocarpales)、墨角藻(Fucales)等褐藻，和產生藻酸鹽的藻類的其它物種。藻酸鹽可以根據本領域技術人員 已知的用于制備藻酸鹽的任何方法從新鮮藻類材料或干燥材料分離。用于本文定義的制備(球形)微囊的(球形)核的交聯聚合物，和用于制備(球 形)微囊的至少一個表面涂布層的交聯聚合物在所選聚合物方面和在所選濃度方面可以 相同或不同。根據第一實施方式用于制備(球形)核和至少一個表面涂布層的交聯聚合物可以 包含濃度相同或不同的化學上相同的聚合物。優選的是，使用選自本文定義的任何聚合物 中的非交聯聚合物溶液制備(球形)核和至少一個表面涂布層中存在的聚合物。在該聚合 物溶液中，非交聯聚合物的存在濃度通常為約0.1% (w/v) 約8% (w/v)的非交聯聚合 物，更優選濃度為約0. 1% (w/v) 約4% (w/v)的非交聯聚合物，還更優選濃度為約0.5% (w/v) 約2. 5% (w/v)的非交聯聚合物，最優選濃度為約1% (w/v) 約2% (w/v)的非 交聯聚合物。如果將本文所述的藻酸鹽用作用于制備本文所用(球形)微囊的(球形)核 和/或用于制備(球形)微囊的至少一個表面涂布層的聚合物，則用于制備(球形)核的 聚合物溶液的濃度和用于制備(球形)微囊的至少一個表面涂布層的聚合物溶液的濃度， 可以相互獨立地選自0. 1% (w/v) 4% (w/v)的非交聯聚合物濃度，優選選自0.4% (w/ ν) 2% (w/v)的非交聯聚合物濃度。兩種溶液的藻酸鹽濃度可以相同。作為選擇，對于 制備本發明使用的(球形)微囊的(球形)核和至少一個表面涂布層，可以使用不同的藻 酸鹽濃度。優選的是，用于制備(球形)核和/或至少一個表面涂布層的非交聯聚合物包 含化學上相同的聚合物，更優選濃度相同，例如使用本文定義的濃度的本文定義的聚合物。 在該情況下，術語“ ％ (w/v)，，是指非交聯聚合物的濃度，并通常在例如將非交聯聚合物溶 解于合適溶劑后(交聯前)，基于相對于聚合物溶液的總體積的干燥形式的聚合物的特定 量而確定。但是，如果適用，例如如果使用在標準條件(室溫、常壓等)下處于流體聚集體 狀態的聚合物，此處濃度還可以用相應的“％ v/v”濃度來代替。根據第二實施方式用于制備(球形)核和至少一個表面涂布層的交聯聚合物可以 包含濃度相同或不同的化學上不同的聚合物。由此，對于(球形)核和至少一個表面涂布 層而言濃度和聚合物可以相互獨立地按照本文定義單獨選擇。另外，聚合物可以選自本文 定義的聚合物，本文定義的聚合物包括例如天然聚合物、合成聚合物和聚合物的組合，例如 嵌段聚合物。用于核或至少一個表面涂布層的聚合物的性質的差異還可以是由于所用聚合 物的不同分子量和/或由于相同聚合物的不同交聯等。在(球形)微囊包含超過一個表面涂布層的情況下，至少一個表面涂布層的每一 層中的聚合物可以相同或不同，即各表面涂布層的交聯聚合物可以含有濃度相同或不同的 化學上相同或不同的聚合物，例如本發明使用的(球形)微囊可以包含由本文定義的任何 聚合物組成的本文定義的至少一個表面涂布層，以及由諸如本文定義的聚氨基酸(如聚 L-賴氨酸、聚L-谷氨酸等)等聚陽離子組成的另外的外部表面涂布層。類似地，用于不同 表面涂布層的聚合物的性質的差異可以是由于所用聚合物的不同分子量和/或由于相同 聚合物的不同交聯等。本文使用的(球形)微囊的(球形)核還包含細胞。所述細胞通常選自干細胞或 基質細胞，例如間充質干細胞或間充質基質細胞，或選自可用于本發明情況的任何其它細 胞(類型)，以治療AMI或MI疾病或者與它們相關的疾病。如下所述，所述細胞通常通過用核酸或含有核酸的載體穩定轉染細胞而獲得，所述核酸編碼GLP-1、其片段或變體或者包含 GLP-I或其片段或變體的融合肽。適于本文使用的(球形)微囊的(球形)核的細胞可以選自(未分化的)干細胞， 包括全能干細胞、多潛能干細胞(pluripotent stem cells)或多能干細胞(multipotent stem cells)。用于該情況的干細胞優選包括胚胎干細胞或者源自外胚層、中胚層或內胚層 的干細胞、或者諸如(人類)間充質干細胞或間充質基質細胞(MSC，hMSC)的成體干細胞 (例如源自人類骨髓或源自脂肪組織)、造血干細胞、表皮干細胞、神經干細胞和未成熟的 成纖維細胞(包括來自皮膚的成纖維細胞，成肌纖維細胞)等。這些(未分化的)干細胞 通常能夠進行對稱干細胞分裂，即產生相同細胞拷貝的細胞分裂。干細胞保留轉化成任何 細胞類型的能力。另外，干細胞能夠進行不對稱分裂，產生干細胞拷貝和不同于干細胞拷貝 的另一細胞，例如分化細胞。適合于本文使用的(球形)微囊的(球形)核的本文定義的干細胞，特別是間充質 干細胞或間充質基質細胞，可以另外地產生支持GLP-I或其片段或變體的細胞保護作用的 一組內源性營養因子。用于間充質基質細胞的該旁分泌細胞保護機制的生物活性因子可以 例如是細胞因子GRO、IL-6、IL-8、MCP-I以及生長因子VEGF、⑶NF和神經營養因子_3。因 此，根據特別優選的實施方式，(球形)微囊的(球形)核中的細胞分泌內源性蛋白或肽作 為以治療水平由所述囊釋放的旁分泌因子，所述旁分泌因子選自VEGF、IL6、IL8、⑶NF、NT3 禾口 MCPl等。本文使用的(球形)微囊的核，可以替代性地含有選自例如能夠通過此處的干細 胞或基質細胞獲得的(分化)細胞的細胞，所述細胞例如是諸如(成熟)成纖維細胞、軟骨 細胞(cartilage cell, chondrocyte)、骨細胞(bone cell)(成骨細胞(osteoblasts) / # 細胞(osteocytes)，破骨細胞(osteoclasts))、脂肪細胞(fat cell,adipocyte)或平滑肌 細胞等結締組織細胞家族或者包括淋巴樣祖細胞或源自其的細胞在內的血液細胞，例如NK 細胞、T細胞、B細胞或樹突細胞、或者常見的骨髓祖細胞或源自其的細胞，例如樹突細胞、 單核細胞、巨噬細胞、破骨細胞、嗜中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿細胞、血小板、巨核細胞 或紅細胞、或巨噬細胞、包括星形細胞、少突細胞等在內的神經細胞、或者上皮細胞、或者表 皮細胞。這些分化細胞通常能夠進行對稱細胞分裂，即產生分化的親本細胞的相同拷貝的 細胞分裂。另外，在某些情況下，這些分化細胞能夠進行不對稱分裂，產生親本細胞的相同 拷貝和不同于親本細胞的另一細胞，即比親本細胞進一步分化的細胞。作為選擇，在某些情 況下，例如通過添加選擇性分化因子，能夠使本文定義的分化細胞進一步分化而不需要進 行細胞分裂。另外，本發明使用的(球形)微囊的(球形)核中包埋的細胞，可以是取自待治療 患者自身的細胞(自體細胞)或可以取自同種異體細胞(例如取自體外培養的已建立細胞 系，如HEK293細胞、hTERT-MSC細胞等)。由于表面涂布層包埋本發明使用的(球形)微囊 的(球形)核，這使得可以使用同種異體細胞而不會引起待治療患者的任何不期望的免疫應答。本發明使用的(球形)微囊的(球形)核中包埋的細胞可以另外是本文定義的 (分化和/或未分化)細胞類型的組合。本發明使用的(球形)微囊的(球形)核可以含 有例如人類間充質干細胞或人類間充質基質細胞，其中這些細胞的一部分可以在體外或體內分化成本文定義的細胞類型，如脂肪細胞(適于移植到脂肪組織中)等。因此，可以將例 如共有相同譜系的各種細胞類型(例如源自特定的干細胞類型)分配到核中。總之，適于制備本發明使用的(球形)微囊的(球形)核的細胞可以選自未分化 細胞或分化細胞。根據一個實施方式，可以優選本文定義的未分化細胞。例如由于所述未 分化細胞的壽命較長，所述未分化細胞可以提供有利的性質，例如本發明使用的(球形)微 囊的長期作用，如長期表達和分泌本文定義的GLP-I肽或GLP-I融合肽，或其片段或變體 的能力。在替代性實施方式中，本文定義的分化細胞對于制備本發明使用的(球形)微囊 的(球形)核而言可以是優選的，這是因為它們通常不再增殖，因此不會引起本發明使用的 (球形)微囊的(球形)核內的細胞的任何不期望的增殖。細胞的特異性分化可由本領域 技術人員在體外根據本領域已知的方法通過向前體細胞添加所選擇的分化因子而進行。優 選的是，對細胞進行分化，從而使本發明使用的(球形)微囊的(球形)核中包埋的絕大多 數細胞(或至少90%，更優選至少95%，最優選至少99% )屬于相同細胞類型。特別地， 本文定義的間充質干細胞可以在體外分化成例如成骨細胞、軟骨細胞、諸如脂肪細胞(fat cell)等脂肪細胞(adipocyte)，諸如腦細胞等神經元樣細胞等，并且進而被本文使用。關 于使用未分化細胞還是分化細胞來制備本文定義的(球形)微囊的(球形)核，可以取決 于待治療疾病的特定要求，例如病痛位置、施用模式、為植入所選擇的組織等。可由本領域 技術人員評估這些標準而進行合適細胞的選擇。另外，適于制備本文定義的(球形)微囊的(球形)核的細胞可以是永生化細胞 或非永生化細胞，優選是永生化細胞。如果使用永生化細胞，這些細胞優選保留其進行本文 所討論的對稱和/或不對稱細胞分裂的能力。根據本發明，當細胞超過正常細胞(即非永 生化細胞)的壽命的兩倍時，將該細胞定義為永生化的。在體外正常二倍體細胞的最大壽 命隨著細胞類型(例如胎兒細胞或成體細胞)和培養條件而有所變化。因此，在體外培養 的正常細胞的最大壽命為約60 80個群體倍增。例如，角質形成細胞可以分裂約80次， 成纖維細胞可以分裂超過50次，淋巴細胞可以分裂約20次。正常的骨髓基質細胞可以顯 示的最大壽命為30 40個群體倍增。優選的是，用于制備本發明使用的(球形)微囊的 (球形)核的細胞系，可以連續地生長超過350個群體倍增，并且仍然可以保持年輕細胞的 正常生長率特性。使制備本文定義的創造性(球形)微囊的(球形)核所用的細胞永生化的方法是 本領域公知的，并且可以進而應用于此處(參見例如WO 03/010305或WO 98/66827，通過參 考將其并入本文)。示例性的方法(根據WO 03/010305)包括例如以下步驟a)根據本領域技術人員已知的標準常規細胞培養方法培養細胞，例如干細胞，特 別是源自人類骨髓的干細胞(例如(人類)間充質干細胞(MSC、hMSC)))；b)用包含人類端粒酶逆轉錄酶OiTERT)基因或其變體的至少一個片段的逆轉錄 病毒載體通過以下步驟轉導所述細胞培養物bl)培養包封細胞系(例如PA317細胞、PG13細胞、Phenix等)，其中所述包封細 胞系是其中產生逆轉錄病毒載體的細胞，b2)構建逆轉錄病毒載體(例如源自莫洛尼鼠類白血病病毒等)，其中所述逆轉 錄病毒載體包含人類端粒重復(hTRT)基因或其變體的催化亞基的至少一個片段，更優選 hTERT cDNA 片段，例如來自 pGRN145 的 3452 個堿基對的 EcoRI 片段(Geron Corporation)，
b3)用所述逆轉錄病毒載體轉染所述包封細胞系，b4)用所述經轉染細胞轉導(transduce)所述包封細胞系，優選通過使細胞與逆 轉錄病毒載體一起離心而進行，b5)用步驟b4)的包封細胞轉導此處步驟a)的培養的細胞，所述細胞包含所述逆
轉錄病毒載體。c)獲得永生化細胞系，其中所述永生化細胞系與步驟a)的細胞相比具有基本上 相同的特性和性質。結果，源自人類端粒亞基(hTRT)基因的所插入的多核苷酸序列可以進 行轉錄和翻譯，從而產生功能性端粒酶。本領域技術人員會意識到，由于密碼子簡并性，許 多多核苷酸序列會編碼相同的端粒酶。另外，還包括端粒酶變體，該端粒酶變體具有與野生 型端粒酶序列基本上相同的序列，但是保留野生型端粒酶多肽的功能(例如由野生型端粒 酶多肽中氨基酸的保守性取代產生)。可以對包埋在(球形)微囊的(球形)核中的編碼和分泌本文定義的GLP-I肽以 及GLP-I融合肽的細胞，進行進一步修飾或工程化，從而另外分泌選自由以下因子組成的 組中的因子抗凋亡因子、生長因子、VEGF、促紅細胞生成素(EPO)、抗血小板因子、抗凝血 因子、抗血栓形成藥、抗血管生成因子或顯示心臟保護功能的任何另外的因子等。根據一個具體實施方式
，可以對包埋在(球形)微囊的核中的編碼和分泌本文定 義的GLP-I肽以及GLP-I融合肽的細胞進行工程化，從而另外分泌促紅細胞生成素(EPO)。 促紅細胞生成素(也稱為EPO、epoetin或procrit)是分子量為約34，000道爾頓的酸性 糖蛋白激素，以多種形式出現，包括α、β、ω和脫唾液酸(asialo)形式。促紅細胞生成 素刺激血紅細胞產生。其在腎中產生，并刺激在骨髓和別處的指定紅細胞前體(erythroid precursor)的分裂和分化。通常而言，當身體處于健康狀態時，促紅細胞生成素以非常低的 濃度存在于血漿中，其中組織從現有數量的血紅血球接受充足的氧合。該正常的低濃度對 于刺激通過老化正常失去的血紅細胞的更換而言是足夠的。在諸如缺氧、當循環中通過血 液細胞進行的氧運輸減少時等條件下，循環中的促紅細胞生成素的量增加。大量血液經由 出血而失去、過度暴露于輻射使血紅細胞破壞、高海拔或長時間失去知覺引起的氧攝入減 少、或者各種形式的貧血或缺血可引起缺氧。響應于經受低氧脅迫的組織，促紅細胞生成素 會通過以下過程增加紅細胞產生刺激骨髓中的初生前體細胞轉化成原成紅細胞，原成紅 細胞隨后成熟，合成血紅蛋白，并作為紅細胞釋放到循環中。當循環中紅細胞的數量大于正 常組織氧需求所需時，循環中的促紅細胞生成素減少。優選的是，促紅細胞生成素用作細胞 中含有的另外因子，以誘導紅細胞的產生，從而抗擊貧血。(參見，例如Bottomley等Q002) Lancet Oncol. 3 :145)。還提出促紅細胞生成素可用于控制患有異常止血的患者的出血。 (參見例如美國專利第6，274，158號)。重組人類促紅細胞生成素(rHuEpo或印oetin[a]) 作為 EPOGEN(R) (epoetin α，重組人類促紅細胞生成素)(Amgen Inc.，Thousand Oaks, Calif.)和作為PROCRIT(R)(印oetin α，重組人類促紅細胞生成素)(Ortho Biotech Inc.，Raritan, N. J.)商購可得。EPO可以增加罹患AMI或MI的患者的紅細胞比容值。促 紅細胞生成素的紅細胞比容值的正常范圍對于女性而言是37% 48%，對于男性而言是 42% 52%。(參見 Case Records of the Massachusetts General Hospital :normal reference laboratory values. (1992)N. Eng. J. Med. 327 :718)。當然，必須對使用促紅細 胞生成素來增加心血管疾病的患者，特別是罹患腎衰竭的患者的紅細胞比容水平的安全性和功效進一步進行評價。優選的是，通常以不會誘導紅細胞形成的濃度或持續時間來提供 促紅細胞生成素，或者作為選擇，增加受試對象中的紅細胞比容為約IpM 小于ΙΟΟΟμΜ， 包括小于900 μ Μ、小于700 μ Μ、小于500 μ Μ、小于300 μ Μ、小于100 μ M或小于50 μ Μ。在 其它實施方式中，促紅細胞生成素作為受試對象體重的函數進行施用。通常可以以約IU/ kg 10，000U/kg 受試對象體重，包括小于 7，500U/kg、5，000U/kg、2500U/kg、1000U/kg、 750U/kg、500U/kg、250Ug/kg、100Ug/kg、50U/kg、25U/kg、10U/kg、5U/kg 或 lU/kg 受試對象 體重的濃度提供促紅細胞生成素。在該情況下，促紅細胞生成素血清濃度正常在5mU/ml 50mU/ml內。對于罹患MI或AMI或者與其相關的其它疾病的患者，根據癥狀、體重、性別和 動物物種等，促紅細胞生成素優選以50U/kg 100U/kg的濃度提供。通常假定優選將血液 濃度保持在約lmU/ml 100mU/ml的治療選項。還優選的是，促紅細胞生成素通常以不增 加幸存者的紅細胞比容的濃度提供，其中在心肌梗死的1小時、2小時或3小時內施用單劑 量的促紅細胞生成素，持續一段較長時間。根據另外一個具體實施方式
，可以對包埋在(球形)微囊的核中的編碼和分泌本 文定義的GLP-I肽以及GLP-I融合肽的細胞進行工程化，從而另外分泌VEGF。根據另一個具體實施方式
，可以對包埋在(球形)微囊的核中的編碼和分泌本 文定義的GLP-I肽以及GLP-I融合肽的細胞進行生物工程化，從而另外分泌抗凋亡因子。 所述因子可以包括，但不限于，APC(具有半胱天冬酶補充結構域的凋亡阻遏物)、Bcl-2、 Bcl-xL、Che-1/AATF、簇蛋白、胰島素、Mcl-U NF_kB_依賴性抗凋亡因子、血清素、存活素 等。另外，充當本領域已知的凋亡因子的抑制因子并由此可視為抗凋亡因子的任何因子都 由此包括在內。所述因子優選由編碼和分泌本文定義的GLP-I肽和GLP-I融合肽的核酸編 碼并由細胞分泌。在該情況下，所述抗凋亡因子可以針對以下凋亡因子或凋亡相關蛋白中 的至少一種包括 AIF、諸如 Apaf-I，Apaf-2, Apaf-3 等 Apaf、oder AP0-2 (L)、AP0-3 (L)、
天冬酶_2、半胱天冬酶-3、半胱天冬酶-4、半胱天冬酶-5、半胱天冬酶-6、半胱天冬酶-7、 半胱天冬酶_8、半胱天冬酶_9、半胱天冬酶-10、半胱天冬酶-11等半胱天冬酶、ced-3、 ced-9、c-Jun、c_Myc、crm A、細胞色素 C、CdRl、DcRl、DD、DED、DISC、DNA-PKcs、DR3、DR4、DR5、 FADD/M0RT-1、FAK, Fas (Fas-配體 CD95/fas (受體))、FLICE/MACH、FLIP、胞襯蛋白、fos、 G-肌動蛋白、feis-2、凝溶膠蛋白、粒酶Α/Β、I CAD, ICE、JNK、核纖層蛋白A/B、MAP、MCL-U Mdm-2、MEKK-1、M0RT-1、NEDD、NF-K B、NuMa、p53、PAK-2、PARP、穿孔蛋白、PITSLRE、PKC δ、 pRb、早衰蛋白、prICE、RAIDD、Ras, RIP、神經鞘磷脂酶、來自單純皰疹的胸苷激酶、TRADD, TRAF2、TRAIL-Rl、TRAIL-R2、TRAIL-R3、轉谷氨酰胺酶等。本文定義的由(球形)微囊的(球形)核中含有的細胞編碼和分泌的GLP-I肽可 選自任何已知的GLP-I肽序列。在該情況下，神經保護因子GLP-I位于已經深入研究過的 編碼前原胰高血糖素的胰高血糖素基因上(參見例如White，J. W.等，1986 Nucleic Acid Res. 14(1 4719-4730)。作為高分子量前體分子的前原胰高血糖素分子在胰腺α細胞中 和在空腸及結腸L細胞中合成。前原胰高血糖素分子是長度為180個氨基酸的激素原，其序 列除了含有胰高血糖素之外，還含有相關結構的兩個序列胰高血糖素樣肽-I(GLP-I)和 胰高血糖素樣肽-2(GLP-2)。在前原胰高血糖素分子中，GLP-I和GLP-2之間是17個氨基酸 的肽序列(更確切地說是15個氨基酸的序列加上C末端RR切割位點)，即插入肽2 (IP2)。
19IP2序列(在前體分子中位于GLP-I和GLP-2之間)在體內正常情況下在GLP-I的第37 位氨基酸之后經蛋白水解被切割。因此取決于細胞和環境，前原胰高血糖素模塊切割成各 種肽，包括GLP-I (1-37)，其未加工形式的37個氨基酸的肽。通常而言，該加工發生在胰腺 和腸中。可以將GLP-I (1-37)序列進一步蛋白水解加工成為31個氨基酸加工形式的活性 GLP-I (7-37)，或其進一步降解產物GLP-I (7-36)酰胺。因此，GLP-I (7_37)的命名表示所討 論的片段包括從親本肽GLP-I的N末端計數時，第7 37位的氨基酸殘基。GLP-I (7_36)、 GLP-I (7-36)酰胺的氨基酸序列和GLP-I (7-37)的氨基酸序列在式I (SEQ ID NO 25)中給 出His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-A Ia-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-X(I)當X是NH2時其表示GLP-I (7-36)酰胺，或者當X不存在時其表示GLP-I (7-36)， 并且當X是Gly-OH時其表示GLP-I (7-37)。因此根據本發明的一個實施方式，GLP-I肽可以選自任何已知的GLP-I肽序列，例 如本文定義的GLP-I肽序列。在該情況下，GLP-I肽可以由包埋在(球形)微囊的(球形) 核中的細胞分泌，由此可以優選在制備(球形)核之前對所述細胞用編碼本文定義的GLP-I 肽的核酸序列進行轉染，從而使這些細胞表達和分泌GLP-I肽。優選的是，可由包埋在(球 形)微囊中的細胞編碼和分泌的本文使用的GLP-I肽，可以選自由包含(野生型(wt)) GLP-I的第7 35位氨基酸的肽和與該肽顯示有至少80%、90%、95%或甚至99%同一性 的肽組成的組中。通常而言，GLP-I肽可以選自由以下肽組成的組中(i)包含(野生型) GLP-I的第1 37位氨基酸的肽，(ii)包含(野生型)GLP-I的第7 35、36或37位氨基 酸的肽，(iii)GLP-I (7-36)酰胺和(iv)與這些肽中任一種顯示有至少80%、90%、95%或 甚至99%同一性的肽，包括修飾肽。在該情況下，“經修飾的GLP-I肽”旨在表示任何GLP-I 變體或GLP-I片段，包括組合，例如保留(野生型)GLP-I的生物功能的變體的片段。將變 體和片段歸類為對未經修飾的GLP-I序列的修飾，例如GLP-I (7-35,36或37)。在本發明的 含義內，任何變體或片段必須是功能性的，例如必須發揮與未經修飾的(GLP-I)肽相同或 類似的生物活性。術語“活性”是指生物活性(例如一種或多種生物活性，包括受體結合、 受體激活、顯示GLP-I的已知有益效果，例如與現有技術所述的GLP-I的效果有關的如本文 所提及的其強烈地減少由與心臟組織的缺血或缺氧以及可能死亡引起的損傷的活性，對生 物活性可以在相同條件下與本文定義的天然存在的GLP-I肽和其片段或變體進行比較。優選的是，本文定義的GLP-I肽的變體或片段發揮GLP-I (7-35,36或37)的至少 25%的活性，更優選發揮本文定義的GLP-I (7-35、36或37)的至少50%的(生物)活性， 還更優選發揮60%、70%、80%或90%的(生物)活性，最優選發揮至少95%或99% (生 物)活性。生物活性可以通過標準檢驗進行確定，例如所述標準檢驗優選例如使用2型糖 尿病動物模型等，來確定作為腸降血糖素激素降低血糖水平的活性。根據一個特別優選的實施方式，可由包埋在(球形)微囊的(球形)核中的細 胞編碼的本文定義的GLP-I肽或GLP-融合肽，在其N末端不包含本文定義的(天然) GLP-I (1-37)序列的天然存在的第1 6位氨基酸。還更優選的是，本文定義的GLP-I肽 或如下定義的GLP-融合肽在其N末端不包括本文定義的天然GLP-I (1-37)序列的天然 存在的第1、2、3、4、5和/或6位氨基酸。該附帶條件優選是指例如選自由包含GLP-1、GLP-I (7-36)酰胺的第7-35、36或37位氨基酸的肽和與這些肽中任一種顯示有至少80%、 90%、95%或甚至99%同一性的肽，包括修飾肽組成的組中的本文定義的GLP-I肽以及是 指含有所述GLP-I肽的GLP-I融合肽。但是，該附帶條件不排除本文定義的所述GLP-I肽 或本文定義的GLP-I融合肽包含N末端(或C末端)序列修飾或與其融合的另外的氨基酸 或肽，例如信號肽序列和/或前導肽序列等，但是該另外的氨基酸或肽不同于野生型GLP-I 的第1 6位氨基酸的序列。在另一優選實施方式中，連接在其同源物的GLP-I (7-35、36 或37)的N末端的任何氨基酸不對應于GLP-I (7-35、36或37)的第6位處的天然存在的氨 基酸。根據另外的優選實施方式，(直接)連接在其同源物的GLP-l(7-35、36或37)的N 末端的任何氨基酸不對應于天然GLP-I (優選在GLP-I中以其天然順序)的天然存在的第 6位氨基酸，不對應于天然存在的第5和6位氨基酸，不對應于天然存在的第4、5和6位氨 基酸，不對應于天然存在的第3、4、5和6位氨基酸，不對應于天然存在的第2、3、4、5和6位 氨基酸，或不對應于天然存在的第1、2、3、4、5和6位氨基酸。根據一個特別優選實施方式， 連接在其同源物的GLP-I (7-35,36或37)的N末端的任何氨基酸不對應于前原胰高血糖素 的序列。天然GLP-1，特別是GLP-I (7-36)，在體內經歷的半衰期較短，因此通常在其中嚴 格避免頻繁施用或其中設想進行長期施用的治療中使用受到限制。GLP-I在第8位和第9 位殘基之間被DPP-IV(二肽基肽酶IV)在數分鐘內于血漿中快速降解，產生失活的NH2-末 端截短的代謝物GLP-I (9-36)。另外，天然GLP-I通常經過腎排泄。這些因素引起以下問 題GLP-l(7-36)和NH2-末端截短代謝物GLP-I (9-36)中的哪一種肽是體內的活性部分，以 及在治療應用中生理作用是否通過天然GLP-I或其片段而得以發揮。作為其在體內快速降 解的結果和由于其在體內快速降解，可以將天然GLP-I或其片段用作諸如可能用于患有急 性AMI或MI疾病或者與它們相關的疾病的患者的重癥監護病房等短期代謝控制的合適工 具。為了避免所述快速降解，進行了各種嘗試來合成天然存在的GLP-I (例如 GLP-I (7-37))的穩定化(防止被DPP-IV降解)類似物。特別地，將第8位殘基(在體內 為 Ala)用諸如 Gly、Ser 或 Thr 等另一殘基置換(Burcelin, R.等(1999)Metabolism 48， 252-258)。已經對作為合成分子的GlyS (或G8)類似物或由經基因工程化以分泌突變多肽 的細胞系產生的GlyS (或G8)類似物進行了深入試驗(Burcelin, R.，等(1999) ,Annals of the New York Academy of Sciences 875:277-285)。向例如 GLP-1 (7-37)中引入各種其 它修飾來增強其體內穩定性，并且不會損害其生物活性。所述方法通過使GLP-I穩定而不被DPP-IV降解，例如通過與GLP-I肽一起另外施 用DPP-IV抑制劑，從而克服了半衰期較短的問題。另外將DPP-IV抑制劑與GLP-I肽一起 施用是復雜的，并且通常不會引起所期望的長期治療，因為DPP-IV抑制劑可能僅在體外系 統中被有效地利用。因此，根據替代性的實施方式，由包埋在(球形)微囊的核中的細胞編碼和分泌的 GLP-I肽可以選自GLP-I融合肽或其變體或片段。本文使用的GLP-I融合肽可由包埋在本 文定義的(球形)微囊的(球形)核中的細胞編碼和分泌。在該情況下，在制備核之前通 常用編碼GLP-I融合肽的核酸序列對本文定義的包埋在(球形)微囊的(球形)核中的細 胞進行轉染，從而使這些細胞編碼、表達和分泌GLP-I融合肽。
本文定義的GLP-I融合肽優選具有至少兩個成分，例如成分(I)和(II)、成分(I) 和(III)或成分(I)、(II)和(III)，顯示本文定義的GLP-I的生物活性，并且同時，通常通 過(所述)C末端延長賦予GLP-I融合肽的成分(I)以穩定性。本文定義的GLP-I融合肽的 成分(I)通常含有本文定義的GLP-I肽的序列，優選含有與SEQ ID NO 1具有至少80%、更 優選至少85%以及還更優選至少90%序列同一性的序列。SEQ ID NO :1表示GLP-I (7_37) (長度為31個氨基酸)的天然氨基酸序列，其在哺乳動物中是嚴格保守的。根據一個特別 優選實施方式，本文定義的GLP-I融合肽的成分(I)含有與SEQ ID NO :1相同的序列或SEQ ID NO 1的缺少第36和/或37位氨基酸的序列。可由包埋在本文定義的(球形)微囊的(球形)核中的細胞編碼和分泌的GLP-I 融合肽(或更通常的是包括融合肽的片段或變體在內的任何GLP-I肽)的成分(II)，通常 含有具有至少9個氨基酸的肽序列。GLP-I融合肽可以通常在其成分(II)中具有長度為 9 30個氨基酸，優選9 20個氨基酸，最優選9 15個氨基酸的序列。通常而言，可以 優選成分(II)中較短的序列，所述較短的序列與GLP受體的結合活性比較長的序列更高。 成分(II)的序列，即使其不是先決條件，可以優選是中性的或可以在PH7具有負電荷。另 外GLP-I融合肽的成分(II)可以在其序列中含有至少一個脯氨酸殘基。脯氨酸殘基是在 形成轉角的四聚氨基酸序列內常見的氨基酸。因此，GLP-I融合肽的成分(II)可以形 成β-轉角樣結構。轉角結構是蛋白質或肽的典型二級結構元件。其通常由連續的四 個氨基酸形成，使肽或蛋白質主鏈方向反向。如果GLP-I融合肽中存在脯氨酸殘基的話，脯 氨酸殘基通常位于在GLP-I融合肽的成分(II)中出現的四聚體轉角序列基序的第2 位或第3位，優選位于第2位。可由包埋在本文定義的(球形)微囊的(球形)核中的細胞編碼和分泌的GLP-I 融合肽(或更通常的是包括融合肽的片段或變體在內的任何GLP-I肽)的成分(II)，可 以含有選自由以下序列基序組成的組中的序列基序VAIA、IAEE, PEEV, AEEV, EELG, AAAA, AAVA, AALG, DFPE, AADX, AXDX和XADX，其中X表示任何氨基酸(天然存在的氨基酸或經修 飾的非天然氨基酸)。這些四聚體基序可以位于成分(II)序列中的任何地方。在一個特 別優選的實施方式中，創造性的融合肽成分(II)是通過其N末端序列基序與成分(I)的C 末端連接的肽序列，所述N末端序列基序選自由AA、XA、AX、RR、RX和)(R組成的組中，其中 X表示任何氨基酸(天然存在的氨基酸或經修飾的非天然氨基酸)。作為可由包埋在本文定義的(球形)微囊的(球形)核中的細胞編碼和分泌的 GLP-I融合肽的成分(II)，特別優選的是含有對應于人類或鼠類IP-2的部分序列的SEQ ID NO 48 =X1X1DFPX2X2X3X4序列的肽序列，其中各\通常相互獨立地選自任何天然存在的氨基 酸，優選是精氨酸(R)或丙氨酸(A)，更優選是丙氨酸(A)，或可以不存在；其中各)(2通常相 互獨立地選自天冬氨酸(D)或谷氨酸(E)，并且其中各)(3和)(4通常相互獨立地選自任何天 然存在的氨基酸，優選是丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、異亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、蘇氨酸(T)或 纈氨酸(V)。)(4也可以不存在。作為可由包埋在本文定義的(球形)微囊的(球形)核中的細胞編碼和分泌 的GLP-I融合肽的成分(II)，還更優選的是含有SEQ ID NO 22 (RRDFPEEVAI)、SEQ ID NO :27(DFPEEVAI)、SEQ ID NO :28 (RDFPEEVA)或 SEQ ID NO :29 (RRDFPEEV)、SEQ ID NO: 30 (AADFPEEVAI)、SEQ ID NO 31 (ADFPEEVA)或 SEQ ID NO 32 (AADFPEEV)序列(所有肽序列以單字母編碼給出)，或與SEQ ID NO :22、27、28、四、30、31或32具有至少80%序列同一 性的序列的肽序列。SEQ ID N0:22是全長IP-2(插入肽2)序列的部分序列，其含有長度 為15個氨基酸的全長IP-2序列的10個N末端氨基酸。IP-2是本文使用的成分(II)的 優選實例。因此，在本文定義的GLP-I融合肽的成分(II)中含有的其它更優選的序列是 IP-2的更長的部分氨基酸序列，例如在人類中出現的14個N末端氨基酸序列(SEQ ID NO 23 (RRDFPEEVAIVEEL))或其鼠類對應物(SEQ ID NO :24 (RRDFPEEVAIAEEL))，或序列(SEQ ID NO :33(AADFPEEVAIVEEL))或(SEQ ID NO :34 (AADFPEEVAIAEEL))，或與 SEQ ID NO :23、24、 33或M具有至少80%序列同一性的序列。作為在GLP-I融合肽的成分(II)中含有的元 件，最優選的是具有天然存在的IP-2序列(SEQ ID N0:2(RRDFPEEVAIVEELG)，人類，或SEQ ID N0:3(RRDFPEEVAIAEELG)，鼠類，或 SEQ ID NO :35 (AADFPEEVAIVEELG)，或 SEQ ID NO: 36 (AADFPEEVAIAEELG))的所有15個氨基酸的全長IP-2序列或與SEQ ID N0:2、3、35或36 具有至少80%序列同一性的序列。在本發明范圍內的還有IP2的所有哺乳動物同型(哺 乳動物中IP2的天然變體)。可以提供包括在成分(II)中的序列的多于1個拷貝，例如2 個、3個或更多個IP2的拷貝或者IP2的片段或變體。因此，本文定義的由包埋在(球形)微囊的(球形)核中的細胞編碼和分泌的 GLP-I融合肽，優選含有、包含下述序列或由下述序列組成序列SEQ ID NO 8 (HAEGTFT SDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGRRDFPEEVAIAEELG)(即 GLP-1 (7-37)不使用任何連接物序列 經由其 C 末端與鼠類 IP2 連接)或 SEQ ID NO 12 (HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG RRDFPEEVAIVEELG)(即GLP-I (7-37)不使用任何連接物序列經由其C末端與人類IP2連 接)，或者序列 SEQ ID NO 37 (HAEGTFT SDVS SYLEGQAAKEFIAffLVKGRGAADFPEEVAIAEEL G)(即GLP-I (7-37)不使用任何連接物序列經由其C末端與IP2連接)或SEQ ID NO 38 (HAEGTFTSDVS SYLEGQAAKEFIAWLVKGRGAADFPEEVAIVEELG)(即 GLP-1 (7-37)不使用任何 連接物序列經由其C末端與IP2連接)，或者序列SEQ ID NO 39 (HAEGTFTSDVSSYLEGQAAK EFIAWLVKGRGRRDFAEEVAIAEELG), SEQ ID NO 40(HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGRRDA AAAVAIAEELG)、SEQ ID NO 41(HAEGTFTSDVS SYLEGQAAKEFIAWLVKGRGAADAAAAVAIAAALG)、 SEQ ID NO. :42(HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGRRDFP), SEQ ID NO 43 (HAEGTFTSDVS SYLEGQAAKEFIAWLVKGRGRRDFPEEVA),SEQ ID NO44(HAEGTFTSDVS SYLEGQAAKEFIAffLVKGRGR RDFPEEVAIAEELGRRHAC), SEQ ID NO 45(HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGRRDFAEEVAIVE ELG)、SEQ ID NO :46 (HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGRRDAAAAVAIVEELG)、SEQ ID NO 47 (HAEGTFTSDVS SYLEGQAAKEFIAWLVKGRGMDAAAAVAIVMLG)或 SEQ ID NO 48 (HAEGTFTSDVS SYLEGQAAKEFIAWLVKGRGRRDFPEEVAIVEELGRRHAC)(即 GLP-1 (7-37)不使用任何連接物序列 經由其C末端與IP2序列的特定類似物或變體連接)。本文也可以使用與SEQ ID NO 8,12 和37 48，或者其片段或變體具有至少80%序列同一性的其變體或片段。該情況下的優 選GLPl-融合肽還可以包含SEQ ID NO 13、14、19和20的序列。不受任何理論限制，本發明的發明人推斷，例如如果被包埋在本發明使用的植入 (球形)微囊的(球形)核中的細胞在體內分泌到患者周圍組織中的GLP-I (7-35、36或37) 的不穩定性，是由于其不受保護的三維結構。在體內蛋白酶可以切割GLP-I (7-35、36或37) 肽并且快速消除其生理活性。通過將肽序列與GLP-l(7-35、36或37)的C末端連接，其結構 獲得對酶促降解的穩定性。如果另外的C末端肽序列(包含在本發明的融合肽的成分(II)中)反折，例如由于通過其一級結構形成的β轉角結構元件的存在而反折，則可以增強所 述穩定性的獲得，并且為成分(II)提供剛性。發現本文定義的GLP-I融合肽，借助于其優 選含有β轉角結構元件的C末端肽延長，對DPP-IV失活具有改善的抗性。在作用于靶細 胞中的其受體之前C末端肽不會被從GLP-I (7-35,36或37)序列切割，或C末端肽可以在 體內被酶促切割從而形成GLP-I (7-35,36或37)。與在GLP-I受體位置處結合的GLP-I肽 的確切形式無關，本文定義的GLP-I肽作為活性神經保護化合物發揮其作用。據認為由于 形成β轉角元件的一級結構因而適用于本文定義的GLP-I融合肽的成分(II)的GLP-I肽 序列，可以通過適當的方法，例如光譜法(如圓二色性法)，或者本領域技術人員已知的其 它方法容易地進行鑒定。可由包埋在本文定義的(球形)微囊的(球形)核中的細胞編碼和分泌的GLP-I 融合肽的成分(II)和成分(I)，可以直接連接或經由連接序列連接。優選的是，兩種成分直 接相互連接。在它們經由連接物(或間隔子)連接的情況下，連接物優選是肽連接物。肽 連接物通常具有的長度為1 10個氨基酸，優選為1 5個氨基酸，還更優選為1 3個 氨基酸，在某些情況下連接物序列可以甚至更長，包含11 50個氨基酸。肽連接物可由各 種(天然存在的)氨基酸序列組成。優選的是，肽連接物可以在要連接的成分之間引入某 些結構柔性。結構柔性例如通過使肽連接物含有各種甘氨酸或脯氨酸殘基而實現，優選在 連接物序列內含有至少30%，更優選至少40%，還更優選至少60%脯氨酸和甘氨酸殘基。 與具體序列無關，肽連接物可以優選不具有免疫活性。可由包埋在本文定義的(球形)微囊的(球形)核的細胞編碼和分泌的GLP-I融 合肽，可以另外含有成分(III)。通常而言，成分(III)包含至少4個氨基酸殘基，優選至少 10個另外的氨基酸殘基，更優選至少20個另外的氨基酸殘基，或最優選至少30個另外的氨 基酸殘基。在功能方面，成分(III)旨在進一步增強本文定義的GLP-I肽的穩定性。期望 成分(III)不干擾與GLP-I (7-37)的生物活性大約相當的GLP-I融合肽的生物功能。通常 而言，本文定義的成分(I)的任何C末端延長，無論其是成分(II)、成分(III)或本文定義 的成分(II)和成分(III)的組合，均可增強成分(I)(即本文定義的GLP-I肽，例如本文定 義的GLP-I (7-35,36或37)，或其片段或變體)的穩定性。優選的是，本文定義的GLP-I融合肽的成分(III)，包含任何哺乳動物生物體的 GLP-2同型(哺乳動物中GLP-2的其它天然存在的變體)(例如SEQ ID NO 4和5中所示 的鼠類或人類同型)的N末端序列的至少4個另外的氨基酸殘基，優選至少10個另外的氨 基酸殘基，更優選至少20個另外的氨基酸殘基。GLP-2出現在原胰高血糖素中，并且還參 與碳水化合物代謝。在本發明的情況下，術語“GLP-2肽”優選表示GLP-2 (1-33,34或35)， 而“經修飾的GLP-2肽”旨在表示任何GLP-2片段或變體，或GLP-2 (1-33,34或35)的片段 或變體。將變體或片段歸類為對例如GLP-2(l-33、34或3 等未經修飾序列進行修飾。與 成分⑴(GLP-1肽)中包括的生物活性序列一樣，成分(III)也可以包含GLP-2的天然存 在形式的變體或片段。作為選擇，成分(III)還可以包含GLP-I (7-37)的(N末端)序列的 至少4個、至少10個、更優選至少20個另外的氨基酸殘基，相應地包括所有的哺乳動物同 型或-本文定義的-其所有功能片段或變體。通常而言，成分(III)可以含有本文所述適 合于GLP-I融合肽的成分(I)的GLP-I肽或經修飾GLP-I肽的任何形式。在另一替代性 方案中，成分(III)還可以含有GLP-I (7-37)和GLP-2的嵌合形式。通過使GLP-I (7_37)
24和GLP-2 (或片段或變體)相互偶聯可以制得嵌合形式，并且隨后將該嵌合形式作為成分 (III)導入GLP-I融合肽。優選的是，嵌合形式由連接在一起的GLP-I (7-37)的部分序列 和GLP-2的部分序列組成。例如，嵌合形式可以包括GLP-I的N末端的5 30個氨基酸和 GLP-2的C末端的5 30個氨基酸，或者反之亦然，例如GLP-I (7-37)的第7或8位 22、 23、24、25、26、27 或 28 位氨基酸和從 GLP-2 的第 15、16、17、18、19、20、21、22、23 或 24 位氨 基酸 例如C末端的氨基酸序列。如果包含對GLP-2或GLP-I (7-37)的天然存在形式分別 進行的修飾物作為成分(III)，則成分(III)優選分別含有序列SEQ ID N0:l、4或5，或與 SEQ ID NO :1、4或5中任一序列具有至少80%序列同一性的序列。在另一實施方式中，可由包埋在本文定義的(球形)微囊的(球形)核中的細胞 編碼和分泌的GLP-I融合肽的成分(III)，可以含有本文對成分(I)、(II)或(III)所述的 多個序列。例如，成分(III)可以含有GLP-I (7-37)和/或GLP-2的至少2個，優選2個、 3個或4個拷貝或者與SEQ ID NO :1、4或5具有至少80%序列同一性的序列的至少2個拷 貝。同樣，成分(III)可以含有本文所述的GLP-I (7-37)或GLP-2的嵌合版本的多于一個 拷貝，例如最后與GLP-I (7-37)和/或GLP-2或具有至少80%序列同一性的其修飾產物一 起形成嵌合版本的組合。可由包埋在本文定義的(球形)微囊的(球形)核中的細胞編碼 和分泌的GLP-I融合肽，還可以包含兩種以上，優選兩種的成分(III)，所述成分(III)可以 例如(1)通過其N末端連接至成分(I)或(II)的C末端，和( 通過其C末端經由連接物 或直接連接至成分(I)的N末端。如果提供兩種成分(III)，它們可以相同或不同。根據一個優選實施方式，由本文定義的包埋在(球形)微囊的(球形)核中的細胞 編碼和分泌的GLP-I融合肽，可以包含本文定義的成分(I)、(II)和(III)。含有所有這些成 分的具體實施方式
優選選自由以下序列組成的組中SEQ ID N0:6(N-GLP-l(7-37)-IP2(鼠 類)-RR-GLP-I (7-37) -C,本文還命名為鼠類 CMl)、SEQ ID NO 7 (N-GLP-1 (7-37) -IP2 (鼠 類)-RR-GLP2-C,本文還命名為鼠類 CM2)、SEQ ID NO 10 (N—GLP—1 (7—37)-IP2 (人 類)-RR-GLP-I (7-37) -C，還命名為人類 CMl)和 SEQ ID NO 11 (N-GLP-1 (7-37) -IP2 (人 類)-RR-GLP-2-C)，本文還命名為人類CM2)或與SEQ ID NO :6、7、10或11或者它們的片段 或變體具有至少80%序列同一性的序列。在(緊接的)上述序列中術語“N”和“C”表示 這些融合肽的N末端和C末端。SEQ ID NO :6、7、10和11的所有序列在IP2的C末端處含 有RR-連接物(兩個精氨酸殘基)(成分(II))，作為選擇其也可以被丟棄。SEQ ID NO :6、 7、10或11的實施方式的每一個中的成分(I)是GLP-I (7-37)，而成分(111)(在這些實施 方式的每一個中與成分(II)的C末端連接)是GLP-I (7-37)或GLP-2。在該情況下優選的 GLPl-融合肽還可以包含SEQ ID NO 15、16、17、18和洸的序列。在本發明的另一優選實施方式中，可由本文定義的包埋在(球形)微囊的(球形) 核中的細胞編碼和分泌的GLP-I融合肽，除了含有成分(I)之外，還含有與成分(I)的C末 端連接和/或與成分(I)的N末端連接的成分(III)(沒有任何本文定義的成分(II))。優 選的是，成分(III)位于成分⑴的C末端。與成分(III)是否(通過其C末端)連接至 成分(I)的N末端或(通過其N末端)連接至成分(I)的C末端無關，偶聯可以是直接進 行或是經由連接物序列間接進行。關于連接物序列，對于此處公開的GLP-I融合肽而言其 是指連接GLP-I融合肽的成分⑴和成分(II)的連接物。在本發明的替代性優選實施方式中，可由本文定義的包埋在(球形)微囊的(球形)核中的細胞編碼和分泌的GLP-I融合肽，除了含有成分(I)和(II)之外，還含有與成 分(II)的C末端連接和/或與成分⑴的N末端連接的成分(III)。優選的是，成分(III) 位于成分(II)的C末端。與成分(III)是否(通過其C末端)連接至成分(I)的N末端 或(通過其N末端)連接至成分(II)的C末端無關，偶聯可以是直接進行或是經由連接物 序列間接進行。關于連接物序列，對于此處公開的GLP-I融合肽而言其也是指連接GLP-I 融合肽的成分⑴和成分(II)的連接物。可由本發明使用的包埋在(球形)微囊的(球形)核中的細胞編碼和分泌的GLP-I 融合肽，除了含有融合肽的成分的任何上述組合(即成分⑴和(II)、成分⑴和(III)或 者成分(I)、(II)和(III))之外，還可以包含作為成分(IV)的載體蛋白，特別是轉鐵蛋白 或白蛋白。所述成分(IV)可以與GLP-I融合肽的成分的任何上述組合(即，成分⑴和/ 或(II)、成分⑴和/或(III)或者成分(I)、(II)和/或(III))的N末端和/或C末端 直接連接或使用本文定義的連接物連接。在本發明的具體實施方式
中，可由本文使用的包埋在(球形)微囊的(球形)核 中的細胞編碼和分泌的本文定義的GLP-I (融合)肽，即以上定義的GLP-I肽或GLP-I融合 肽，含有作為成分(I)和/或(III)的經修飾GLP-I肽，所述經修飾GLP-I肽包含以下式II 的氨基酸序列Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaal6-Ser-Xaal8-Xaal9-Xaa20-Gl u-Xaa22-Xaa23-Ala-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36_Xaa37,其中)(aa7是 L-組氨酸；)(aa8 是 Ala、Gly、Val、Leu、Ile 或 Lys，由此特別優選Gly ； Xaa 16 是 Val 或 Leu ；Xaal8 是 Ser> Lys 或 Arg ；Xaal9 是 Tyr 或 Gln ；Xaa20 是 Leu 或 Met ； Xaa22 是 Gly 或 Glu ；Xaa23 是 Gin,Glu,Lys 或 Arg ；Xaa25 是 Ala 或 Val ；Xaa26 是 Lys,Glu 或 Arg ；Xaa27 是 Glu 或 Leu ；Xaa30 是 Ala、Glu 或 Arg ；Xaa33 是 Val 或 Lys ；Xaa34 是 Lys> Glu、Asn 或 Arg ；Xaa35 是 Gly ；Xaa36 是 Arg、Gly 或 Lys 或酰胺或不存在；Xaa37 是 Gly、 Ala、GlU、ftx)、LyS、酰胺或不存在，其中，當治療本文定義的AMI或MI或者與它們相關的疾 病時，如果本文定義的GLP-I (融合)肽由包埋在本文使用的(球形)微囊的(球形)核中 的細胞編碼和分泌的話，優先選擇這些氨基酸對有需要的患者施用，或其中)(aa7是L-組氨酸、D-組氨酸、去氨基-組氨酸、2-氨基-組氨酸、3-羥 基-組氨酸、高組氨酸(homohistidine)、N_乙酰基-組氨酸、α -氟甲基-組氨酸、α -甲 基-組氨酸、3-吡啶基丙氨酸、2-吡啶基丙氨酸或4-吡啶基丙氨酸是Ala、Gly、Val、 Leu、lie、Lys、Aib、(1_氨基環丙基)羧酸、(1_氨基環丁基)羧酸、(1_氨基環戊基)羧 酸、(1-氨基環己基)羧酸、(1-氨基環庚基)羧酸或(1-氨基環辛基)羧酸，由此特別優選 Gly ；Xaal6 是 Val 或 Leu ；Xaal8 是 Ser> Lys 或 Arg ；Xaal9 是 Tyr 或 Gln ；Xaa20 是 Leu 或 Met ；Xaa22 是 Gly,Glu 或 Aib ；Xaa23 是 Gin,Glu,Lys 或 Arg ；Xaa25 是 Ala 或 Val ；Xaa26 是 Lys、Glu 或 Arg ；Xaa27 是 Glu 或 Leu ；Xaa30 是 Ala、Glu 或 Arg ；Xaa33 是 Val 或 Lys ；Xaa34 是 Lys、Glu、Asn 或 Arg ；Xaa35 是 Gly 或 Aib ；Xaa36 是 Arg、Gly 或 Lys 或酰胺或不存在； Xaa37是Gly、Ala、Glu、ftx)、LyS、酰胺或不存在，其中，當治療本文定義的AMI或MI或者與 它們相關的疾病時，如果直接對有需要的患者提供本文定義的GLP-I (融合)肽的話，優先 選擇這些氨基酸。
在本發明的另一具體實施方式
中，由包埋在本文的(球形)微囊的(球形)核中 的細胞編碼和分泌的本文定義的GLP-I (融合)肽(即以上定義的GLP-I肽或GLP-I融合 肽)的成分(I)和/或(III)，含有經修飾GLP-I肽，所述經修飾GLP-I肽包含以下式III 的氨基酸序列Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Xaal8-Tyr-Leu-Glu-Xaa22 -Xaa23-Ala-Ala-Xaa26-Glu-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Val-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37,其中Xaa7 是 L-組氨酸；Xaa8 是 Ala、Gly, Val, Leu、lie、Lys ；Xaal8 是 Ser、Lys 或 Arg ；Xaa22 是 Gly 或 Glu ；Xaa23 是 Gln、Glu、Lys 或 Arg ；Xaa26 是 Lys、Glu 或 Arg ；Xaa30 是 Ala、Glu 或 Arg ；Xaa34 是 Lys、Glu 或 Arg ；Xaa35 是 Gly ；Xaa36 是 Arg 或 Lys、酰胺或不 存在；Xaa37是Gly、Ala、Glu或Lys、酰胺或不存在，其中，當治療本文定義的AMI或MI或 者與它們相關的疾病時，如果本文定義的GLP-I (融合)肽由包埋在本文使用的(球形)微 囊的(球形)核中的細胞編碼和分泌的話，優先選擇這些氨基酸對有需要的患者施用，或其中)(aa7是L-組氨酸、D-組氨酸、去氨基-組氨酸、2-氨基-組氨酸、-羥 基-組氨酸、高組氨酸、N-乙酰基-組氨酸、α-氟甲基-組氨酸、α -甲基-組氨酸、3-吡 啶基丙氨酸、2-吡啶基丙氨酸或4-吡啶基丙氨酸；Xaa8是Ala、Gly、Val、Leu、lie、Lys、 Aib、(1-氨基環丙基)羧酸、(1-氨基環丁基)羧酸、(1-氨基環戊基)羧酸、(1-氨基環己 基)羧酸、(I-氨基環庚基)羧酸或(I-氨基環辛基)羧酸；1脅18是^^、1^8或Arg ；Xaa22 是 Gly、Glu 或 Aib ；Xaa23 是 Gln、Glu、Lys 或 Arg ；Xaa26 是 Lys、Glu 或 Arg ；Xaa30 是 Ala、 Glu 或 Arg ；Xaa34 是 Lys、Glu 或 Arg ；Xaa35 是 Gly 或 Aib ；Xaa36 是 Arg 或 Lys、酰胺或不 存在；Xaa37是Gly、Ala、Glu或Lys、酰胺或不存在，其中，當治療本文定義的AMI或MI或 者與它們相關的疾病時，如果對有需要的患者直接提供本文定義的GLP-I (融合)肽的話， 優先選擇這些氨基酸。在一個特別優選的實施方式中，使用可由包埋在本文使用的(球形)微囊的(球 形)核中的細胞編碼和分泌的GLP-I (融合)肽，即以上定義的GLP-I肽或GLP-I融合肽， 其中成分⑴和/或(III)含有(經修飾的)GLP-I肽，所述(經修飾的)GLP-I肽選自 GLP-I (7-35)、GLP-I (7-36)、GLP-I (7-36)-酰胺、GLP-I (7-37)或者它們的變體、類似物或 衍生物。還優選的是在其成分(I)和/或(III)中包含經修飾GLP-I肽的GLP-I (融合) 肽，所述經修飾GLP-I肽在所述GLP-I肽的第8位具有Aib殘基或在所述GLP-I肽的第7位 具有選自由以下氨基酸組成的組中的氨基酸殘基D-組氨酸、去氨基-組氨酸、2-氨基-組 氨酸、羥基-組氨酸、高組氨酸、N-乙酰基-組氨酸、α-氟甲基-組氨酸、α-甲基-組氨 酸、3-吡啶基丙氨酸、2-吡啶基丙氨酸和4-吡啶基丙氨酸，這在治療本文定義的AMI或MI 或者與它們相關的疾病時，如果對有需要的患者直接提供本文定義的GLP-I (融合)肽的 話，是優選的。在另一特別優選的實施方式中，使用可由包埋在本文使用的(球形)微囊的(球 形)核中的細胞編碼和分泌的GLP-I (融合)肽，即以上定義的GLP-I肽或GLP-I融合肽， 其中由式II和III表示的本文定義的的GLP-I (融合)肽的成分⑴和/或(III)的兩種 實施方式可以與GLP-I (融合)肽的此處給出的公開內容組合。換言之，通式II和III可 以例如與成分(II)、連接物、制造方法等的此處給出的公開內容組合。優選使本文定義的GLP-I肽或GLP-I融合肽，優選本文定義的GLP-I融合肽的成分(I)以及其片段或變體，針對本文所述的蛋白水解性切割，更優選針對DPP-IV受到保護。 因此，本文定義的所述GLP-I肽或GLP-I融合肽以及其片段或變體，特別是GLP-I融合肽， 可以含有對DPP-IV具有抗性的GLP-I的序列，例如GLP-I (7-35,36或37)(在GLP-I融合 肽的情況下作為成分(I)和/或(III)的一部分)。在該情況下，肽對二肽基氨基肽酶IV 降解的抗性可以例如通過以下降解檢驗而確定使等分試樣的肽在37°C下與等分試樣的 經純化的二肽基氨基肽酶IV在pH為7 8的合適緩沖液(緩沖劑不是白蛋白)中一起溫 育4 22小時。通過添加三氟乙酸終止酶促反應，使用HPLC或LC-MS分析分離肽降解產物 并進行定量。進行該分析的一種方法是將混合物施加到hrbaX300SB-C18 (30nm孔，5 μ m 顆粒)150X2. Imm的柱上，并以0. 5ml/分鐘的流速使用線性梯度的乙腈在0. 三氟乙酸 中的溶液洗脫(0% 100%乙腈，超過30分鐘)。肽和其降解產物可以通過其在214nm(肽 鍵)或^Onm (芳香族氨基酸)處的吸光度進行監測，并通過其峰面積的積分進行定量。通 過使用其中可以確定分離峰的MS光譜的LC-MS，可以確定降解模式。使用在給定時間時完 整化合物/降解化合物的百分比來評估肽的DPP-IV的穩定性。在本文情況下，基于在給定時間時的百分比完整化合物，當比GLP-I (7-37)的未 經修飾的肽序列穩定10倍以上時，將本文定義的GLP-I肽或GLP-I融合肽，優選本文定義 的GLP-I融合肽的成分(I)，以及它們的片段和/或變體，定義為對DPP-IV具有穩定性。因 此，對DPP-IV穩定的GLP-I肽或GLP-I融合肽，優選本文定義的GLP-I融合肽的成分(I)， 優選比例如GLP-I (7-37)穩定至少10倍，更優選至少20倍。穩定性可以通過任何對本領域 技術人員而言已知的方法進行評估，例如通過向待測試的肽溶液中添加DPP-IV，并通過利 用例如光譜法、蛋白質印跡分析、抗體篩選等確定例如一段時間的肽(參見本文)的降解。并行地，將本文定義的GLP-I肽或GLP-I融合肽，優選GLP-I融合肽的成分(I)， 以及它們的片段和/或變體定義為通過例如與其天然受體(GLP-1受體)結合而發揮 GLP-I (7-37)作用的化合物。優選的是，本文定義的GLP-I (融合)肽或GLP-I融合肽，以 及它們的片段和/或變體對GLP-I受體具有結合親和性，該結合親和性相當于天然存在的 GLP-I肽的結合親和性的至少10%，優選至少50%。可以通過任何合適的方法，例如表面等 離子共振等確定結合親和性。另外，如果本文定義的GLP-I (融合)肽或GLP-I融合肽，以 及它們的片段和/或變體通過其與胞外受體的結合(該結合將信號傳遞到細胞)引起胞內 cAMP的形成，則其是優選的。根據另一優選實施方式，GLP-I肽或GLP-I融合肽(優選本文定義的GLP-I肽或 GLP-I融合肽)、以及GLP-I融合肽的單獨成分(特別是成分(I)、(II)和(III))和/或 本文所述的完整GLP-I融合肽，可以選自這些肽或蛋白序列的修飾形式。各種修飾形式，特 別是本文所述的完整GLP-I融合肽的修飾形式，可以由包埋在本文使用的(球形)微囊的 (球形)核中的細胞編碼和分泌，或者可以直接用于治療AMI或MI或者與它們相關的疾病。 這些修飾形式在下文中公開且進行了更詳細的描述，并且包括例如GLP-I肽(優選本文定 義的GLP-I肽)的片段、變體等，或者GLP-I融合肽的單獨成分(特別是成分(I)、(II)和 (III))的片段、變體等和/或本文所述的完整GLP-I融合肽的片段、變體等。在該情況下， 這些肽或蛋白質的片段和/或變體與其天然肽或蛋白質在天然的未經修飾氨基酸序列的 全長上可以具有至少40%、50%、60%、70%、80%、優選至少90%、更優選至少95%和最優 選至少99%的序列同一性。這類似地可適用到各(編碼)核酸序列上。
本文定義的術語“序列同一性”通常是指對序列進行如下比較。為了確定兩個氨 基酸序列的百分比同一性，出于進行最佳比較的目的可以對序列進行比對(例如，可以在 第一個氨基酸序列的序列中引入空位)。然后可以比較相應氨基酸位置處的氨基酸。當占 據第一序列中一個位置的氨基酸與第二序列中的相應位置的氨基酸相同時，則所述分子在 該位置處是相同的。兩個序列之間的百分比同一性是所述序列共有的相同位置的數量的 函數，例如當稱一個特定肽與規定長度的參照多肽具有特定的百分比同一性時，百分比同 一性是與參照肽有關。因此，與長度為100個氨基酸的參照多肽具有50%同一性的肽可以 是與參照多肽的50個氨基酸長的部分完全相同的50個氨基酸的多肽。其也可以是長度為 100個氨基酸的多肽，在其全長上與參照多肽具有50%同一性。當然，其它多肽會滿足相同 的標準。兩個序列的百分比同一性的所述確定可以使用數學算法來實現。用于比較兩個序 列的數學算法的優選的非限制性實例是Karlin等(1993)，PNAS USA, 90 :5873-5877的算 法。所述算法被引入NBLAST程序中，該程序可以用于鑒定與本發明的氨基酸序列具有所需 同一性的序列。為了獲得用于比較目的的空位算法，可以利用Altschul等(1997)，NUCleiC Acids Res，25 :3389-3402 中所述的 Gapped BLAST。當利用 BLAST 和 Gapped BLAST 程序 時，可以使用各程序(例如，NBLAST)的默認參數。還可以使用第9版Genetic Computing Group' s GAP (全局比對程序)，使用默認(BL0SUM62)矩陣(值_4 +11)，空位開端罰分 為-12(對于空位的第一空值)和空位延伸罰分為-4(每在空位中的各增加的連續空值)， 從而對所述序列進行進一步比對。比對后，通過將匹配數表達為要求保護序列中氨基酸數 量的百分比，從而計算百分比同一性。確定兩個氨基酸序列的百分比同一性的所述方法可 以相應地應用到核酸序列上。在本發明的情況下，使用術語“同一性”，但是，如果需要或期 望的話，還可以用術語“同源性”來代替術語“同一性”。在本發明的情況下，GLP-I肽(優選本文定義的GLP-I肽)的“片段”、或GLP-I融 合肽的單獨成分(特別是成分(I)、(II)和(III))的“片段”和/或本文所述的完整GLP-I 融合肽的“片段”，通常是指這些肽或蛋白質的任何片段。通常而言，所述片段包含保留所 需生物活性、特別是天然肽或蛋白質的所需生物活性的較短的肽，在其氨基酸序列(或其 編碼核酸序列)方面，該較短的肽與天然肽或蛋白質(或其編碼核酸序列)相比是N末端、 C末端和/或序列內截短的。因此所述截短可以發生在氨基酸水平或相應地發生在核酸水 平。通過從肽分子的任一端除去氨基酸(在肽水平或氨基酸水平上)和測試所得肽或蛋白 質具有的GLP-I的本文定義的生物性質，可以容易地鑒定生物功能片段。用于從天然肽或 蛋白質的N末端和/或C末端一次除去一個或多個氨基酸的蛋白酶，可用于確定保留所需 生物活性的片段。總的來說，片段可由在肽末端的氨基酸和/或位于肽序列內的氨基酸的 缺失引起。另外，GLP-I肽(優選本文定義的GLP-I肽)的“變體”、或GLP-I融合肽的單獨 成分(特別是成分(I)、(II)和(III))的“變體”和/或本文所述的完整GLP-I融合肽的 “變體”，優選包含蛋白質序列或其編碼核酸序列(或其片段)，其中所述天然蛋白質或肽序 列的氨基酸發生更換。由此，可以產生GLP-I肽(優選本文定義的GLP-I肽)(的變體)， 或GLP-I融合肽的單獨成分(特別是成分(I)、(II)和(111))(的變體)和/或本文所述 的完整GLP-I融合肽(的變體)，其具有的氨基酸序列與天然蛋白質或肽序列的不同之處在 于一個或多個突變，例如一個或多個取代的、插入的和/或缺失的氨基酸。優選的是，如果這些變體是GLP-I的變體、GLP-I融合肽自身或者它們的功能性變體和/或片段，則具有與 GLP-I基本相同或改善的本文定義的生物活性，即對于GLP-I已知的有益效果，例如與全長 GLP-I肽、GLP-I融合肽或GLP-I融合肽的全長單獨成分，特別是成分⑴、(II)和(III)相 比，其強烈減少由心臟組織的缺血或或缺氧引起的損傷和可能的死亡的活性。本文定義的所述變體可以通過在編碼所合成變體的DNA序列上進行突變而制備。 在由包埋在本文定義的(球形)微囊中的細胞編碼和分泌的GLP-I肽中還可以含有缺失、 插入和取代的任何組合，條件是最終獲得的變體擁有所需生物活性。顯然，在編碼變體肽 的DNA中進行的突變必須不改變閱讀框，并且優選不會形成能夠產生二級mRNA結構的互補 區。因此，GLP-I肽(優選本文定義的GLP-I肽)的變體、GLP-I融合肽的變體，GLP-I 融合肽的單獨成分(特別是成分(I)、(II)和(III))的變體和/或本文所述的完整GLP-I 融合肽的變體，與本文所述的天然GLP-I肽或天然GLP-I融合肽相比也可以含有側接在氨 基酸序列的N末端或C末端或甚至兩個末端的另外的氨基酸殘基。舉例而言，所述變體可 以包含本文定義的GLP-I肽或GLP-I融合肽，所述GLP-I肽或GLP-I融合肽含有與GLP-I 肽或GLP-I融合肽的氨基酸序列的N末端或C末端或甚至兩個末端側接的另外的氨基酸殘 基。只要所得的GLP-I肽或GLP-I融合肽保留其對蛋白酶的抗性或穩定性和如本文定義 那樣起作用的能力，則可以通過常規實驗確定任何所述側接殘基是否影響“核心”肽的基本 特性，例如GLP-I已知的其有益效果。當提及指定的本文定義的GLP-I肽時，術語“基本上
由......組成”是指可以存在不影響指定GLP-I肽的基本特性的另外的側接殘基。該術語
通常不理解為在指定序列內進行取代、缺失或添加。GLP-I肽(優選本文定義的GLP-I肽)的“變體”、GLP-I融合肽的“變體”、GLP-I融 合肽的單獨成分(特別是成分(I)、(II)和(III))的“變體”和/或本文所述的完整GLP-I 融合肽的“變體”，還可以指與其天然序列相比包含保守性氨基酸取代的分子。其中源自相 同類型的氨基酸相互交換的取代稱為保守性取代。特別地，這些是具有脂肪族側鏈、帶正電 或帶負電側鏈、側鏈中具有芳香基團的氨基酸或者是其側鏈(例如具有羥基官能的側鏈) 可以進入氫橋的氨基酸。這意味著例如具有極性側鏈的氨基酸被另一具有類似極性側鏈的 氨基酸置換，或例如，特征在于疏水性側鏈的氨基酸被另一具有類似疏水性側鏈的氨基酸 取代。可以進行插入和取代，特別是在對三維結構不引起改變或不影響結合區域的那些序 列位置處的插入和取代。插入或缺失對三維結構引起的改變可以使用CD譜(圓二色性譜) 容易地石角定(Urry，1985，Absorption，Circular Dichroism and ORD of Polypeptides，在 Modern Physical Methods in Biochemistry, Neuberger 等(ed.)，Elsevier, Amsterdam 中)。因此GLP-I肽(優選本文定義的GLP-I肽)的變體、GLP-1融合肽的變體、或GLP-I 融合肽的單獨成分(特別是成分(I)、(II)和(III))的變體和/或本文所述的完整GLP-I 融合肽的變體，還可以指與完整GLP-I肽(優選本文定義的完整GLP-I肽)、完整GLP-I融 合肽、或者GLP-I融合肽的單獨成分(特別是成分(I)、(II)和(III))，或者其片段基本上 類似的分子。所述變體肽可以使用本領域公知的方法常規制備。當然，所述變體會具有對 于天然GLP-I肽(優選本文定義的GLP-I肽)、GLP-I融合肽、或GLP-I融合肽的單獨成分 (特別是成分⑴、(II)和(III))和/或本文所述的完整GLP-I融合肽而言已知的類似有益效果。例如對于GLP-I而言，所述有益效果是與相應的天然存在的GLP-I肽一樣，強烈減 少由缺血或缺氧引起的損傷和心臟組織的可能死亡的活性。可以在GLP-I肽(優選本文定義的GLP-I肽)的變體、GLP-I融合肽的變體、或 GLP-I融合肽的單獨成分(特別是成分(I)、(II)和(III))的變體和/或本文所述的完整 GLP-I融合肽的變體中含有的保守性氨基酸取代的種類，可以基于對不同物種的同源性蛋 白質/肽之間氨基酸改變的頻率進行的分析。基于所述分析，保守性取代可以在此處定義 為在以下5組中任一組內的交換I.小型、脂肪族、非極性或輕微極性的殘基:Ala、Ser、Thr、Pr0、Gly ；II.極性、帶負電的殘基和其酰胺ASp、ASn、Glu、Gln ；III.極性、帶正電的殘基:His, Arg, Lys ；IV.大型，脂肪族非極性殘基Met、Leu、lie、Val、Cys ；￥.大型芳香族殘基斤1^、1^7、1^)。上述各組內，認為以下取代是“高度保守性的” :Asp/Glu ；His/Arg/Lys ；Phe/Tyr/ Trp Met/Leu/Ile/Val。將半保守性取代定義為此處組(I)-(IV)中兩組之間的交換，可 將其限定于包含此處(I)、(II)和(III)的超組(A)，或限定于包含此處(IV)和(V)的超 組(B)。取代不限于遺傳編碼的氨基酸或甚至天然存在的氨基酸。在本文意義內的同義 (synonymous)氨基酸殘基的優選組的優選的保守性氨基酸取代特別包括，但不限于以下
0128]氨基酸同義殘某0129]SerSer,Thr, Gly, Asn0130]ArgArg,Gin, Lys, Glu, His0131]Leulie,Phe, Tyr, Met, Val, Leu0132]ProGly,Ala, (Thr)，Pro0133]ThrPro,Ser, Ala, Gly, His, Gin,Thr0134]AlaGly,Thr, Pro, Ala0135]ValMet,Tyr, Phe, lie, Leu, Val0136]GlyAla,(Thr), Pro, Ser, Gly0137]IleMet,Tyr,Phe, Val, Leu, lie0138]PheTrp,Met,Tyr, lie, Val, Leu,Phe0139]TyrTrp,Met,Phe, lie, Val, Leu,Tyr0140]CysSer,Thr,Cys0141]HisGlu,Lys,Gin, Thr, Arg, His0142]GlnGlu,Lys,Asn, His, (Thr), Arg, Gln0143]AsnGin,Asp,Ser, Asn0144]LysGlu,Gin,His, Arg, Lys0145]AspGlu,Asn,Asp0146]GluAsp,Lys,Asn, Gin, His, Arg, Glu0147]MetPhe，lie,Val, Leu, Met0148]TrpTrp0149]另外，GLP-I肽(優選本文定義的GLP-I肽)的變體、GLP-I融合肽的變體、或GLP
31融合肽的單獨成分(特別是成分(I)、(II)和(III))的變體和/或本文所述的完整GLP-I 融合肽的變體，還可以含有例如旨在改善溶解性而進行的氨基酸取代(用親水性氨基酸置 換疏水性氨基酸)。在一個特別優選的實施方式中，可由包埋在本文定義的(球形)微囊的(球形) 核中的細胞編碼和分泌的本文定義的GLP-I肽或GLP-I融合肽，包括特征在于在GLP-I 肽的第 7、8、11、12、16、22、23、M、25、27、30、33、34、35、36 或 37 位具有一個或多個取代的 GLP-I肽(存在于GLP-I融合肽的成分⑴和/或(III)中)。作為以下命名的一個實 例，[Arg34-GLP-1 (7-37)]命名了其中在第34位處的其天然存在的賴氨酸被精氨酸取代的 GLP-I類似物。具體地，本文定義的GLP-I肽或者GLP-I融合肽的成分⑴和/ 或(III)可以對應于GLP-I (7-35、36、37或38)的變體，該變體包括，例 如 Gln9-GLP-1(7-37)、Thrl6-Lysl8-GLP-1(7-37)禾口 Lys18-GLP — 1(7 — 37)、 Arg34-GLP-1(7-37)、Lys38-Arg26-GLP_1(7-38)-OH、Lys36-Arg26-GLP_1 (7-36)、 Arg26,34-Lys38-GLP-l (7-38) , Arg26,34-Lys38-GLP-1(7-38) , Arg26, 34-Lys38-GLP-l (7-38)、Arg26, 34-Lys38-GLP-l (7-38)、Arg26, 34-Lys38-GLP-l (7-38)、 Arg26-Lys38-GLP-1 (7-38)、Arg26-Lys38-GLP_1 (7-38)、Arg34-Lys38-GLP_1 (7-38)、 Ala37-Lys38-GLP-l(7-38)和 Lys37-GLP_1 (7-37)。更通常而言，本文提及的任何 GLP-I 變 體(特別是根據式II或III)可以通過在第38位處添加Lys殘基而進行修飾。如果將本文所述的GLP-I肽或GLP-I融合肽直接施用以治療AMI或MI或者與 它們相關的疾病，本文定義的GLP-I肽或者GLP-I融合肽的成分⑴和/或(III)可 以另外地對應于GLP-I (7-35、36、37或38)的變體，所述變體包括Gln9_GLP_l (7-37)、 D-Gln9-GLP-1 (7-37)、乙酰基-Lys9_GLP_l (7-37)。在本發明一個特別優選的實施方式中，本文定義的GLP-I肽或GLP-I融合肽(關 于成分⑴或(III))是/含有(經修飾的)GLP-I肽，所述(經修飾的)GLP-I肽選自 GLP-I (7-35)、GLP-I (7-36)、GLP-I (7-36)-酰胺、GLP-I (7-37)或它們的片段或變體。出于體外控制的目的，本文定義的GLP-I肽或GLP-I融合肽可以例如使用常規分 離技術從表達其的細胞分離(并進而從微囊分離)。因而細胞可以在合適條件下體外生長， 例如包括支持體和營養物，并且如果分泌蛋白(即本文定義的GLP-I肽或GLP-I融合肽，或 者它們的片段或變體)由包埋在(球形)微囊的(球形)核中的細胞編碼和分泌的話，則 從胞外培養基中進行回收。因此為了轉染到細胞中而工程化的(載體)序列優選包括允許 本文定義的GLP-I肽或GLP-I融合肽分泌的信號(肽)序列(參見以下)。在該情況下，本 文定義的GLP-I肽或GLP-I融合肽，或者它們的片段或變體如果由包埋在(球形)微囊的 (球形)核中的細胞編碼和分泌的話，則可以將其與信號序列天然內源性地融合或在將編 碼核酸序列通過基因工程方法轉染導入細胞之后與信號序列融合。在替代性方案中，編碼 本文定義的GLP-I肽的工程化基因序列不包括所述信號肽序列，由此胞內表達的GLP-I肽 或GLP-I融合肽通常不分泌，并且可以通過涉及細胞裂解的方法從細胞中回收。在所述方 法中，編碼序列可以包括允許從培養基中有效提取產物肽的純化標簽，標簽可以被切割下 從而釋放分離的GLP-I肽。但是，該替代性方案通常與本發明使用的(球形)微囊的細胞 無關，本發明使用的(球形)微囊的細胞被植入患者中并且需要將體內表達和分泌的本文定義的GLP-I肽或GLP-I融合肽遞送到周圍組織中。如果不另外指出，任何本文所述的實施方式或特征可以相互組合。包埋在本發明使用的(球形)微囊的(球形)核中的細胞優選編碼和分泌本文定 義的GLP-I肽或GLP-I融合肽，以及可選的另外的因子，例如本文定義的抗凋亡劑、VEGF等。 為此目的，本文定義的GLP-I肽或GLP-I融合肽或者它們的片段或變體以及還有另外的因 子，由至少一種核酸序列編碼，所述至少一種核酸序列在制備(球形)微囊的(球形)核之 前通常轉染到細胞中。這些核酸序列可以在細胞中天然存在或可以在制備(球形)微囊之 前通過細胞轉染技術導入細胞中。根據本發明，可以使用編碼本文定義的GLP-I肽的任何 合適的核酸序列。根據一個實施方式，編碼本文定義的GLP-I肽或GLP-I融合肽、或者它們的片段 或變體，以及可選的另外的因子(例如本文定義的抗凋亡劑、VEGF等)的核酸序列，可以選 自任何核酸，更優選選自適于編碼(至少一種)肽或蛋白質的任何核酸，即編碼核酸，例如 選自例如基因組DNA、cDNA、DNA寡核苷酸等的編碼DNA，或選自例如(短)RNA寡核苷酸、信 使RNA(mRNA)等的編碼RNA，等等。在本發明的情況下，mRNA通常是由幾種結構元件組成的 RNA，所述結構元件例如有可選的5’ -UTR區、后面是編碼區的上游定位核糖體結合位點、可 選的3’-UTR區、其后可以是聚A尾(和/或聚C-尾)。mRNA可以作為單順反子、雙順反子 或甚至多順反子RNA，即攜帶一個、兩個或多個本文所述的蛋白質或肽的編碼序列的RNA存 在。s雙順反子或甚至多順反子mRNA中的所述編碼序列可以被至少一個IRES序列分隔開。 所述至少一種核酸序列還可以是核糖體RNA (rRNA)、轉移RNA (tRNA)或病毒RNA (vRNA)。另 外，所述至少一種核酸序列可以是環形或線性核酸，優選是線性核酸。另外，所述至少一種 核酸序列可以是單鏈或雙鏈核酸序列(其也可以視為由于兩個單鏈核酸之間的非共價連 接產生的本發明意義內的核酸)或者部分雙鏈或部分單鏈核酸，其至少部分自體互補(這 些部分雙鏈核酸或部分單鏈核酸通常均由較長單鏈核酸和較短單鏈核酸形成或由兩個長 度上近似相等的單鏈核酸形成，其中一個單鏈核酸與另一個單鏈核酸部分互補，由此二者 在該區域形成雙鏈核酸，即部分雙鏈或部分單鏈核酸)。由于遺傳編碼的簡并性，多種核酸序列可以編碼本文定義的這種GLP-I肽或 GLP-I融合肽，以及可選的另外的因子，例如本文定義的抗凋亡劑、VEGF等。根據本發明的 優選實施方式，用于轉染本文定義的細胞的核酸序列可以包含編碼本文定義的GLP-I肽或 GLP-I融合肽的任何核酸序列和另外的(功能性)核苷酸序列。本發明優選適于轉染本文 定義的細胞的核酸序列，其可以編碼(a)本文定義的GLP-I肽或GLP-I融合肽，特別是編碼 完整GLP-I氨基酸序列(GLP-1 (1-37)或功能性GLP-I (7-35,36或37)(變體)序列或者任 何其它GLP-I肽，包括本文定義的GLP-I融合肽，(b)可選地編碼位于(a)所述的GLP-I序 列的N末端處的蛋白酶切割序列，以及可選的編碼(b)上游的信號肽序列，以及(c)可選的 編碼本文所述的另外的因子。優選的是，信號(肽)序列選自如下定義的序列。因此，所得 的氨基酸序列可由(優選從N末端至C末端)信號肽序列、可選的蛋白酶切割序列和本文 定義的GLP-I肽或GLP-I融合肽、或者它們的片段或變體(和可選的另外的因子，例如本文 定義的抗凋亡劑、VEGF等)組成。由此，信號肽序列和蛋白酶切割序列優選與宿主細胞(中 天然存在的序列)是異源性的，并且在本文定義的GLP-l(5-37、6-37或7-37)及其變體的 情況下，優選不同之處在于在此處附帶條件的定義內的天然GLP-I的第1 6位氨基酸。
本文定義的核酸序列可以包含在載體中。因此，包埋在本發明使用的(球形)微 囊的(球形)核中的細胞可以含有包含之前本文定義的核酸的載體。該載體可用于轉染本 文定義的細胞以制備本發明使用的(球形)微囊。通常而言，所述載體，特別是表達載體， 含有至少一個編碼元件(a)和可選的本文所述的(b)和/或(c)的本文限定的核酸序列， 和本文所述的另外的元件(需要時)，例如適于指導編碼元件(a)和可選的本文所述的(b) 和/或(c)表達的元件，以及可選的編碼諸如抗凋亡因子VEGF等另外的因子的序列。本文 使用的一類載體利用提供源自動物病毒(例如牛乳頭狀瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒或SV40 等)的自主復制染色體外質粒的DNA元件。本文使用的第二類載體依賴于所需基因序列在 宿主細胞染色體中的整合。適于在將細胞包埋在本發明使用的(球形)微囊的(球形)核中之前轉染細胞的 所述載體，通常通過將編碼元件(a)和可選的本文所述的(b)和/或(c)(例如本文定義的 GLP-I肽或GLP-I融合肽或者它們的片段或變體，以及可選的本文定義的另外的因子)的至 少一種核酸序列插入到合適的(空)載體中而制備。所述合適的(空)載體對本領域技術 人員而言是已知的并且可以例如在“Cloning Vectors”(Eds. Pouwels P. H.等Elsevier， Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN O 444 904018)中回顧。合適的(空)載體還旨 在包括本領域技術人員已知的任何載體，例如質粒、噬菌體、諸如SV40、CMV、桿狀病毒、腺病 毒、辛德畢斯病毒等病毒、轉座子、IS-元件、噬粒(phasmid)、噬菌粒(phagemide)、粘粒、線 性DNA或環狀DNA。為了在哺乳動物細胞中整合，通常使用線性DNA。優選的是，用于本發 明的載體類型符合特定的宿主細胞要求。可以在其中插入創造性的核酸序列和/或載體的 合適的市售表達載體，包括pSPORT、pBluescriptIISK、桿狀病毒表達載體pBlueBac和原核 表達載體pcDNAII，所有這些都可以獲自hvitrogen Corp. , San Diego，CA。適于在將細胞包埋在本發明使用的(球形)微囊的(球形)核中之前轉染細胞的 本文定義的載體，通常將本文定義的核酸序列與例如控制編碼氨基酸序列的表達的其它調 控元件組合。所述調控元件是例如1)對身體組織或區域具有特異性；幻組成型；；3)具有 葡萄糖響應性；和/或4)可誘導/可調控。本文的調控元件優選選自調控序列和復制原點 (如果載體是自體復制的話)。本發明范圍內的調控序列是本領域技術人員已知的任何對 編碼核酸序列的表達、轉錄和/或翻譯具有影響的元件。調控序列包括遠離啟動子序列的 所謂的增強子序列，由于RNA聚合酶和DNA之間的增強相互作用增強子序列可以引起增強 的表達。創造性載體的另外調控序列是轉錄調控和翻譯起始信號，所謂的“終止子”等或其 部分序列。通常而言，在適于轉染可用于制備本文使用的(球形)微囊的細胞的表達載體 中，可以包含任何天然存在的啟動子。所述啟動子可以選自任何真核生物、原核生物、病 毒、細菌、植物、人類或諸如哺乳動物等動物的啟動子。合適的啟動子包括，例如，巨細 胞病毒啟動子、IacZ啟動子、gal 10啟動子和AcMNPV多面體啟動子、諸如cos-、tac_、 trp-> tet_、trp_tet_、lpp-> lac—、lpp_lac_、laclq-> T7-> T5-> T3-> gal—、trc_、ara-> SV40-、SP6、I-PR-或I-PL-啟動子等啟動子，有利地是在革蘭氏陰性細菌中發現的啟動 子。另外，啟動子可以獲自革蘭氏陽性啟動子如3!1^和5 02，酵母啟動子如40(1、1^^、八(、 P-60、CYCU GAPDH，或哺乳動物啟動子如巨細胞病毒(CMV)啟動子、包括哺乳動物肌肉肌 酸激酶(MCK)啟動子在內的肌肉特異性啟動子、哺乳動物肌間線蛋白啟動子(mammaliandesmin promoter)、哺乳動物肌鈣蛋白I (TNNI2)啟動子或哺乳動物骨骼α-肌動蛋白 (ASKA)啟動子等，，或者肝型丙酮酸激酶啟動子，特別是(-183 +12)或(-96 +12)的 那些片段(Thompson，等 J Biol Chem, (1991). 266 :8679-82. ；Cuif, et al.，Mol Cell Biol, (1992). 12 :4852-61) ； spot 14 啟動子(S14, -290 +18) (Jump，等，J.Biol Chem, (1990). 265 :3474-8)；乙酰輔酶 A 羧化酶(0' Callaghan，等，J.Biol Chem, (2001). 276 16033-9)；脂肪酸合酶(-600 +65) (Rufo，等，J Biol Chem, (2001). 28 28)；和葡萄 糖-6-磷酸酶(大鼠和人類)(Schmol 1,等，FEBS Left, (1996). 383 :63-6 ；Argaud,等， Diabetes, (1996) · 45 1563-71)，或來自 CaM-Kinasell、巢蛋白(nestin)、L7、BDNF、NF、 MBP、NSE、β -球蛋白、GFAP、GAP43、酪氨酸羥化酶、Kainat-受體-亞基1、谷氨酸鹽-受 體-亞基B的啟動子、或人類泛素啟動子B(ubiB人類)、人類鐵蛋白H啟動子(FerH)，等。特 別優選的啟動子具有人類或哺乳動物原點。最后，可以有利地使用合成啟動子。為了體外控 制目的，在創造性載體中含有的啟動子序列，還可以是誘導型的，以允許調控表達(例如通 過在生長培養基中存在或不存在營養物或其它誘導劑)。一個實例是獲自噬菌體Xplac5 的Iac操縱子，其可以通過IPTG誘導。最后，本文定義的啟動子可以與本文定義的GLP-I 編碼核酸序列、和可選的諸如本文定義的抗凋亡劑、VEGF等另外的因子連接，從而使得啟動 子定位于GLP-I編碼核酸序列的5' “上游”。優選的是，使用人類啟動子，例如人類泛素啟 動子B(ubiB人類)或人類鐵蛋白H啟動子(FerH)。用于上調本文定義的GLP-I編碼核酸序列的表達的增強子序列優選是本文定 義的載體或表達的另一組分。所述增強子序列通常位于載體的非編碼3'區。本文定 義的載體中使用的增強子序列可以獲自任何真核生物、原核生物、病毒、細菌、植物、人類 或動物如哺乳動物宿主，優選與本文定義的相應啟動子相連系。本發明中最有用的增強 子元件是具有葡萄糖響應性、胰島素響應性和/或肝特異性的增強子元件。增強子元 件可以包括CMV增強子(例如，與泛素啟動子(Cubi)連接)；一種或多種葡萄糖響應性 元件，包括肝丙酮酸激酶(L-PK)啟動子的葡萄糖響應性元件(GlRE) (-172 -14 ；和 具有增強響應性的修飾版本(Cuif等，出處同上；Lou，等，J.Biol Chem, (1999).274 28385-94)；具有輔助性 L3 盒的 L-PK 的 GlRE (-172 -126) (Diaz Guerra，等，Mol Cell Biol, (1993). 13 :7725-33 ；具有輔助性L3盒的增強響應性GlRE的修飾版本；S 14的碳 水化合物響應性元件(ChoRE) (-1448 -1422)，和在較低濃度時激活的修飾物(Shih和 Towle, J Biol Chem, (1994). 269 :9380-7 ；Shih，等，J Biol Chem, (1995). 270 :21991-7 ； 和Kaytor，等，J Biol Chem, (1997). 272 :7525-31 ；具有S 14的相鄰輔助因子位置的 ChoRE (-1467 -1422)[等，出處同上]；酸縮酶(+1916 +2329) (Gregori 等，J Biol Chem, (1998). 273 :25237-43 ；Sabourin，等，J. Biol Chem, (1996). 271 :3469-73 ；和脂肪酸 合成酶(-7382to-6970) (Rufo，等，出處同上)，更優選的是諸如葡萄糖-6-磷酸酶胰島素響 應性元件(-780 -722)等胰島素響應性元件[Ayala等，Diabetes, (1999). 48 :1885-9 ； 以及肝特異性增強子元件，如凝血酶原(940 -860) [Chow等，J Biol Chem, (1991)266 18927-33]和 α -1-微球蛋白(-四45 -2539) [Rouet 等，Biochem J, (1998). 334 577-84)，肌肉特異性增強子，如哺乳動物MCK增強子、哺乳動物DES增強子和脊椎動物肌鈣 蛋白I IRE(TNI IRE，本文還稱為FI拙)增強子。最后，還可以包括SV40增強子序列。增強子元件還可以與用于上調本文定義的GLP-I編碼核酸序列的表達的本文定義的啟動子一起使用，例如所述啟動子/增強子組合包括例如巨細胞病毒(CMV)啟動子和 CMV增強子、與泛素啟動子(Cubi)連接的CMV增強子、與其相應的啟動子組合使用的包括人 類血清白蛋白[HSA]增強子、人類凝血酶原[HPrT]增強子、微球蛋白[Α1ΜΒ]增強子 和內含性醛縮酶增強子在內的肝特異性增強子元件的組，或與選自CMV啟動子或HSA啟動 子的啟動子組合使用的HSA增強子、與CMV啟動子組合使用的選自由人類凝血酶原[HPrT] 和α-1微球蛋白[Α1ΜΒ]組成的組中的增強子元件、與α-1-抗胰蛋白酶啟動子組合使用 的選自由人類凝血酶原[HPrT]和α-1微球蛋白[Α1ΜΒ]組成的組中的CMV增強子元件，等等。另外，適于對可用作本發明使用的(球形)微囊的組分的細胞進行轉染的本文定 義的載體，可以含有轉錄和/或翻譯信號，優選的是被合適宿主識別的轉錄和/或翻譯信 號，例如轉錄調控和翻譯起始信號。轉錄和/或翻譯信號可以獲自任何真核生物、原核生 物、病毒、細菌、植物、優選人類或動物如哺乳動物宿主，優選與本文定義的的相應啟動子相 連系。因此根據宿主細胞識別與GLP-I編碼核酸序列和可選地本文定義的另外因子相連系 的轉錄調控和翻譯起始信號的程度的宿主的性質，可以使用多種轉錄和翻譯調控序列。可 以保留與天然存在的GLP-I編碼核酸序列相鄰的5'區并用于在創造性載體中進行轉錄 和翻譯調控。該區域通常包括參與轉錄和翻譯啟始的那些序列，例如TATA盒、加帽序列和 CAAT序列等。通常而言，該區域通常長度為至少約150個堿基對，更通常是約200bp，并且 幾乎不超過約1 21Λ。可以選擇允許控制抑制或激活的適于本文定義的載體的轉錄起始調控信號，從而 能夠調節本文定義的GLP-I編碼核酸序列和可選地本文定義的另外因子的表達。一種所述 可控調節技術是使用溫度敏感性調控信號，從而通過改變溫度來抑制或啟動表達。另一種 可控調節技術是使用對某些化學物敏感的調控信號。這些方法優選用于體外程序，例如當 制備所需構建體時。另外，本文可以使用轉錄起始調控信號，所述轉錄起始調控信號允許不 使用來自細胞外的任何另外手段即可控制體內表達的抑制或激活，從而例如獲得封裝細胞 中的瞬時表達。所述轉錄和/或翻譯信號包括例如轉錄終止調控序列，例如停止信號和多 腺苷酸化區域。另外，轉錄終止調控序列可以位于含有GLP-I編碼核酸序列的本文定義的 載體的非編碼3'區。合適的終止序列可以包括，例如，牛生長激素、SV40、lacZ、EFl α和 AcMNPV多面體多腺苷酸化信號。適于轉染可用于制備本發明使用的(球形)微囊的細胞的表達載體，還可以包括 用于使本文定義的GLP-I編碼核酸序列和可選地本文定義的另外因子進行最佳表達的其 它序列。所述序列包括編碼信號(肽)序列的序列，即編碼為分泌蛋白進入或通過膜提供 通道的位于N末端的肽序列的序列；為表達產物提供穩定性的序列；和為通過限制性內切 核酸酶切割提供位點的限制性酶識別序列。所有這些材料是本領域已知的，并且商購可得 (參見，例如，Okayama (1983)，Mol. Cell. Biol.，3 :280)。本文定義的“信號序列”是這樣的信號(肽)序列，其通常包含約8 30個氨基 酸，或15 30個氨基酸，(在關于GLP-I的第1 6位氨基酸在本文條件的定義內)位于 所表達GLP-I(融合)肽的N末端并且使GLP-I肽能夠得以分泌，即通過細胞膜。所述信號 (肽)序列可以包括正常與野生型GLP-I前體蛋白相連系的信號序列(即全長胰高血糖素 原前體分子的信號序列)，以及正常不與其相連系的信號(肽)序列，即其對野生型GLP-I
36前體蛋白(即，全長胰高血糖素原前體分子的信號(肽)序列)是異源性的。本文定義的 “信號(肽)序列”可以例如是信號肽序列或前導序列(例如分泌信號(和前導)序列)。另 外，本文定義的信號(肽)序列優選提供了諸如信號(肽)序列蛋白酶等蛋白酶對(GLP-I) 前體肽的切割。當通過蛋白酶從(GLP-I)前體肽切割信號(肽)序列時，產生本文定義的 生物活性GLP-I肽。所述信號(肽)序列通常包含編碼被蛋白酶識別以用于切割的切割位 點的區域。作為選擇，可以將編碼被蛋白酶識別以用于切割的切割位點的區域引入到信號 (肽)序列中。另外，可以將編碼被蛋白酶識別以用于切割的切割位點的另外的(一個或多 個)序列添加到信號(肽)序列中。可由本文定義的載體編碼的信號(肽)序列的實例包括源自以下蛋白的信號 (肽)序列分泌蛋白，如GLP-I或除GLP-I之外的分泌蛋白，例如細胞因子、凝固因子、 免疫球蛋白、分泌酶或激素(包括激活多肽(PACAP)/胰高血糖素超家族的垂體腺苷酸環 化酶)和血清蛋白等。例如，本文定義的信號(肽)序列可以源自分泌的基質金屬蛋白 酶(MMP)例如基質溶素前導序列，例如源自分泌的人類堿性磷酸酶(SEAP)，原毒蜥外泌 肽(proexendin)、例如原毒蜥外泌肽_4前導序列、毒蜥素原(pro-helodermin)、原-葡萄 糖-依賴性促胰島素多肽(GIP)、原胰島素樣生長因子(IGFl)、前原胰高血糖素、α -1抗胰 蛋白酶、胰島素樣生長因子1、人類因子IX、人類淋巴毒素A(Genbank登錄號ΒΑΑ00064)，或 人類簇蛋白(Genbank登錄號AAP88927)。本文定義的信號(肽)序列的具體實例是包括用 于通過信號肽酶、弗林蛋白酶或其它激素原轉換酶(例如，PC3)進行前體切割的信號的編 碼區域的序列。例如，可被弗林蛋白酶(還稱為PACE，參見美國專利第5，460，950號)、其 它枯草桿菌蛋白酶(包括 PC2、PC1/PC3、PACE4、PC4、PC5/PC6、LPC/PC7IPC8/SPC7 和 SKI-1 ； Nakayama, Biochem. J.，327 :625-635(1997))；腸激酶(參見美國專利第 5，270，181 號) 或胰凝乳蛋白酶切割的信號(肽)序列可以被引入本文定義的信號(肽)序列中。通過 參考將這些文獻中每一篇的內容本文并入。弗林蛋白酶是遍在表達的蛋白酶，在其存在于 順式高爾基體中并在蛋白分泌之前對蛋白前體進行加工。弗林蛋白酶在其共有識別序列， Arg-X-Lys-Arg 或 Arg-X-Arg-Arg、(Lys/Arg) -Arg-X- (Lys/Arg) -Arg 禾口 Arg-X-X-Arg,例如 Arg-Gln-Lys-Arg的COOH-末端處進行切割。這些氨基酸序列是使前體被弗林蛋白酶切割 的信號。因此，異源性信號(肽)序列還可以根據從信號(肽)序列匯集的共有序列(例 如，從被信號肽酶切割的分泌蛋白匯集的共有序列)合成。除了本文定義的調控序列之外，本文定義的自主復制載體通常包含復制原點。合 適的復制原點包括，但不限于，例如ColEl、pSC101、SV40、pMPI(ori pMPI)和M13復制原點寸。優選的是，適于本文定義的(球形)微囊的細胞的GLP-I編碼核酸序列和可選地 本文定義的另外因子的表達的本文定義的載體，可以另外地含有自殺基因。在本發明的情 況下，當施用特定物質時優選“自殺基因”能夠通過殺死在(球形)微囊的(球形)核中含 有的攜帶有自殺基因的細胞而停止使用本文所用的(球形)微囊進行治療。換言之，可以通 過施用在人類或動物體內通常不存在的外源性激活劑，從而激活適于本發明的自殺基因。 在該情況下，通常自殺基因啟動使細胞經受凋亡事件的級聯。作為選擇，適于本發明的自殺 基因可以代謝所施用的在人類或動物體內通常不存在的外源性非毒性前藥。外源性非毒性 前藥的代謝優選使所述前藥成為細胞毒素。自殺基因可以包含在編碼本文定義的GLP-I肽或GLP-I融合肽的同一載體上或作為選擇包含在第二載體上。另外，可以通過任何種類的 控制和調控元件，例如作為表達載體組分的諸如以上提及的啟動子、增強子等控制和調控 元件，或通過其天然存在的控制和調控元件，從而對自殺基因進行調控。優選的是，根據本 發明選擇允許任何本文控制機制的自殺基因，例如選自胞嘧啶脫氨酶(CD)、尿嘧啶磷酸核 糖基轉移酶(UPRTase)、HSV胸腺嘧啶核苷激酶(HSV-Tk)的自殺基因，可以通過添加四環 素如細菌Tet阻遏蛋白(TetR)而誘導的自殺基因。作為具體實例，可以使用胞嘧啶脫氨酶 (CD)0胞嘧啶脫氨酶(CD)通常出現在各種生物體中，并且能夠將5-氟胞嘧啶(5-FC)轉化 成代表常見化療劑的5-氟尿嘧啶(5-FU)。5-氟尿嘧啶(5-FU)對于生物體具有高毒性，而 其前藥5-氟胞嘧啶(5-FC)對細胞是無毒的。隨后5-氟尿嘧啶(5-FU)通過細胞激酶而磷 酸化，并且能夠阻止細胞RNA合成。因此，前藥5-氟胞嘧啶(5-FC)代表用于誘導特定細胞 的自殺的優良工具。另外，5-氟-dUMP充當抗葉酸劑，并且抑制酶胸苷酸合酶(thymidylat synthase)，該胸苷酸合酶在脫氧核糖核苷酸的從頭合成途徑中催化dUMP甲基化為dTMP。 由此，可以實現細胞中DNA合成的抑制。還優選的是，可以使用HSV-I胸腺嘧啶核苷激酶 (ATP 胸腺嘧啶核苷-5-磷酸轉移酶)和其相應的前藥丙氧鳥苷(ganciclovir，GCV)。鳥 嘌呤核苷類似物GCV特異性磷酸化，并且抑制DNA合成的延伸，以及由此引起細胞的自殺。將編碼GLP-I肽或GLP-I融合肽以及可選的另外因子的本文定義的載體或核酸 轉染到用于制備本文定義的(球形)微囊的合適細胞中，可以通過本領域技術人員已知的 任何方法實現(參見例如 Maniatis 等(2001)Molecular Cloning :A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor，NY)。如果將載體轉染到本 文定義的合適細胞，優選載體以攜帶GLP-I肽或GLP-I融合肽編碼核酸的質粒DNA的形式 存在。質粒DNA優選是環狀質粒DNA。合適的轉染方法包括，但不限于，例如包括改進的電 穿孔技術(例如核轉染)在內的電穿孔技術、諸如磷酸鈣共沉淀法等磷酸鈣技術、DEAE-右 旋糖酐法、諸如轉移-介導的脂質轉染法等脂質轉染法等。優選的是，利用改進的電穿孔技 術(例如核轉染)使用攜帶本文定義的載體的質粒DNA進行轉染。本文定義的載體，或作為選擇，編碼本文定義的GLP-I肽或GLP-I融合肽或者它們 的片段或變體、以及可選的本文定義的另外因子的核酸，還可以與至少一種合成聚合物或 天然聚合物(例如聚氨基酸)進行復合(complex)，例如以用于轉染，或可以與其綴合。至 少一種聚合物組分可以與本文定義的載體共價連接，或作為選擇，與編碼本文定義的GLP-I 肽或GLP-I融合肽或者它們的片段或變體、以及可選的本文定義的另外因子的核酸共價連 接。本發明意義內的“綴合”是指“化學偶聯”。“化學偶聯”是指經由共價連接或非共價連 接偶聯。雖然也可以使用共價連接，但是為了轉染目的優選非共價連接。由此，聚合物組分 可以經由復合而不是共價連接，例如經由氫鍵或靜電、疏水性等相互作用與融合肽連接。用于偶聯本文定義的載體的本文使用的聚合物，或作為選擇，用于偶聯編碼本文 定義的GLP-I肽或GLP-I融合肽或者它們的片段或變體、以及可選的本文定義的另外因子 的核酸的本文使用的聚合物，可以是生理學上可接受的聚合物，其包括在水溶液或懸浮液 中可溶并且當以藥學上有效量施用融合肽時對哺乳動物沒有諸如副作用等負面影響的聚 合物。對于本發明使用的生理學上可接受的聚合物沒有特別限制。該聚合物可以具有合成 性質或可以是天然存在的聚合物(例如蛋白質)。更通常而言，與本文定義的載體一起使用的合成聚合物，或作為選擇，與編碼本文定義的GLP-I肽或GLP-I融合肽或者它們的片段或變體、以及可選的本文定義的另外因子 的核酸一起使用的合成聚合物，優選選自亞烷基二醇，如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)、 乙二醇和丙二醇的共聚物、聚氧乙烯多元醇、聚烯烴醇、聚乙烯基吡咯烷酮、聚羥基烷基甲 基丙烯酰胺、諸如聚羥基亞乙基甲基丙烯酸酯等聚羥基烷基甲基丙烯酸酯、聚丙烯酸酯、多 糖、聚([α]_羥基酸)、聚乙烯基醇、聚磷腈、聚喁唑啉、聚(N-丙烯酰基嗎啉)、聚乙烯基乙 基醚、聚乙烯醇縮乙醛、聚乳酸乙醇酸、聚乳酸、脂質聚合物、殼多糖、透明質酸、聚氨酯、聚 唾液酸、三乙酸纖維素、硝酸纖維素和任何以上的組合。本發明還提供用于制備本發明使用的(球形)微囊的方法。這些(球形)微囊優 選根據兩步方法步驟或多步方法步驟制備。根據方法步驟1)，制備如上所述的核。根據方 法步驟幻，用一層或多層表面涂布層涂布根據方法步驟1)制備的核。另外的可選步驟可以 包含方法步驟幻的重復以用于制備另外的表面涂布層。優選的是，對于所述另外表面涂布 層的每一層，進行與方法步驟幻相同的步驟。另外的可選步驟可以包括在制備球形微囊之 后的洗滌步驟。通常而言，根據用于制備本發明使用的(球形)微囊的方法步驟1)來制備本文所 述的核。所述核由交聯聚合物以及已經根據本文所述方法轉染的GLP-I編碼和分泌細胞組 成。根據方法步驟1)，通常優選以對于(球形)核所述的濃度(例如IX IO5個細胞 最多 6X IO7個細胞每ml聚合物溶液)制備可溶形式的聚合物(例如可溶形式的藻酸鹽(例如 在生理鹽水溶液中的藻酸鉀或藻酸鈉))和GLP-I-肽編碼和分泌細胞的混合物(懸浮液)。作為典型技術可以將同基因(homogenic)細胞/聚合物懸浮液(例如細胞/藻 酸鹽懸浮液)加壓通過空氣噴嘴，所述空氣噴嘴由三個通道組成，所述三個通道作為圍繞 共同中心的三個同心環同心地排列內通道、中間通道和外通道(空氣環(air ring))。優 選將中空針用于內徑為50 μ m 最多2，000 μ m的內通道。中間通道通常具有的內徑為 60 μ m 4000 μ m，外通道(空氣環)優選具有的內徑為100 μ m 5，000 μ m。內通道和外通 道(空氣環)專門用于制備本發明使用的(球形)微囊的核的方法步驟1)。因此，僅由兩個 通道(內通道和外通道)組成的噴嘴也可用于方法步驟1)。通常而言，如果使用具有三個 通道的空氣噴嘴，則沒有物質流過中間通道。將細胞/聚合物溶液的懸浮液通常以10μ 1/ 分鐘 5ml/分鐘的速度加壓通過內通道，在通道的出口處產生微滴，該微滴是由于外通道 (空氣環)提供的速度通常為0. 51/分鐘 101/分鐘的氣流而被撕下的(tear off)。含 有細胞和非交聯聚合物溶液的微滴落入含有交聯劑的溶液(沉淀浴)，該溶液(沉淀浴)通 常位于空氣噴嘴的出口下方的約4cm 約60cm距離。下滴過程中微滴優選變圓，由此得到 基本上為球形的幾何形狀。交聯劑實現了聚合物的離子交聯，最初形成具有本文對(球形) 核定義的直徑的球形(水不溶性)微囊的核。(球形)微囊的核的直徑取決于方法步驟1) 中使用的所選通道的尺寸和幾何形狀。如果使用藻酸鹽作為聚合物的話，含有交聯劑的溶 液(沉淀浴)優選由二價陽離子，例如鈣離子或鋇離子(5mM IOOmM)或其它二價陽離子 或多價陽離子組成。另外，沉淀浴優選含有緩沖物質(例如ImM IOmM的組氨酸)和氯化 鈉(例如^OmOsm0I士50m0Smol)。如果使用藻酸鹽之外的其它聚合物，本文可以使用本領 域已知的其它合適的交聯劑和緩沖液。方法步驟1)提供由交聯聚合物和本文定義的細胞組成的(球形)微囊的核。方 法步驟1)之后的可選的方法步驟可以包括洗滌步驟。例如用生理鹽水溶液或任何其它合適的洗滌溶液洗滌本發明使用的(球形)微囊的核，并且如果適用的話，使核在硫酸鈉溶液 中溫育，優選在根據US 6，592，886在硫酸鈉溶液中溫育，通過參考將US 6，592，886的內容 并入本文。將本發明使用的(球形)微囊的核從沉淀浴和/或洗滌浴中分離通常使用離心 機或任何其它合適的方法進行。根據方法步驟幻，使用基本上由交聯聚合物制得的表面涂布層涂布通過方法步驟 1)制備的本發明使用的(球形)微囊的核。因此，將步驟1)制備的(球形)微囊的核加入 到含有本文所述的非交聯聚合物但不包含細胞的聚合物溶液中。優選的是，聚合物以本文 定義的濃度以其非交聯形式提供。通常而言，將含有聚合物溶液和(球形)微囊的核的該混 合物以例如15 μ 1/分鐘 aiil/分鐘、優選10 μ 1/分鐘 5ml/分鐘的速度加壓通過本文所 述的空氣噴嘴的內通道。同時，將不具有細胞的純非交聯聚合物溶液，優選包含約0. 約4% (w/v)聚合物的溶液，例如不具有細胞的藻酸鹽溶液，以通常15 μ 1/分鐘 aiil/分 鐘，優選10 μ 1/分鐘 5ml/分鐘的速度加壓通過中間通道。由此，在中間通道的末端形成 含有核和未經聚合的聚合物的表面的微滴。由于通過外通道(空氣環)提供的速度通常為 0. 51/分鐘 101/分鐘的氣流，這些微滴被撕下。(球形)微囊的核的聚合物濃度、向其中 添加(球形)微囊的核的聚合物溶液的聚合物濃度以及表面涂布液的聚合物濃度可以不同 (參見本文)。含有(球形)微囊的核的微滴(根據方法步驟2、制備)落入本文定義的含 有交聯劑的溶液(沉淀浴)中。下滴期間，所述微滴優選變圓成為近球形的幾何形狀。交 聯劑實現了方法步驟1)的聚合物類似物的離子交聯。由此，形成具有本文定義的直徑的水 不溶性(球形)微囊，優選(球形)微囊的總直徑(粒徑)為約100 μ m 約200 μ m,更優 選總直徑為約115 μ m 約185 μ m，還更優選總直徑為約130 μ m 約170 μ m，并且最優選 總直徑為約145 μ m 約155 μ m,例如為約150 μ m。通過方法步驟2)可獲得的(球形)微 囊的總直徑取決于本文使用的所選通道的大小和幾何形狀。為了制備具有超過1層表面涂 布層的本文定義的(球形)微囊，即含有本文定義的核和2層、3層、4層、5層、5 10層或 更多層表面涂布層的(球形)微囊，方法步驟幻可以按照需要的次數進行重復。規定這些 另外的表面涂布層在本文直徑范圍內。在方法步驟幻之后，可以進行本文定義的一步或多步可選的洗滌步驟。根據另一方面本發明還提供治療動物，優選哺乳動物的AMI或MI的方法。因此所 述治療方法可用于人類醫學或獸醫醫學領域。在本發明的情況下，術語哺乳動物通常包括 任何動物和人類，優選選自包括但不限于人類和(非人類)(哺乳)動物的組，包括例如豬 (pig)、山羊、牛、豬(swine)、狗、貓、驢、猴子、猿或包括小鼠、倉鼠和兔在內的嚙齒動物、乳 牛、兔、綿羊、獅子、美洲虎、豹、大鼠、豬(Pig)、水牛(buffalo)、狗、懶猴、倉鼠、豚鼠、扁角 鹿、馬、貓、小鼠、豹貓、藪貓等。所述治療通常通過以下方式進行對有需要的患者施用本文 定義的(球形)微囊，特別是通過施用編碼和分泌本文定義的GLP-I肽、本文定義的GLP-I 融合肽或者它們的片段或變體的本文定義的細胞，例如間充質干細胞或間充質基質細胞、 或可用于本發明情況的任何其它細胞(類型)，其中將這些細胞封裝在本文定義的(球形) 微囊中以防止待治療患者的免疫系統的應答。優選的是，本發明方法中使用的(球形)微 囊以及所有其成分，例如核或表面涂布層的聚合物基質的聚合物等，是如上定義的。本發明情況下的治療優選包括治療或預防缺血性心臟病或急性冠狀動脈綜合征， 以及治療或預防預期與其相關的疾病。所述疾病或狀況的非限制性實例包括AMI或MI、ST上升MI (STEMI)、心肌病(包括缺血性心肌病)、不穩定型心絞痛、充血性心力衰竭和心室功 能異常、心力衰竭、內皮功能障礙疾病、任選的高血壓或與它們相關的任何疾病或狀況。治療或預防本文定義的AMI或MI (包括治療或預防與AMI或MI相關的疾病或狀 況)的方法還包括對有需要的患者施用封裝在本文定義的(球形)微囊中的細胞或本文定 義的(球形)微囊，或者施用含有上述(球形)微囊的藥物組合物。有需要的患者通常是 例如動物，優選哺乳動物，例如人類。此處治療方法情況下的施用通常以活性劑(即封裝在 本文定義的(球形)微囊中的細胞或本文定義的(球形)微囊)的“安全且有效”的量進 行。如本文所用，“安全且有效的量”是指封裝在本文定義的(球形)微囊中的這些細胞或 本文定義的(球形)微囊的量，該量足以顯著地誘導本文提及的疾病或障礙的積極變化。 但是，同時，“安全且有效的量”足夠小從而避免嚴重的副作用，這就是說能夠在優點和風險 之間取得明智關系。這些限制的確定通常處于明智的醫學判斷的范圍內。在本發明的情況 下，表述“安全且有效的量”優選是指適于發揮GLP-I的已知有益效果的封裝在本文定義的 (球形)微囊中的細胞或本文定義的(球形)微囊的量，所述有益效果例如有其活性強烈減 少由缺血或缺氧引起的損傷和心臟組織的可能死亡，而不需要重復地施用GLP-I肽，和/或 沒有針對例如植入的表達GLP-I的同種異體細胞的不期望的免疫應答的風險。封裝在本文 定義的(球形)微囊中的細胞或本文定義的(球形)微囊的“安全且有效的量”還會根據 待治療的具體疾病以及待治療患者的年齡和身體狀況、疾病的嚴重性、治療持續時間、伴隨 治療的性質、特別是所使用的藥學上可接受載體的性質以及類似因子在施用醫生知識和經 驗內而變化。通常而言，創造性藥物組合物中含有的(球形)微囊每天分泌約0. 2 μ g本文定義 的GLP-I肽/ml (球形)微囊。因此，劑量范圍可以例如是約0. 01 μ g 20mg分泌的生物 活性GLP-I肽/天(雖然還設想Img IOOmg的更高量)，例如約0. 01 μ g IOmg/天、優 選0. 01 μ g 5mg/天，還更優選約0. 01 μ g Img/天，并且最優選約0. 01 μ g 500 μ g/天。此處治療方法的情況下的施用通常通過以下方式進行將封裝在本文定義的(球 形)微囊中的細胞或本文定義的(球形)微囊或含有上述(球形)微囊的藥物組合物提供 至待治療患者中的特定施用位置中。所述特定施用位置通常是心臟肌肉或心臟組織、心肌 或心肌組織，特別是梗死區域、周圍區域和/或梗死周圍區域(periinfarct zone)，例如所 有這些區域均通過諸如心電圖法或NOGA電機械標測(electromechanical mapping)或MRI 等本領域的常規手段檢測。施用位置還包括心臟的血管或心臟周圍的血管，例如供給心臟 肌肉或組織的微動脈、供給心肌或心肌組織的微動脈，特別是供給梗死區域、周圍區域和/ 或梗死周圍區域的微動脈等，例如心臟的LAD(LAD=左前降支(LAD)冠狀動脈)，或其它冠 狀動脈。施用位置還包括心臟肌肉或組織的表面，特別是梗死區域、周圍區域和/或梗死周 圍區域的表面，其可以通過在開胸手術之后或期間進行心外膜注射而治療，但其不限于此， 其中梗死可以通過目視區分。梗死后，組織迅速變成膠凍樣，并且失去物理完整性。還可將 封裝在本文定義的(球形)微囊中的細胞或本文定義的(球形)微囊或含有上述(球形) 微囊的藥物組合物的注射入梗死的該液化的膠凍樣區域中或進入本文定義的任何其它區 域中。如果通過將(球形)微囊施用到心臟的血管或心臟周圍的血管，例如供給心臟肌肉或組織的微動脈、供給心肌或心肌組織的微動脈，特別是供給梗死區域、周圍區域和/或 梗死周圍區域的微動脈等，例如心臟的LAD(LAD =左前降支(LAD)冠狀動脈)，或其它冠狀 動脈而進行施用，則創造性的(球形)微囊通常施用的量和時間可防止閉塞和任何栓塞效 應，例如心臟的梗死、微梗死等。這可以通過使待施用(球形)微囊的施用總量為例如約 5，000珠 約1，000, 000珠、約10，000珠 約750，000珠、約10，000珠 約500，000珠、約 10，000珠 約250，000珠、或約10，000珠 約100，000珠、例如約40，000珠 約100，000 珠、例如約40，000珠、約50，000珠、約60，000珠、約70，000珠、約80，000珠、約90，000珠或 約100，000珠、約60，000珠(例如相當于例如約三百萬 四百萬個細胞)、或約100，000 約 300，000 珠、例如約 100，000珠、約 150，000 珠、約 200，000 珠、約 250，000 珠或約 300，000 珠，或由這些值中任何兩個形成的任何范圍。施用優選以低俗或時間交錯模式發生。舉例 而言，可以向左前降支(LAD)冠狀動脈緩慢施用最多10，000，000珠而不會引起梗死。向本文定義的特定施用位置中施用封裝在本文定義的(球形)微囊中的細胞、或 本文定義的(球形)微囊、或含有所述(球形)微囊的藥物組合物可以使用不同的施用模 式進行。例如，可以全身地或局部地施用封裝在本文定義的(球形)微囊中的細胞、或本文 定義的(球形)微囊、或含有所述(球形)微囊的藥物組合物。全身施用的途徑通常包括， 例如，透皮途徑或胃腸外途徑，包括靜脈內注射、皮下注射和/或動脈內注射。局部施用的 途徑通常包括，例如，局部施用途徑以及透皮、肌肉內注射、皮下注射、心臟內注射、心肌內 注射和/或心包注射。更優選的是，可以通過皮內途徑、皮下途徑或肌肉內途徑，更優選通 過心臟內注射、心肌內注射和/或心包注射施用封裝在本文定義的(球形)微囊中的細胞、 或本文定義的(球形)微囊、或含有所述(球形)微囊的藥物組合物。可以適于治療任何以上提及的疾病或障礙的其它施用模式，包括移植編碼和分泌 GLP-1、其片段或變體或者包含GLP-I或其片段或變體的融合肽的本文定義的細胞(其中這 些細胞封裝在本文定義的(球形)微囊中)或本文定義的(球形)微囊(優選以合適的形 式配制，例如通過添加合適的藥物載體，例如以凝膠、膠囊、片劑等的形式)。可以通過介入 性手段，例如使用導管導引到受影響區域，并且通過注入心肌組織而植入所述珠，從而將封 裝在本文定義的(球形)微囊中的細胞而直接遞送到心臟的受影響位置(本文定義的施用 位置)。可以在AMI后的常規血管成形術期間進行植入。植入還可以通過直接注入心臟組 織，或通過血管內遞送通過供給受影響心臟組織的微動脈而進行，并進入AMI或AMI后哺乳 動物患者的心肌的受影響區域。不受以下限制，可以例如通過應用合適的注射針(例如尺寸為12G ^G，更優選 為18G 22G的注射針)或者例如通過移植本文定義的細胞或(球形)微囊(優選以合 適的形式配制)，使用外科手術裝置(例如手術刀、本文定義的注射針等)施用編碼和分泌 GLP-1、其片段或變體或者包含GLP-I或其片段或變體的融合肽的本文定義的細胞(其中將 這些細胞封裝在本文定義的(球形)微囊中)，或本文定義的(球形)微囊。根據一個不應 視為限制本發明的具體實例，罹患AMI或MI或者與它們相關的任何疾病或本文所述的任何 疾病的有需要的患者，可以接受將本文定義的細胞或(球形)微囊的肌肉內注射或植入本 文定義的施用位置等。施用其核中包埋有編碼和分泌GLP-I的細胞的本文定義的(球形)微囊、或所述 細胞或包含這些(球形)微囊的藥物組合物來治療或預防本文定義的AMI或MI疾病和障礙，優選產生GLP-I的有益效果，例如其活性(強烈)減少由缺血或缺氧引起的損傷和心臟 組織的可能死亡。所述有益效果包括使患有AMI和嚴重心臟收縮障礙的患者在成功地進行 直接血管成形術后改善局部和綜合LV功能。編碼和分泌GLP-I的(球形)微囊的原位心 臟保護作用特別歸因于胰高血糖素樣肽-I(GLP-I)融合蛋白的局部分泌和連續遞送至損 傷位置的其它旁分泌因子。根據本發明人所知，但不受其束縛，編碼和分泌GLP-I的(球形)微囊的原位心臟 保護作用至少部分基于以下事實本發明成功地利用具有發揮直接心臟保護作用的潛力的 GLP-I的性質。在這點上并且除了其腸降血糖素作用之外，GLP-I顯示減少胰腺β-細胞凋 亡。GLP-I受體在心臟中的定位證明GLP-I促進β -細胞中ΡΙ3Κ(—種激酶，與在缺血再 灌注損傷以及預處理情況下的心肌保護明顯相關)的活性，并由此允許人們假設GLP-I在 缺血/再灌注情況下的新型的獨立作用。GLP-I另外誘導心肌細胞中cAMP水平的增加，該 cAMP水平增加接著激活蛋白激酶A。GLP-I由cAMP和PII介導而對胰島素-分泌細胞具 有抗凋亡作用。PII的激活通過引起促凋亡肽BAD與14-3-3蛋白質結合而導致促凋亡肽 BAD的磷酸化和失活。BAD是Bcl-2家族的促凋亡成員，可以取代Bax與Bcl_2和Bcl_xl 結合，引起細胞死亡。蛋白質印跡使得研究者確認BAD通過GLP-I在絲氨酸136處磷酸化。 因此，作為令人驚奇的結果，似乎GLP-I在所用模型中對心臟肌肉具有直接的抗凋亡作用。 另外，認為cAMP的水平上升在缺血的心肌細胞中是有害的。但是，產生的cAMP的量可以 在確定引起抗凋亡途徑的分叉性信號傳導途徑(divergent signalling pathway)中起作 用。產生的cAMP還可以位于描述為區室化的特定微域中，該微域限制其作用。GLP-I-介導 的cAMP的增加(與異丙基腎上腺素相比)不能引起任何變力性(inotropic)或松弛性效 果，支持所述區室化的看法。G蛋白-偶聯信號傳導的區室化已經是許多報道的主題，并且 越發意識到蛋白激酶A活性的時空調控包括離散cAMP庫的調控。還顯示GLP-I增加大鼠 的血壓和心率，雖然現有技術不能證明任何血液動力學變化。這可能是由于劑量、遞送方法 或物種的差異。GLP-I顯示對血壓和脈搏的集中控制具有作用。另外，之前重組GLP-I已 經在豬心肌缺血模型中顯示防止丙酮酸鹽和乳酸鹽的累積，但不顯示梗死的任何減少。但 是，本發明的發明人能夠令人驚奇地證明本文所示的GLP-I或者GLP-I的融合肽對心肌的 保護。總之，本發明的發明人已經首次令人驚奇地發現GLP-I在豬心臟中的心臟保護作用， 以及該可能用于GLP-I激動劑(一類目前正在進行治療2型糖尿病的試驗的藥物)的治療 潛力的新觀點，其中施用本文定義的(球形)微囊不顯示免疫反應。本發明還包括編碼和分泌GLP-1、其片段或變體或者包含GLP-I或其片段或變體 的融合肽的本文定義的細胞(其中所述細胞封裝在本文定義的(球形)微囊中)在制備用 于治療動物，優選諸如人類等哺乳動物的AMI或MI的產品中的應用，所述產品例如為藥物 組合物或試劑盒。用于所述治療的細胞可以是編碼和分泌GLP-1、其片段或變體或者包含 GLP-I或其片段或變體的融合肽的本文定義的細胞，例如間充質干細胞或間充質基質細胞， 或可用于本發明情況下的任何另外的細胞，其中將這些細胞封裝在(球形)微囊中以防止 待治療的患者的免疫系統的應答。本發明的另一方面是藥物組合物，所述藥物組合物含有編碼和分泌GLP-1、其片段 或變體或者包含GLP-I或其片段或變體的融合肽的本文定義的細胞(其中將這些細胞封裝 在本文定義的(球形)微囊中)或者含有本文定義的(球形)微囊。可以以本文定義的模式將所述藥物組合物應用到罹患本文疾病的患者，優選應用到本文定義的施用位置。含有編碼和分泌GLP-1、其片段或變體或者包含GLP-I或其片段或變體的融合肽 的本文定義的細胞(其中將這些細胞封裝在本文定義的(球形)微囊中)或者含有本文定 義的(球形)微囊作為“活性成分”的藥物組合物的制備，通常是本領域中充分理解的，如 美國專利第 4，608，251 ；4，601，903 ；4，599，231 ；4，599，230 ；4，596，792 ；和 4，578，770 號所 例舉，通過參考將上述全部專利并入本文。通常而言，將藥物組合物制備成可注射的液體溶液或懸浮液，該液體溶液或懸浮 液優選含有水(水性制劑)，或者可以將其乳化。將術語“水性制劑”定義為包含至少50重 量％水的制劑。類似地，將術語“水性溶液”定義為包含至少50重量％水的溶液，將術語“水 性懸浮液”定義為保護至少50重量％水的懸浮液。對于在本文定義的痛苦位置處的肌肉內注射、靜脈內注射、皮膚注射或皮下注射 或任何另外的注射，本文定義的細胞或(球形)微囊可以是胃腸外可接受的水性溶液的形 式，該水性溶液不含熱原并且具有合適的PH、等滲性和穩定性。液體藥物組合物通常包括諸 如水等液體載劑。優選的是，液體載劑包括生理鹽水溶液，也可以包括右旋糖乙醇或其它糖 溶液/或者二醇，如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇以及它們的組合。另外的實例包括其它等滲 載劑，例如生理鹽溶液，如林格氏溶液或乳酸鹽林格氏溶液。如果創造性的藥物組合物包含本文定義的細胞或(球形)微囊和例如緩沖液的水 性溶液，所述(球形)微囊通常以0. lmg/ml的濃度存在于藥物組合物中，或者本文中，所述 藥物組合物的PH通常為約2. 0 約10. 0，優選為約7. 0 約8. 5。創造性藥物組合物中可以存在于其它成分，這是可行的。所述另外的成分可以包 括潤濕劑、乳化劑、抗氧化劑、膨脹劑、PH緩沖劑(例如磷酸鹽或檸檬酸鹽或馬來酸鹽緩沖 劑)、防腐劑、表面活性劑、穩定劑、張力調節劑、螯合劑、金屬離子、油質載劑、蛋白質(例如 人血清白蛋白、明膠或蛋白質)和/或兩性離子(例如諸如甜菜堿、牛磺酸、精氨酸、甘氨 酸、賴氨酸和組氨酸等氨基酸)。所述成分可由本領域技術人員根據本發明使用的包埋在 (球形)微囊的核中的細胞的具體要求來選擇，即所述成分沒有細胞毒性并且確保所述細 胞的生活力。另外，所述成分可以使已經由本發明使用的包埋在(球形)微囊的核中的細 胞編碼和分泌的GLP-I肽穩定化。關于緩沖液，其優選選自由以下物質組成的組中乙酸鈉、碳酸鈉、檸檬酸鹽、雙甘 氨肽、組氨酸、甘氨酸、賴氨酸、精氨酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、磷酸鈉和三(羥甲基)_氨 基甲烷、羥乙基哌嗪乙磺酸(h印es)、N_ 二(羥乙基)甘氨酸(bicine)、三(羥甲基)甲基 甘氨酸(tricine)、蘋果酸、琥珀酸鹽、馬來酸、富馬酸、酒石酸、天冬氨酸或它們的混合物。 這些特定緩沖劑中的每一種組成本發明的替代性實施方式。在含有本文定義的細胞和/或本發明使用的(球形)微囊的藥物組合物中使用所 有上述添加劑，特別是關于上述添加劑的濃度范圍是本領域技術人員眾所周知的。方便起 見，請參考 Remington :The Science and Practice of Pharmacy,第 19 版，1995。優選以本文定義的方式施用含有編碼和分泌本文定義的GLP-I的細胞和/或本文 定義的(球形)微囊的創造性藥物組合物以用于通常的治療。所述施用優選與劑型相容，并 且優選包含安全且有效量的本文定義的活性成分，即視為安全但是治療上有效的所述量。 與創造性藥物組合物一起施用(或，如果需要，單獨施用)的編碼和分泌本文定義的GLP-I的細胞和/或本文定義的(球形)微囊的量，取決于要治療的受試對象和疾病，包括，例如 患者疾病的嚴重性。合適的劑量范圍依賴于預定時間中由(創造性藥物組合物中含有的) (球形)微囊分泌的生物活性GLP-I肽的量，并且該劑量范圍如本文定義，通常為1 數百 微克(GLP-I)/天的級別。如果不是另外指出，本發明還可以包括本文所述實施方式和特征的組合，并且本 發明不旨在限于這些特別定義的單獨實施方式。通過以下附圖進一步說明本發明。但是，不旨在使本發明的范圍限于以下所示的 圖的內容。
圖1 顯示了示例性構建體a m的非限制性概觀(還參見實施例1)，其還包含于 用于制備本發明使用的(球形)微囊的細胞中。圖2 描述了瞬時轉染后在hTERT-MSC和HEK293細胞中不同GLP-I構建體和活性 GLP-I的瞬時表達的結果(還參見實施例2)。在單聚GLP-I構建體#103和#317 (僅具有 一個拷貝的GLP-I (7-37))中僅能夠觀察到少量的活性GLP-I水平。在hTERT-MSC細胞中 和在HEK293細胞中都觀察到二聚GLP-I構建體#217(具有作為成分(I)和作為成分(III) 的GLP-I (7-37))的表達的巨大增加。圖3 顯示來自GLP-I分泌細胞的細胞培養物上清液的蛋白質印跡分析(還參 見實施例3)。泳道1 溶解于模擬(mock)轉染的hTERT-MSC細胞的上清液中的IOOng合 成GLP-I (7-37)；泳道2 分泌來自構建體#217的二聚GLP-1的hTERT-MSC細胞(克隆 79TM217/13)的上清液；泳道3 分泌來自構建體#217的二聚GLP-I的AtT20細胞(克隆 81-A-217/3)的上清液；泳道M 預染色的蛋白標記[kDa])。結果表明，含有GLP-I (7_37) 和C末端附屬物(appendix)(圖3中的2和3)的本文定義的肽由經轉染的細胞系分泌并 且可以使用與GLP-I (7-37)的中間分子表位結合的抗-GLP-I抗體進行檢測。圖4 描述了使用本發明所用的GLP-I肽進行的血漿穩定性測試(體外)。因此， 使用構建體(l)#103GLP-l(7-37)、(2)#317GLP-l(7-37)-IP2-延長有 11 個氨基酸和(3) #2 17GLP-1 (7-37)-IP2-GLP-l (7-37)瞬時轉染HEK293細胞。HEK293細胞對于基因構建是有 效的宿主(還參見實施例4)。圖5 描述了使用分泌由構建體#217GLP-l(7-37)-IP2-GLP-l (7-37)產生的GLP-1 肽CMl的經穩定轉染hTERT-MSC細胞克隆79TM217/18K5的上清液和作為對照的合成 GLP-I (7-37)進行的血漿穩定性動力學(體外)。結果獲自三個獨立的實驗。使用GLP-I(活 性)ELISA (Linco)測定活性 GLP-I。圖6 顯示以下所示肽的蛋白質印跡。給出以下值SEQ ID NO=I(IDlsyn)對應于 GLP-I (7-37)，31 個氨基酸，3. 3kD ；SEQ ID NO 8 (ID8syn, CM3)對應于 GLP-I (7-37) -IP2，46 個氨基酸，5. IkD ；SEQ ID NO 7 (ID7rec, CM2)對應于 GLP-1 (7-37)-IP2-RR-GLP2，83 個氨基 酸，9. 4kD ；SEQ ID NO 6 (ID6syn, CMl)對應于 GLP-I (7-37) -IP2-RR-GLP1 (7-37)，79 個氨基 酸，8. 7kD(還參見實施例5)。圖7 說明在生物測定細胞系111CH0349/18中GLP-I受體介導的cAMP增加的 劑量響應曲線。使用分泌由構建體#217GLP-1 (7-37)-IP2-GLP-1 (7-37)產生的CMl的79TM217/18K5細胞的連續稀釋條件培養基進行刺激。在親代hMSC_TERT細胞系中未發現 可檢測的cAMP響應。該圖從5個獨立實驗制得。確定在cAMP生物測定中產生半最大效應 (ED50)的肽劑量為353pM(還參見實施例6)。圖8 描述了用于瞬時和穩定基因表達的示例性載體。該載體由兩個分開的轉錄 單元組成，一個轉錄單元用于目的基因(GOI)，一個轉錄單元用于自殺基因HSV胸腺嘧啶核 苷激酶和抗性基因殺稻瘟菌素(blasticidin)的融合。對于第一轉錄單元，使用人類泛素 B啟動子，并且對于第二轉錄單元，使用人類鐵蛋白啟動子(還參見實施例9)。圖9 說明了在事先使本文定義的(球形)微囊所用的細胞永生化之后對所述細 胞進行的表征。從圖9A可以看出，永生化細胞與作為未永生化的其對應物相比，仍然能夠 分化成脂肪細胞、骨細胞和軟骨細胞(左，右)。例如使用為此處使用的原代細胞的特征的 ⑶44和⑶166表位標記物，通過流式細胞術所示，永生化細胞具有成纖維細胞形態以及比 短命MSC (mortal MSC)更均勻的尺寸和粒度。永生化細胞表達與其未永生化對應物相同的 CD標記物(參見圖9B)。圖10 顯示C末端延長的GLP-I類似物CMl的抗凋亡功效。通過添加終濃度分別 為10 μ g/ml和100 μ g/ml的蛋白生物合成抑制劑環己酰亞胺(cycloheximide, CHX)，在 RIN-5F細胞中誘導凋亡。不同濃度的重組大腸桿菌產生的二聚GLP-I融合蛋白CMl的存在 引起細胞生活力的顯著(P < 0. 01)增加，在溫育M小時后對細胞生活力定量。圖11 是使用在治療AMI和MI中所用的編碼和分泌GLP-I的(球形)微囊的創 造性概念的示意圖。將諸如間充質干細胞、間充質基質細胞或同種異體細胞等細胞封裝在 較薄的選擇性滲透的藻酸鹽基質中，形成編碼和分泌GLP-I的(球形)微囊。藻酸鹽基質 對于供應封裝細胞的氧和營養物以及由所述細胞編碼和分泌的GLP-I或GLP-I融合蛋白是 可滲透的。另一方面，如此處所述，細胞和免疫系統的成分不能通過該屏障。左使用編碼 和分泌GLP-I的(球形)微囊的創造性概念的示意圖。純藻酸鹽的層(灰色)圍繞含有核 珠(奶油色)的細胞。右體外編碼和分泌GLP-I的(球形)微囊。圖12顯示其中使用藻酸鹽珠(A)或創造性(球形)微囊(細胞珠(CellBeads)) (B)治療的冠狀動脈已經栓塞(黑色虛線)的心臟的宏觀病理學。(A)上白色勾勒出的區 片表示在心臟表面上可見的梗死區域，而在(B)中見到非常小的梗死區域。圖13 顯示在使用藻酸鹽對照以及創造性(球形)微囊(細胞珠)治療的栓塞心 臟表面上的LV梗死區域的％。圖14:顯示栓塞前、栓塞后立即和栓塞后4周的％射血分數，證明了創造性(球 形)微囊(細胞珠)組帶來的恢復。圖15 顯示在可以鑒定動脈內珠遞送后，在梗死區(IZ)區域、邊界區(BZ)區域和 遠端區的受控梗死之后，豬心臟的中段LAD (LAD=左前降支(LAD)冠狀動脈)的組織切片 (從左到右)。圖16 顯示動脈內珠遞送后4周在梗死組織和遠端組織中GLP-I受體的蛋白質印 跡分析(左總體右分別是梗死區和遠端區)。實驗確定了在健康豬模型中使用GLP-I的 有說服力的基本原理。使用蛋白質印跡方法對梗死后4周的心臟樣品進行的分析確定，豬 心臟內的細胞擁有GLP-I受體。圖16顯示，該受體確實存在(使用GAPDH作為加載對照) 并且在編碼和分泌GLP-I的創造性(球形)微囊(細胞珠)或藻酸鹽對照之間在梗死區中或在遠端區中沒有顯著差異。圖17 顯示假性血友病因子(von Willibrand Factor)的免疫化學組織切片，顯 示編碼和分泌GLP-I的創造性(球形)微囊(細胞珠)對心臟中血管發生的作用。為此目 的利用假性血友病因子抗體染色程序對來自梗死邊界區和遠端區的心臟切片進行染色。圖18:顯示當使用圖17的假性血友病因子抗體染色程序染色時，動脈內遞 送4周后編碼和分泌GLP-I的創造性(球形)微囊(細胞珠)的血管發生作用的結果 (A)總體和⑶按照區域。血管密度的分析表明，與對照-總體(圖18(A))和按照區 域(圖18(B))相比，使用GLP-I細胞珠遞送的心臟也含有顯著更多的血管。在LV區內 可以看到該模式(左心室尖(apex-LV) :39. 25士7. 5vs 6. 8士2. 2 ;P = 0. 002和中段LV 34. 5士3. 8vsl4. 6士6. 2 ;P = 0. 04)。關于血管尺寸，在對照和GLP-I細胞珠組中測定直徑 為4μπι IOym血管都是最豐富的。圖19 顯示證明在豬心肌中的炎性細胞浸潤的組織切片，以及在來自動脈內珠遞 送4周后的組織切片的炎性細胞浸潤的染色。結果示于圖20中。圖20 顯示證明在豬心肌中的炎性細胞浸潤的圖19的組織切片的結果。在來自動 脈內珠遞送4周后的組織切片的炎性細胞浸潤的染色顯示，與對照相比，編碼和分泌GLP-I 的創造性(球形)微囊(細胞珠)的炎性細胞的量統計學上更多(圖20 (A)&(B))。這表明 這些諸如已知可由hMSC細胞產生的單核細胞趨化因子等因子釋放的旁分泌效應，負責將 這些重要的細胞(單核細胞和嗜中性粒細胞)募集到梗死區域。圖21 描述了動脈內珠遞送4周后豬心肌的TUNEL染色。結果示于圖22中。圖22 顯示圖21的動脈內珠遞送4周后豬心肌的TUNEL染色結果。通過動脈內 珠遞送4周后的組織切片的TUNEL染色評價凋亡顯示，與對照相比，編碼和分泌GLP-I的創 造性(球形)微囊(細胞珠)的凋亡細胞(TUNEL+)統計學上更少(圖22 (A) & (B))。圖23 描述了 160 μ m的編碼和分泌GLP-I的創造性(球形)微囊(細胞珠)的 明視野圖像(A)和生活力染色(B)的示例性顯微照片，表明了這些創造性(球形)微囊的 示例性內徑和總直徑。在以下實施例中進一步說明本發明。但是，本發明的范圍不限于以下所示實施例 的內容。
實施例實施例1遺傳構建體的制備 以合成方式合成GLP-I (7-37) cDNA的編碼序列，如圖Ia中所示，其依次包括 HincII和EcoRl位點。單獨地合成圖Ib中所示的cDNA，如圖Ib中所示，其包括GLP-I (7-37) 的編碼序列、IP2以及用于SfoI, EcoRI和XbaI的限制性位點。為了將GLP-I導向分泌途 徑，使用異源性的基質溶素3的信號序列(Acc號NM_005940)。因此，從人類RNA進行逆轉 錄酶PCR擴增編碼基質溶素信號和前導序列的cDNA，并且將其與圖Ia或圖Ib的構建體一 起使用，以分別形成圖Ic和圖Id中所示的構建體。 將圖Ia構建體的HincII/EcoRI片段克隆到圖Id序列的SfoI位點中，以形成構 建體圖le。類似地，將圖Id的EcoRI片段克隆到真核表達質粒的EcoRI位點中，以制備圖If中所示的構建體。為了形成圖Ig中所示的構建體，將圖Ib中所示的構建體的HincII/ XbaI片段重復地克隆到圖Id中所示的構建體的SfoIAbaI位點中。圖Ih顯示編碼基質溶 素前導和信號序列的合成的、密碼子經優化的序列，其被縮短的內源性內含子序列隔斷，與 編碼人類GLP-I (7-37)、IP2和GLP-2 (1-35)的序列融合。構建體圖Ih的DNA序列是SEQ ID N0:16，而SEQ ID NO 15也顯示所翻譯肽的序列。同樣合成的是圖Ii和Ij中的序列。通過將圖Ij的Nael/BssHII片段克隆到圖 Ih的Nael/BssHII線性化序列中，將其用于形成圖Ik中的構建體。構建體圖Ik的DNA序 列是SEQ ID N0:14，而SEQ ID NO 13也顯示所翻譯肽的序列。圖11的構建體通過圖Ih 序列的BssHII消化和再連接而形成。構建體圖11的DNA序列是SEQ ID NO :18，而SEQ ID NO 17也顯示所翻譯肽的序列。圖Im的構建體通過將圖Ii的序列的Afel/BssHII片段克 隆到圖Ih的Afel/BssHII線性化序列中而形成。構建體圖Im的DNA序列是SEQ ID NO 20，而SEQ ID NO 19也顯示所翻譯肽的序列。此處構建體可由本領域技術人員使用常規技術制備。實施例2哺乳動物細胞的轉染、克隆選擇和GLP-I表達細胞的來源HEK293 (人類胚胎腎細胞系，#ACC 305，DSMZ Cell Culture Collection，德國)，AtT20(小鼠 LAFl 垂體瘤細胞系，#87021902, European Cell Culture Collection, UK)，hTERT-MSC細胞由丹麥歐登塞大學醫院的Kassem教授制得和提供。為了轉染IO6個細胞，使用0. 5 μ g 2 μ g的具有不同GLP-1構建體的質粒DNA。 如實施例 1 中所述生產構建體。如 Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel 等 1994ff Harvard Medical School Vol2.，Unit 9. 1)所述，使用標準磷酸鈣共沉淀法轉染 HEK293 細胞。如 Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel 等· 1994ff，Harvard Medical School Vol 2. , Unit 9.4)所述，使用 FuGene (Roche)轉染 AtT20 細胞。使用核 轉染技術(Amaxa)進行hTERT-MSC細胞的轉染，所述核轉染技術是基于電參數和細胞-類 型特異性溶液的組合的非病毒方法。使用核轉染裝置(程序C17)和核轉染溶液VPE-1001， 獲得>60%的轉染效率。轉染后48小時，通過向培養基中添加選擇劑殺稻瘟菌素Qyg/ ml)，進行對具有將DNA穩定整合到染色體中的細胞克隆的選擇。12 15天后，可以分離穩 定轉染的細胞克隆并進行擴增以用于表征。在hTERT-MSC細胞和HEK293細胞中測定不同GLP-I構建體的瞬時表達。在單 聚GLP-I構建體#103和#317 (僅具有一個拷貝的GLP-I (7-37)中僅能觀察到少量的活性 GLP-I水平，而在hTERT-MSC細胞中和在HEK293細胞中都觀察到二聚GLP-I構建體#217(具 有作為成分⑴和作為成分(III)的GLP-I (7-37))的表達的巨大增加。結果總結于圖2。 GLP-I構建體#159(具有作為成分(II)的4個IP2拷貝)的延長未導致進一步的增加(未 示出)。用不同構建體轉染hTERT-MSC細胞后，選擇穩定表達GLP-I的克隆。表達水平示于 表1。表 權利要求
1.編碼和分泌GLP-1、其片段或變體或者包含GLP-I或其片段或變體的融合肽的細 胞在制備用于治療急性心肌梗死(AMI或MI)的藥物中的應用，其中，將所述編碼和分泌 GLP-1、其片段或變體或者包含GLP-I或其片段或變體的融合肽的細胞封裝在球形微囊中 以防止所治療患者的免疫系統的應答。
2.如權利要求1所述的應用，其中所述球形微囊優選包含球形核和至少一個表面涂布層，其中，所述球形核包含交聯聚合物和編碼和分泌GLP-1、其片段或變體或者包含GLP-I 或其片段或變體的融合肽的細胞的混合物，或由交聯聚合物和編碼和分泌GLP-1、其片段或 變體或者包含GLP-I或其片段或變體的融合肽的細胞的混合物組成；和其中所述至少一個表面涂布層包含交聯聚合物或由交聯聚合物組成。
3.如權利要求1或2所述的應用，其中，所述球形微囊的總直徑為約120μ m 約 800 μ m、約120 μ m 約700 μ m、約150 μ m 約650 μ m或約165 μ m 約600 μ m,或者甚至 約120 μ m 約300 μ m、約150 μ m 約250 μ m、約165 μ m 約225 μ m或約180 μ m 約 200 μ m,包括約 180 μ m、185 μ m、190 μ m 或 200 μ m。
4.如權利要求1 3中任一項所述的應用，其中，所述細胞為編碼和分泌GLP-I、其片 段或變體或者包含GLP-I或其片段或變體的融合肽的間充質干細胞、間充質基質細胞、人 類間充質干細胞、源自人類間充質干細胞的分化細胞、同種異體細胞或自體細胞。
5.如權利要求2 4中任一項所述的應用，其中，所述交聯聚合物選自包含生物聚合物 和藻酸鹽的組。
6.如權利要求2 5中任一項所述的應用，其中，所述核和/或所述至少一個表面涂布 層的交聯聚合物包含濃度相同或不同的化學上相同的聚合物，其中所述聚合物還可以具有 不同的分子量和/或可以不同地進行交聯。
7.如權利要求1 6中任一項所述的應用，其中，所述球形微囊包括1層、2層、3層、4 層、5層、5 10層或更多層表面涂布層。
8.如權利要求1 7中任一項所述的應用，其中，所述球形微囊包括由聚陽離子組成的 另外的外部表面涂布層。
9.如權利要求1 8中任一項所述的應用，其中，所述GLP-I是選自由以下肽組成的組 中的肽a)包含GLP-I的第7-35位氨基酸的肽；或者b)包含GLP-I的第7-36位氨基酸的肽或GLP-1(7-36)酰胺；或者c)包含GLP-I的第7-37位氨基酸的肽；或者d)包含以下式II的序列的肽:Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaal6-Ser-Xaal8-Xaal9-Xaa20-Glu-Xa a22-Xaa23-Ala-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa3 6_Xaa37,其中 Xaa7 是 L-組氨酸；Xaa8 是 Ala、Gly、Val、Leu、lie 或 Lys ；Xaal6 是 Val 或 Leu ； Xaa 18 是 Ser > Lys 或 Arg ；Xaal9 是 Tyr 或 Gln ；Xaa20 是 Leu 或 Met ；Xaa22 是 Gly 或 Glu ； Xaa23 是 Gin,Glu,Lys 或 Arg ；Xaa25 是 Ala 或 Val ；Xaa26 是 Lys,Glu 或 Arg ；Xaa27 是 Glu 或 Leu ；Xaa30 是 Ala、Glu 或 Arg ；Xaa33 是 Val 或 Lys ；Xaa34 是 Lys、Glu、Asn 或 Arg ；Xaa35是 Gly ；Xaa36 是 Arg、Gly 或 Lys 或酰胺或不存在；Xaa37 是 Gly、Ala、Glu、Pro、Lys、酰胺 或不存在；或者e)何含以下式III的序列的肽Xaa7~Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Xaal8-Tyr-Leu-Glu-Xaa22-Xaa 23-Ala-Ala-Xaa26-Glu-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Val-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37,其中 Xaa7 是 L-組氨酸；Xaa8 是 Ala、Gly、Val, Leu、Ile 或 Lys ；Xaal8 是 Ser、Lys 或 Arg ；Xaa22 是 Gly 或 Glu ；Xaa23 是 Gin、Glu、Lys 或 Arg ；Xaa26 是 Lys、Glu 或 Arg ；Xaa30 是 Ala、Glu 或 Arg ；Xaa34 是 Lys、Glu 或 Arg ；Xaa35 是 Gly ；Xaa36 是 Arg 或 Lys、酰胺或不 存在；Xaa37是Gly、Ala、Glu或Lys、酰胺或不存在；或者f)與此處a) e)中的任何肽顯示有至少80%同一性的肽。
10.如權利要求1 8中任一項所述的應用，其中，所述GLP-I融合肽或其片段或變體 包含成分(I)和成分(II)，其中N末端的成分(I)選自由以下序列組成的組或者包含以下序列的組a)GLP-I (7-35，7-36 或 7-37)序列，或b)序列SEQ ID NO :1 ；或c)包含以下式II的序列的肽或由以下式II的序列組成的肽Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaal6-Ser-Xaal8-Xaal9-Xaa20-Glu-Xa a22-Xaa23-Ala-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa3 6_Xaa37,其中 Xaa7 是 L-組氨酸；Xaa8 是 Ala、Gly、Val、Leu、lie 或 Lys ；Xaal6 是 Val 或 Leu ； Xaa 18 是 Ser 、 Lys 或 Arg ；Xaal9 是 Tyr 或 Gln ；Xaa20 是 Leu 或 Met ；Xaa22 是 Gly 或 Glu ； Xaa23 是 Gin,Glu,Lys 或 Arg ；Xaa25 是 Ala 或 Val ；Xaa26 是 Lys,Glu 或 Arg ；Xaa27 是 Glu 或 Leu ；Xaa30 是 Ala、Glu 或 Arg ；Xaa33 是 Val 或 Lys ；Xaa34 是 Lys、Glu、Asn 或 Arg ；Xaa35 是 Gly ；Xaa36 是 Arg、Gly 或 Lys 或酰胺或不存在；Xaa37 是 Gly、Ala、Glu、Pro、Lys、酰胺 或不存在；或d)包含以下式III的序列的肽或由以下式III的序列組成的肽Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Xaal8-Tyr-Leu-Glu-Xaa22-Xaa23-Ala-Ala-Xaa26-Glu-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Val-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37,其中 Xaa7 是 L-組氨酸；Xaa8 是 Ala、Gly、Val、Leu、lie 或 Lys ；Xaal8 是 Ser、Lys 或 Arg ；Xaa22 是 Gly 或 Glu ；Xaa23 是 Gin、Glu、Lys 或 Arg ；Xaa26 是 Lys、Glu 或 Arg ；Xaa30 是 Ala,Glu 或 Arg ；Xaa34 是 Lys,Glu 或 Arg ；Xaa35 是 Gly ；Xaa36 是 Arg 或 Lys、酰胺或不 存在；Xaa37是Gly、Ala、Glu或Lys、酰胺或不存在；或者e)與a) d)中任何序列的序列具有至少80%序列同一性的序列；并且成分(II)的成分(II)C末端選自至少9個氨基酸的肽序列或其功能片段或變體。
11.如權利要求10所述的應用，其中，所述的GLP-I融合肽的成分(II)選自a)含有序列 SEQ ID NO 22 (RRDFPEEVAI), SEQ ID NO :27 (DFPEEVAI)、SEQ ID NO: 28 (RDFPEEVA)或 SEQ ID NO :29 (RRDFPEEV)、SEQ ID NO :30 (AADFPEEVAI)、SEQ ID NO: 31(ADFPEEVA)或 SEQ ID NO :32 (AADFPEEV)、或者與 SEQ ID NO :22、27、28、29、30、31 或 32 具有至少80%序列同一性的序列的肽序列；或b)含有序列SEQ ID NO :23(RRDFPEEVAIVEEL)或 SEQ ID NO :24 (RRDFPEEVAIAEEL)、或 SEQ ID NO 33 (AADFPEEVAIVEEL)或 SEQ ID NO :34 (AADFPEEVAIAEEL)、或者與 SEQ ID NO: 23、24、33或34具有至少80%序列同一性的序列的肽序列；或c)含有序歹IjSEQ ID NO 2 (RRDFPEEVAIVEELG)、SEQ ID NO 3 (RRDFPEEVAIAEELG)、SEQ ID NO :35(AADFPEEVAIVEELG)或 SEQ ID NO :36 (AADFPEEVAIAEELG)、或者與 SEQ ID NO :2、 3、35或36具有至少80%序列同一性的序列的肽序列。
12.如權利要求10或11所述的應用，其中，所述GLP-I融合肽的成分⑴和成分(II) 直接相連或經由連接物序列相連。
13.如權利要求10 12中任一項所述的應用，其中，所述GLP-I融合肽替代性地包含 成分(III)，或者除包含成分(I)和成分(II)之外還包含成分(III)，其中如果所述融合蛋 白中存在成分⑴和成分(III)，則成分(III)可以與成分⑴的C末端和/或成分⑴的 N末端相連；或者其中如果所述融合蛋白中存在成分(I)、成分(II)和成分(III)，則成分 (III)可以與成分(II)的C末端和/或成分(I)的N末端相連。
14.如權利要求13所述的應用，其中，成分(III)包含至少4個氨基酸殘基、至少10個 另外的氨基酸殘基、至少20個另外的氨基酸殘基或至少30個另外的氨基酸殘基；并且成分 (III)優選選自a)胰高血糖素原中GLP-2的N末端序列，或b)GLP-I (5-37、6-37 或 7-37)序列，或c)包含以下式II的序列的肽Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaal6-Ser-Xaal8-Xaal9-Xaa20-Glu-Xa a22-Xaa23-Ala-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa3 6_Xaa37,其中 Xaa7 是 L-組氨酸；Xaa8 是 Ala、Gly、Val、Leu、lie 或 Lys ；Xaal6 是 Val 或 Leu ； Xaa 18 是 Ser> Lys 或 Arg ；Xaal9 是 Tyr 或 Gln ；Xaa20 是 Leu 或 Met ；Xaa22 是 Gly 或 Glu ； Xaa23 是 Gin,Glu,Lys 或 Arg ；Xaa25 是 Ala 或 Val ；Xaa26 是 Lys,Glu 或 Arg ；Xaa27 是 Glu 或 Leu ；Xaa30 是 Ala、Glu 或 Arg ；Xaa33 是 Val 或 Lys ；Xaa34 是 Lys、Glu、Asn 或 Arg ；Xaa35 是 Gly ；Xaa36 是 Arg、Gly 或 Lys 或酰胺或不存在；Xaa37 是 Gly、Ala、Glu、Pro、Lys、酰胺 或不存在；或d)包含以下式III的序列的肽Xaa7~Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Xaal8-Tyr-Leu-Glu-Xaa22-Xaa 23-Ala-Ala-Xaa26-Glu-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Val-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37,其中 Xaa7 是 L-組氨酸；Xaa8 是 Ala、Gly、Val、Leu、lie 或 Lys ；Xaal8 是 Ser、Lys 或 Arg ；Xaa22 是 Gly 或 Glu ；Xaa23 是 Gin、Glu、Lys 或 Arg ；Xaa26 是 Lys、Glu 或 Arg ；Xaa30 是 Ala、Glu 或 Arg ；Xaa34 是 Lys、Glu 或 Arg ；Xaa35 是 Gly ；Xaa36 是 Arg 或 Lys、酰胺或不 存在；Xaa37是Gly、Ala、Glu或Lys、酰胺或不存在；或者e)與a) d)中任何序列的序列具有至少80%序列同一性的序列；或f)其中成分(III)含有序列SEQID NO :4或5或者與SEQ ID NO :4或5具有至少80% 序列同一性的序列。
15.如權利要求10 14中任一項所述的應用，其中，所述GLP-I融合肽另外地含有或包含作為成分(IV)的載體蛋白，特別是轉鐵蛋白或白蛋白。
16.如權利要求1 15中任一項所述的應用，其中，所述GLP-I融合肽包含選自以下 序列的肽序列或由選自以下序列的肽序列組成SEQ ID NO 6,SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8、 SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO :26, SEQ ID NO :37、SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO :39、SEQ ID NO :40、SEQ ID NO :41、SEQ ID NO :42、SEQ ID NO :43、SEQ ID NO :44, SEQ ID NO :45、SEQ ID NO :46、SEQ ID NO :47 或 SEQ ID N0:48，或者與 SEQ ID NO: 6、7、8、10、11、12、26或37 48具有至少80%序列同一性的序列。
17.如權利要求1 16中任一項所述的應用，其中，所述球形微囊的核中的細胞經工 程化從而另外地分泌選自由以下因子組成的組中的因子抗凋亡因子、生長因子、VEGF、促 紅細胞生成素(EPO)、抗血小板藥、抗凝血藥和抗血栓形成藥，和/或分泌作為旁分泌因子 的內源性蛋白或肽，所述旁分泌因子以治療水平通過所述囊釋放，并且選自VEGF、IL6、IL8、 GDNF、NT3 禾口 MCPl0
18.如權利要求1 17中任一項所述的應用，其中，通過直接注入心臟組織，或通過 經供給受影響心臟組織的微動脈進行的血管內遞送，將所述球形微囊植入哺乳動物AMI或 AMI后患者的心肌的受影響區域。
全文摘要
本申請涉及編碼和分泌GLP-1、其片段或變體或者包含GLP-1、其片段或變體的融合肽的細胞(諸如間充質細胞干細胞或間充質基質細胞或任何另外的合適細胞)在治療急性心肌梗死(AMI或MI)中的應用，其中將編碼和分泌GLP-1、其片段或變體或者包含GLP-1或其片段或變體的融合肽的細胞封裝在(球形)微囊中以防止所治療患者的免疫系統的應答。本申請還涉及這些(球形)微囊或者含有這些細胞或(球形)微囊的藥物組合物在治療急性心肌梗死(AMI或MI)中的應用。
文檔編號C12N5/00GK102149370SQ200980135623
公開日2011年8月10日 申請日期2009年9月11日 優先權日2008年9月12日
發明者克里斯蒂娜·沃爾拉普, 埃里克·索內斯, 安德魯·倫哈德·劉易斯, 彼得·威廉·斯特拉特福德 申請人:生物相容英國公司