具有不同表達量的基因的鑒定方法

專利名稱：：具有不同表達量的基因的鑒定方法
技術領域：
：本發明涉及用于判定在等位基因之間表達量不同的基因的遺傳多態性檢索方法以及與表型相關的遺傳多態性的檢索方法。
背景技術：
：即便是處于基因組相同位點的相同基因，當位于不同等位基因上時其基因表達量不同的現象是近年來報告的比較新的概念(非專利文獻1:KnightJC.Allde-specificgeneexpressionuncovered(等4立基因-特異性基因表達無遮蓋).TrendsGenet.Mar;20(3):113-6.PMID:15049300、2004年)。在等位基因之間顯示不同表達量的基因大致分為印跡基因和非印跡基因兩種。前者所謂的印跡是指在某種細胞或組織中，當從雙親各遺傳一半等位基因時，任意一方受到生理性鈍化(例如曱基化等)，基因的表達被抑制的現象。后者，即非印跡基因中，有時也會在等位基因之間可見不同表達量的情況。這是由于，基因內或與其鄰近的等位基因之間的基因組的多態性作為調節附近基因的表達的順式作用區域起作用，產生等位基因之間的基因表達量的差別。在后者中可見的、由于基因組DNA序列的不同所引起的每個等位基因的表達變化認為是超過世代遺傳而來的性質，會影響個體間的基因表達量的差別、甚至個體的體質差別、病態及其危險率、或者對藥物應答性的不同。為了測定等位基因之間基因表達量的差別，在同一細胞內、即在相同環境條件下進行測定是最為精確的。而且在測定等位基因之間的基因表達量的差別時，重要的是能夠鑒定某個RNA是來自于哪個等位基因。因此，能夠區別等位基因的多態性(SNP等)必須也存在于作為基因轉錄產物的RNA序列上，通過對其進行測定從而能夠鑒定。目前已經有數個使用該RNA上的多態性(SNP)測定等位基因之間的表達量差別的報告(非專利文獻24:CowlesCR，HirschhomJN,AltshulerD,LanderES.Detectionofregulatoryvariationinmousegenes(在小鼠基因中調節變異的檢測).NatGenet.Nov;32(3):432-7.PMID:12410233、2002年；YanH，YuanW,VelculescuVE,VogelsteinB,KinzlerKW.RelatedAllelicvariationinhumangeneexpression(在人類基因表達中相關的等位基因變異).Science.Aug16;297(5584):1143.PMID:12183620、2002年；BrayNJ,BucklandPR,OwenMJ,O，DonovanMC.Cis-actingvariationintheexpressionofahighproportionofgenesinhumanbrain(順式作用變異在人腦基因的高比率表達).HumGenet.2003Jul;113(2):149-53.EpubMay01.PMD:12728311、2003年)。這些報告均是組合了RT-PCR法和直接測序反應或單核苦酸延伸反應的技術，即由mRNA合成cDNA,擴增后，將任意選擇的多態性分別地分型，并非是能夠同時測定多個基因的技術。到目前為止，有一個使用SNP分型用微陣列廣泛分析多個基因的報告(LoHS，WangZ,HuY,YangHH,GereS,BuetowKH,LeeMP.Allelicvariationingeneexpressioniscommoninthehumangenome(在人類基因組中等位基因變異在基因表達中是常見的).GenomeRes.Aug;13(8):1855-62.PMID:12902379、2003年)。這里，通過4吏用了polyT引物的普通RT法將帶有PolyA的mRNA轉變為cDNA,根據與通常的基因組DNA分型技術同樣的實驗規程，利用使用了多個特異引物的多重PCR法調制樣品，使樣品雜交于陣列，根據其信號比測定每個等位基因不同的cDNA(mRNA)的表達量比。但是，在帶有polyA的成熟型mRNA中，僅為剪接后的外顯子的序列，其長度很短、能夠評價的多態性(SNP)也很少。因此，能夠利用的多態性(SNP)有所局限，難以發現在每個等位基因上表達量均有差別的基因。另一方面，遺傳多態性與特定表型及基因表達(例如疾病、藥物有效性的不同)的關聯性也備受關注。但是，在研究特定遺傳多態性與表型及基因表達的關聯性時，例如在基因組上為SNP時，對于每個性狀必須對多個SNP(2004年10月報告的NCBIdbSNPbuild123中約1000萬)進行研究，對所有SNP進行研究是很困難的。因此，如果能夠迅速且高效地選擇在等位基因之間表型及基因表達不同的基因、研究如此選擇的遺傳多態性與表型及基因表達的關聯性，則可以探討疾病的原因或有效的治療方法等。
發明內容因此，本發明鑒于上述事實，其目的在于提供迅速且高效地檢索能夠判定在等位基因之間表達量不同的基因的遺傳多態性的方法。本發明的目的還在于，利用通過該方法檢索的遺傳多態性，檢索與表型相關的遺傳多態性的方法。本發明人為了解決上述課題進行了深入研究，結果發現通過利用存在于核內RNA上的遺傳多態性，可以高效地發現在等位基因之間表達量不同的基因，在該方法中，當選擇能夠選擇性地擴增核內RNA的DNA聚合酶時，成功地鑒定了實際上能夠判定在等位基因之間表達量不同的基因的遺傳多態性(SNP),進而完成了本發明。即，本發明包括以下內容。(1)用于判定在等位基因之間表達量不同的基因的遺傳多態性的檢索方法，包括以下步驟(a)通過使用了隨機引物的逆轉錄反應，由總RNA或核內RNA合成cDNA的步驟；(b)使用隨機引物和在等溫下反應的鏈置換DNA聚合酶，選擇性地擴增來自于較長核內RNA(—次轉錄產物)的cDNA的步驟；(c)檢測擴增的cDNA中存在的遺傳多態性的步驟；(d)根據該遺傳多態性，比較來自于位于基因組DNA的遺傳多態性為雜合型的基因組上各等位基因的cDNA表達量的步驟；(e)當來自于各等位基因的cDNA表達量顯著不同時，選擇比較所使用的遺傳多態性的步驟。在上述檢索方法中，作為DNA聚合酶例如可以使用029DNA聚在步驟(c)和(d)中優選包括以下步驟標記擴增的cDNA，進行使用了遺傳多態性特異性探針的雜交，根據該反應比較來自于各等位基因的表達量。在上述檢索方法中，可以使用單核苷酸多態性(SNP)作為遺傳多態性。(2)與表型相關的遺傳多態性的檢索方法，其包括使用通過上述檢索方法檢索的遺傳多態性，研究遺傳多態性或基因表達量與表型的關系。在上述檢索方法中，作為表型，可以舉出疾病的病態和嚴重程度、疾病的發病危險、對藥物的應答性、對食品的應答性、對化學物質的應答性以及對環境因子的應答性等。(3)與遺傳多態性相關的表型的檢索方法，其包括使用通過上述檢索方法檢索的遺傳多態性，研究遺傳多態性或基因表達量與表型的關系。在上述檢索方法中，作為表型，可以舉出疾病的病態和嚴重程度、疾病的發病危險、對藥物的應答性、對食品的應答性、對化學物質的應答性以及對環境因子的應答性等。通過本發明提供了用于檢索能夠判定在等位基因之間表達量不同的基因的遺傳多態性的迅速且高效的方法。由于如此^r索的遺傳多態性能夠識別等位基因之間的表達量，因此是用于分析該基因相關表型的有效方法。而且，認為如果能夠發現如此檢索的遺傳多態性和表型(疾病危險率或藥物應答性)的關系，則可以探討疾病的原因或有效的治療方法等。附圖簡述圖1為通過使用了^29DNA聚合酶的擴增獲得的cDNA的電泳照片。圖2為表示淋巴細胞BL1395的cDNA和基因組的信號比的頻率分布與該遺傳多態性(探針組合)存在的基因組上的基因的位置關系的圖。圖3為表示淋巴細胞BL2122的cDNA和基因組的信號比的頻率分布與該遺傳多態性(探針組合)存在的基因組上的基因的位置關系的圖。圖4為在表達分析用陣列U133plus2和100K陣列(XbaI50K)中的cDNA/基因組的信號比的比較圖。圖5為顯示PPARy基因上的SNP位點的圖。圖6為顯示使用直接測序法確認SNP的示意圖。圖7為顯示30名日本人的外周血淋巴細胞的PPARG基因表達量與遺傳多態性分型的關聯性的圖。圖8A和B為顯示30名日本人的外周血淋巴細胞的PPARG基因表達量與遺傳多態性分型的頻率分布(A)以及單倍型M和m的等位基因的圖。實施發明的最佳方式以下，詳細地說明本發明。本申請主張了2004年12月17日申請的日本國專利申請笫2004-366671號的優先權，包括上述專利申請的說明書和/或附圖所記栽的內容。1.檢索能夠判定等位基因之間表達量不同的基因的遺傳多態性本發明提供用于研究等位基因之間表達量不同的基因的方法。這里，所謂的"等位基因之間表達量不同的基因"是指來自于一個等位基因的基因表達量與來自于另一個等位基因的基因表達量不同的基因。來自于各等位基因的基因的表達可以作為區別特定遺傳多態性的指標，但并非所有的遺傳多態性可以區別等位基因之間的表達量差別。因此，本發明提供了迅速且高效地檢索能夠判定這種等位基因之間的表達量不同的遺傳多態性。(1)來自于核內RNA的cDNA的合成和擴增本方法中，由核內RNA合成cDNA。這里所謂的"核內RNA"是指由基因組DNA轉錄后，不經過剪接，因此不會移動至細胞質，還存在于核內的一次轉錄產物(初級轉錄本)。即，許多核內RNA含有基因組上的外顯子和內含子兩者，具有較長的鏈長(例如位于在2004年4月凈艮告的HumanGenomeBuild34(http:〃genome.ucsc.edu/)序歹寸上的21804個參考序列中,平均長為85,284bp、中位值為22,855bp,長M過5000bp的占4^p的約84%)。在測定等位基因之間的表達量差別時，必須在作為基因轉錄產物的RNA上存在遺傳多態性。由于核內RNA未受到剪接具有較長的鏈長，因此本發明人預期核內RNA可能含有許多能夠識別等位基因之間表達量不同的基因的遺傳多態性。例如在位于2004年4月報告的HumanGenomeBuild34(http:〃genome.ucsc.edu/)序列上的21804個參考序列中，mRNA的平均長為2,757bp、中位值為2,316bp,而含有其內含子的基因組上的長度為平均長85,284bp、中位值為22,855bp,即便不考慮遺傳多態性的密度，也有約40倍左右的區域能夠評價。為了由核內RNA合成cDNA，可以使用以下兩種方法/人試樣中僅提取出核內RNA，由該核內RNA合成cDNA的方法和從試樣中提取總RNA,由總RNA合成cDNA后，僅將來自于較長核內RNA的cDNA擴增的方法。在一個方法中，首先從試樣中提取核組分。試樣只要是來自于預使用本方法檢索用于判定等位基因之間表達量不同的基因的遺傳多態性的試樣則沒有特別限定，例如，可以使用來自于動物、植物、孩i生物(真菌、細菌等)的試樣，市售的細胞抹、凍存的細胞林等。試樣優選來自于哺乳動物、特別是人的試樣。對試樣的形態也沒有特別限定，例如為來自于人的試樣時，可以使用血液、唾液、淋巴液、氣管粘液、骨髓液、尿液、腹腔液等體液，細胞、組織等形態的試樣。核組分的提取可以使用本領域技術人員公知的方法進行。例如，可以通過勻漿器破碎細胞，利用差速離心或密度梯度離心分離核(例々口參照、MolecularcloningChapter17.8PreparationofnuclearextractsfromTissue/culturedmammaliancells(分子克隆章17.8由纟且織/培養哺乳動物細胞制備核的提取).CSHLPress,ISBN0-87969-577-3)。接著，通過使用了隨機引物的逆轉錄反應由如上調制的核內RNA合成cDNA。通過使用隨機引物，可以由試樣中存在的所有序列的RNA(核內RNA)合成cDNA。接著，使用隨機引物擴增逆轉錄的cDNA。由于核內RNA未經過剪接，因此鏈長較長，利用通常在擴增中使用的DNA聚合酶不能擴增。因此，本方法中使用在等溫度反應條件(等溫反應)下進行鏈置換的DNA聚合酶。作為具有上述性質的DNA聚合酶沒有局限，可以舉出#29DNA聚合酶(AmershamBioscience、商品名Genomiphi)。該029DNA聚合酶由于其擴增反應非常穩定，因此可以將通過逆轉錄反應合成的cDNA不經純化過程直接用在使用了#29DNA聚合酶的擴增反應中，另外，由于可以獲得pg級的收量，因此不用介意由于微量樣品的純化所導致的損失，由臨床檢體等極微量的樣品也可以擴增，因此在本方法的實施中特別優選。另外，作為具有上述性質的聚合酶，還已知Bst聚合酶，由NewEnglandBioLab供應(LageJM,LeamonJH，PejovicT,HamannS,LaceyM,DillonD,SegravesR,VossbrinckB，GonzalezA,PinkelD,AlbertsonDG,CostaJ,LizardiPM.WholegenomeanalysisofgeneticalterationsinsmallDNAsampleusinghyperbranchedstranddisplacementamplificationandarray陽CGH(使用高支鏈置換擴增和陣列-CGH用少量DNA樣品進行遺傳變異的全基因組分析).GenomeRes.2003Feb;13(2):294-307.PMID:12566408)。這種DNA聚合酶由于在擴增DNA時會在DNA片段的末端停止反應，因此末端附近的擴增率顯著降低，但當為較短DNA片段的擴增時，由于兩末端間的距離很近，因此整個片段的擴增率降低，結果較長的DNA片段、即未經過剪接的核內RNA被選擇性地擴增(LageJM,LeamonJH,PejovicT,HamannS,LaceyM,DillonD,SegravesR,VossbrinckB,Gonzalez入PinkelD,AlbertsonDG,CostaJ,LizardiPMWholegenomeanalysisofgeneticalterationsinsmallDNAsamplesusinghyperbranchedstranddisplacementamplificationandarray-CGH(使用高支鏈置換擴增和陣列-CGH用少量DNA樣品進行遺傳變異的全基因組分析).GenomeRes.2003Feb;13(2):294-307.PMTD:12566408;GeneralAmplificationofChromosomalDNAbyphi29DNApolymerase(通過phi29DNA聚合酶常規擴增染色體的DNA).AmershamBiosience)。因此，作為用于由核內RNA合成cDNA的其他方法，可以由試樣調制總RNA(含有核內RNA和mRNA),通過使用了隨機引物的逆轉錄反應，由多樣的RNA種合成cDNA，之后使用能夠選擇性擴增鏈長較長的cDNA(即，來自于較長核內RNA的cDNA)的上述DNA聚合酶(例如^29DNA聚合酶)進行擴增，從而選擇性地合成、擴增來自于核內RNA的cDNA。來自于該核內RNA的cDNA的擴增由于可以省略僅提取核內RNA的操作，因此在本方法的實施中優選。總RNA的提取可以通過本領域技術人員公知的方法進行，例如可以使用胍/銫法、AGPC(酸-異硫氰酸胍-苯酚-氯仿)法等。(2)遺傳多態性和等位基因表達量接著，比較來自于各等位基因的基因(擴增cDNA)的表達量。這里，表達量的比較在雜合性等位基因之間進行。遺傳多態性為雜合性的等位基因是指在基因組DNA的2個等位基因中具有各等位基因不同的遺傳多態性。因此，具有雜合性等位基因時，可以區分來自于各等位基因的擴增cDNA。而且，如果在上述表達量中具有顯著差異，則可以選擇其遺傳多態性作為用于判定等位基因之間表達量不同的基因的指標。這里，"遺傳多態性"或"多態性"是指引起個體間的性狀或形態多樣性的基因的差異，包括單核苷酸多態性(SNP)和單倍型等。SNP是指某個特定基因或基因群的單核苷酸的核酸發生突變。已知上述SNP會引起個體間的性狀或形態的多樣性。另外，所謂的單倍型是指由處于連續基因區域或基因群中多個位點突變部位的等位基因的種類和數量表示的多態性。單倍型的重組頻率小于通常的重組頻率，有在遺傳上保存的傾向。因此，在研究多態性和表型的關聯性時，不僅研究與各個突變的關聯性很重要，而且研究與特定單倍型的關聯性也很重要。另外，在遺傳多態性中包含插入/缺失多態性、重復序列的重復次數不同所導致的多態性、限制片段長度多態性等。在本方法中，由于存在多個SNP檢測方法、通過1個核苷酸的不同即可容易地區別等位基因等，因此優選利用單核香酸多態性(SNP)。對可以利用的遺傳多態性沒有特別限定，遺傳多態性的信息可以由公共的數據庫等容易地獲得。例如，人、小鼠等的SNP和單倍型的信息可以通過NCBI數據庫(11鄉://^\￥.11€^.111111.11111^0^'51^)/)獲得，另外人SNP信息也可以從JSNP數據庫(http:〃snp.ims.u-tokyo.ac.jp/indexJa.html)獲得。其他的遺傳多態性信息只要是本領域內技術人員即可容易地獲得。遺傳多態性的檢測和測定由含有遺傳多態性的等位基因的表達量可以使用本
技術領域：
中公知的方法進行。例如，遺傳多態性的檢測和測定由等位基因的基因表達量可以通過與一個遺傳多態性的特異性探針的雜交來進行遺傳多態性。探針可以根據需要通過熒光物質或放射性物質等的適當手段進行標記。探針只要是含有遺傳多態性部位、與擴增的cDNA特異性雜交，則沒有限定，具體的探針設計在本
技術領域：
中是公知的。另外，雜交的條件只要是用于區別遺傳多態性的充分條件即可，例如在一個遺傳多態性的情況下雜交、而在其他遺傳多態性的情況下不雜交的條件，例如為本領域技術人員所公知的嚴格條件。探針還可以一端固定在基板上作為DNA芯片(孩i:陣列)使用。此時，DNA芯片中可以僅固定對應于一個遺傳多態性的探針，還可以固定對應于兩個遺傳多態性的探針。使用了這種DNA芯片的遺傳多態性的檢測例如記載在"DNA微陣列和最新PCR法"、村松正明和那波宏之監^奮、秀潤社、2000年、第10章等中。作為使用了DNA芯片的遺傳多態性的檢測的具體例子，對使用Affymetrix/>司生產的GeneChip(注冊商標)HumanMapping100Karray的方法進行說明。GeneChip(注冊商標)HumanMapping100Karray是含有2張陣列，能夠檢測基因組上存在的超過100,000個的SNP。使用方法如下利用限制性酶(XbaI或HindIII)剪切試樣(基因組、cDNA等)，連接接頭，使用與該接頭特異的l種引物(對于XbaI、HindIII分別為1種)通過PCR反應擴增，進行標記。2張陣列按照與每個SNP的等位基因互補進行設計，雜交后，根據信號判定試樣的SNP，根據信號強度或信號比可以比較各等位基因的表達量。對于該DNA芯片的詳細情況，可以參照在http:〃www.affymetrix.co.jp/products/arrays/specific/lOOk.和htmlhttp:〃www.affymetrix.co.jp/pdf/Mapping_l00K.pdf中公開的產品信息和數據表格。另外，遺傳多態性除了上述方法之外，還可以通過本領域技術人員公知的所有方法檢測。作為這種方法，可以使用下述方法利用與遺傳多態性特異的引物的方法、利用限制片段長度多態性(RFLP)的方法、直接測序法、變性梯度凝膠電泳法(DGGE)、化學裂解錯配法(CCM)、引物延伸法(PEX)、侵入法、實時定量PCR(TaqMan法)等。本方法中，優選使用簡單且迅速、能夠盡量多地檢測遺傳多態性存在的DNA芯片(孩t陣列)。如上所述，當根據遺傳多態性的不同研究每個等位基因的基因表達量(信號強度)，來自于各等位基因的基因表達量有顯著性差異時，選擇其遺傳多態性。具體地說，求出表達量高的等位基因相對于表達量低的等位基因的表達量比率，選擇其比率至少為1.3、優選至少為1.5的遺傳多態性。這里，所謂的比率為1是指來自于兩等位基因的基因表達量基本相等。如上所述，利用遺傳多態性比較各等位基因的表達量，結果，可以選擇表達量有差異的遺傳多態性作為用于判定等位基因之間表達量不同的基因的遺傳多態性。如此選擇的遺傳多態性在以后只要僅檢測其遺傳多態性，即可判斷某個檢體是否具有表達量多的等位基因。另外，如后所述，由于在等位基因之間表達量不同的基因可能與特定的表型有關，因此利用如此選擇的遺傳多態性，可以明確遺傳多態性和表型的關系。2.與表型相關的遺傳多態性的檢索方法遺傳多態性由于是引起個體間的性狀或形態多樣性的基因差別，因此遺傳多態性和表型可能具有某種關系。但是，遺傳多態性即便僅是存在于基因組上的SNP至少就有約1000萬個(2004年10月報告的NCBIdbSNPbuild123),由如此龐大數量的SNP中選擇與特定表型相關的信息是非常困難的。另一方面，在等位基因之間表達量不同的基因有可能與特性表型有關。因此，通過上述方法檢索的、能夠判定等位基因之間表達量不同的基因的遺傳多態性與其他遺傳多態性相比，與表型關聯的可能性更高。因此，本發明的與表型相關的遺傳多態性的檢索方法的特征在于，使用通過上述方法檢索的遺傳多態性，研究遺傳多態性或基因表達量與表型的關系。這里，作為表型可以舉出疾病的存在(病態和嚴重程度)、疾病的發病危險、對藥物的應答性、對食品的應答性、對化學物質的應答性、對環境因子(例如紫外線、溫度等)的應答性等。具體地說，本方法可以根據本
技術領域：
中/>知的關聯法、同胞配對法等進行。例如，在關聯法中，使用顯示特定表型的被檢體和不顯示特定表型的被檢體，研究與通過上述檢索方法檢索的遺傳多態性的出現頻率或基因表達量的關系。例如，具有特定遺傳多態性的頻率在顯示特定表型的被檢體中顯著高時，可以判斷其遺傳多態性的差別對于調節與表型相關的基因表達量的量具有影響，或者由于遺傳多態性的遺傳密碼變化在氨基酸中產生變化、蛋白質的性質發生改變，因而其影響表型的表達等。同胞配對法是比較具有相同表型(例如疾病)的家屬(兄弟姐妹)，特定表型相關基因存在的染色體區域的方法。這些方法例如記載于"了解前沿的基因組醫學"、中村祐輔著、羊土社、2000年、第1章等中。例如，含有通過上述方法檢索的遺傳多態性的基因由于在同一個體內的等位基因之間的表達量不同，因此通過其等位基因的類型(即遺傳多態性的種類)可以推測個體間的表達量不同。因而，測定多個個體的遺傳多態性和表達量，可以確認個體間的表達量與遺傳多態性信息相關。通過本方法，可以檢索與表型相關的遺傳多態性。如此檢索的遺傳多態性對診斷疾病的發病或發病危險、評估藥物的應答性有用.本發明中，使用通過上述方法檢索的遺傳多態性研究遺傳多態性或基因的表達量與表型的關系，從而還可以檢索與遺傳多態性相關的表型。例如，通過由某個基因編碼的蛋白質所具有的"固有性質"(例如PPARy與脂質代謝等有關等)，推測由于其基因上的遺傳多態性不同，表型有所不同(例如，推測PPARy與糖尿病等脂質代謝有關的表型相關)。因此，實際上通過評價遺傳多態性和表型(例如將各種個體的糖尿病藥ACTOS的反應性與PPARy遺傳多態性的分型結果相比較)，實際上可以確認其關聯。本發明人在實施上述方法時發現，實際上人的過氧化物酶體增殖因子激活受體y(PPARY或PPARG)基因在等位基因之間的表達量不同，另外，還找到了能夠判定由各等位基因的表達量不同的遺傳多態性。實施例以下使用實施例更加詳細地說明本發明的方法，但本發明的技術范圍并不局限于這些實施例。[實施例1]在本實施例中，由核內RNA進行cDNA的合成和擴增。對于由EB病毒林化的淋巴細胞BL1395(ATCCCRL-5957)和BL2122(ATCCCRL-5967)的總RNA各lng,進行DNAase處理，之后4吏用逆轉錄酶(Invitrogen7>司SuperscriptIIIRTenzyme),按照包含在內的實驗規程進行逆轉錄，制作單鏈cDNA。從所得的反應液中取出1^1，不經過純化直接加入到按照AmershamBioscience出售的商品名為Genomiphi的實驗規程加入有隨機引物和phi29酶的反應溶液中，在30。C下反應16小時，分別獲得2.34ng和2.27pg的cDNA。對上述擴增的cDNA進行電泳，結果示于圖1中。圖1的條帶1和2表示如上那樣使用phi29DNA聚合酶調制的cDNA。如圖1所示，在10Kb以上至約3KB的以約8Kb為中心的范圍獲得成片的條帶(圖1的條帶1~2)。考慮到由通常的mRNA合成時的cDNA長度的中間值為2，316bp,這說明僅選擇性地擴增了較長的cDNA。即，通過使用phi29酶，可以選擇性地擴增來自于鏈長較長的核內RNA的cDNA。[實施例2]在本實施例中，使用來自于實施例1調制的核內RNA的cDNA，對SNP的分型和基因表達量進行實驗。(l)確認來自于使用phi29酶的核內RNA的cDNA擴增最初，使用在實施例1中擴增的cDNA,根據100K陣列的實驗規程(Affimetrix)從250ng開始反應。具體地說，根據通常的100K的實驗規程將如實施例1所記載的利用phi29擴增的cDNA和同樣利用phi29擴增的基因組DNA擴增后，荻取其信號強度比(cDNA的信號強度/基因組DNA的信號強度)，研究其頻率分布。通過如此求出的信號強度比，由于序列差別所產生的二級結構的差別而存在易被phi29擴增的序列和難以被擴增的序列(擴增的偏倚)，但通過用cDNA的信號值除以利用phi29擴增的基因組的信號值，可以除去該擴增的偏倚。結果，如圖2和3所示，在信號比低的地方出現認為是噪音的接近于正態分布曲線的形狀，此處有很多來自于存在于無基因區域(圖2和3的棒狀圖的淺灰色區域)的遺傳多態性的信號(探針組合)。另一方面，在圖2和3的右側可見超出上迷正態分布曲的信號比很強的部分(圖2和3中箭頭所示的部分)，此處有很多來自于存在于有基因區域(基本來自于內含子)的遺傳多態性的信號(探針組合)。由該頻率分布的形狀和探針組合與基因組上的基因的位置關系，通過該測定法可以分離來自于基因(cDNA)的信號和噪音，通過測定cDNA與基因組的信號比，可以將信號比高的部分看作表達基因(主要是來自于核內RNA的cDNA)所產生的信號。另外，使用通常的表達分析用陣列(AffymetrixU133plus2.0array;http:〃www.affymetrix.co.jp/pdf/HG—DS.pdf)確認了利用通常的微陣列測定的基因表達量與如上分析的cDNA和基因組DNA的信號比有關。具體地說，調制BL2122的總RNA,使用AffymetrixU133plus2.0array按照通常的實驗規程進行分析。使約54000個探針組合的平均信號值作為100,將全體平均化后，對信號強認為表達量高的基因群(得分100以上)和信號弱認為表達量低的基因群(IO以下)的2組，在陣列)的SNP探針中，研究根據上述信息荻得的cDNA/基因組的信號比，觀察其頻率分布。結果，如圖4所示，表達低(U133plus2.0中得分為10以下)者基本進入了上述被認為是噪音的接近于正態分布形狀的部分中，相反，表達高(U133plus2.0中得分為100以上)者大部分進入了上述右側認為是捕獲來自于cDNA的信號的部分中。由上認為，通過本實施例測定的cDNA/基因組比的值與實際的基因表達量有關，通過phi29可以更加具有選擇性地擴增核內剪接前的含有內含子的較長核內RNA。(2)等位基因之間的表達量差異的檢測如上述(l)所述，從BL1395和BL2122(來自女性)的各2種等位基因(A、B)中獲取cDNA和基因組的信號比，測定來自于等位基因A和等位基因B的RNA(cDNA)量，進而，利用兩者的比(等位基因A的cDNA/基因組比與等位基因B的cDNA/基因組比之比)確定等位基因A和等位基因B之間的表達量差異有多少。這里，當比值為1時，可以說兩個等位基因的表達量相等。結果，如表1所示，與其他常染色體(1.69和2.01)相比，在由于生理印跡導致一個等位基因鈍化的X染色體中可見統計學上有意義的等位基因之間的表達差別(4.24和5.06)。表l常染色體X染色體t檢驗p值BL13951.694.241.12xl(T(-6)BL21222.015.061.70xl(T(-8)由以上可知，在通過phi29聚合酶擴增的cDNA中，通過試行100K陣列(50KXbal陣列)根據SNP研究等位基因的表達量，可以確認能夠測定各等位基因的表達量。[實施例3]本實施例中，研究PPARG基因的等位基因之間的表達差別。在通過實施例2確認在等位基因之間具有表達差別的基因中，可以選擇PPARG(過氧化物酶體增殖激活受體力。在100K陣列中含有的50KXbal陣列上，設計位于PPARG基因區域共計7個SNP位點上的探針組合。在通過實施例2進行的淋巴細胞BL1395的分析中，鄰近上游、接近300bp以內的rsl0510410、rsl0510411和rsl0510412(NCBIdbSNP數據庫ED)的3個SNP通過基因組的分型為多態性(即能夠區別2個等位基因)。這3個SNP在PPARG基因上的位置示于圖5中。圖5中，開星形為可以判斷PPARG基因的等位基因之間表達量差異的SNP(信息SNP)。對于任何位點的SNP，兩等位基因之間的表達比(等位基因A和等位基因B的cDNA/基因組比之比)如表2所示，均為4倍以上。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>通過直接測序法確認了含有上述3個SNP區域的等位基因的存在比。大致結果示于圖6,當為BL1395樣品的rsl0510410時，如圖所示，基因組DNA(c)為A/C的雜合子，這在通過phi29擴增的基因組DNA中也沒有變化。另一方面，在通過phi29擴增的cDNA(a和b)中，來自于等位基因A的信號降低，基本成為僅是等位基因C的波形。即，雖然基因組上rsl0510410為A/C的雜合子，但實際上被表達的基因中來自于C的等位基因的表達量更多。結果與50KXbal陣列的結果一致。在BL2122的淋巴細胞中未見PPARG基因的表達。另外，對于上述3個SNP，通過直接測序法對30名日本人進行了分型，研究與外周血淋巴細胞的PPARG基因的表達的相關性。即，對于上述3個SNP類型與PPARG基因的表達量的關系進行了分析。PPARG基因的表達分析按照常規的實驗規程使用AmershamBioscience公司表達分析用陣列CodeLink，按照中間值為1對各陣列的總探針信號進行平均化。結果，如圖7和圖8A(表和頻率分布)所示，根據30名日本人的存在頻率，檢體可以分類為在rs10510410、rs觀0411和rsl0510412中分別為C型、A型和A型的存在頻率低的等位基因(m)的純合子型；在rsl0510410、rsl0510411和rsl0510412中分別為A型、G型和G型的存在頻率高的等位基因(M)的純合子型；以及它們的雜合子型。在存在頻率低的等位基因的純合子型(mm型。圖7和圖8A中以網格表示)中，與其他類型(mM和MM型)相比，表達值高(mm的平均值為1.58,其余的為0.80),特別是表達特別高的3個檢體中，有2個才企體是mm型。由以上結果可知，這些SNP(單倍型)的存在與PPARG基因的表達量有關，這些SNP分型對于研究個體的PPARG活性、診斷和篩查與PPARG相關的疾病、以及研究以PPARG為耙標的藥物的應答性有效。另外，在這30人的檢體中，由于3個位點的SNP(rsl0510410、rslOMCHll和rsl0"0412)中主要等位基因M和次要等位基因m的組合完全一致(圖7),因此3個SNP處于完全連鎖不平衡狀態，形成單倍型，如圖8B所示，認為存在2個單倍型M和m，單倍型m的PPARG表達量更高(圖7)。通過研究該單倍型內和與其處于連鎖不平衡的周圍的SNP，也可以達成上述目的。以上，通過本方法檢索了能夠判定等位基因之間表達量不同的基因的遺傳多態性，如此檢索的遺傳多態性與基因的表達量有關，因此有可能還影響表型。本說明書中引用的所有刊物、專利和專利申請均是直接作為參考編入在本說明書中的。產業實用性本發明提供用于檢索能夠判定等位基因之間表達量不同的基因的遺傳多態性的迅速且高效的方法。另外，如此檢索的遺傳多態性可以識別等位基因之間的表達量，因此可以成為分析該基因相關的表型的有效方法。而且，如果可以發現如此檢索的遺傳多態性與表型(疾病危險率或藥物應答性)的關系，則可以研究疾病的原因或有效的治療方法等。序列表自由正文序列號1~3:人過氧化物酶體增殖因子激活受體Y的部分序列(序列號3的n表示g或t)。權利要求1.用于判定在等位基因之間表達量不同的基因的遺傳多態性的檢索方法，其包括以下步驟(a)通過使用了隨機引物的逆轉錄反應，由總RNA或核內RNA合成cDNA的步驟；(b)使用隨機引物和在等溫下反應的鏈置換DNA聚合酶，選擇性地擴增來自于較長核內RNA作為一次轉錄產物的cDNA的步驟；(c)檢測擴增的cDNA中存在的遺傳多態性的步驟；(d)根據該遺傳多態性，比較來自于位于基因組DNA的遺傳多態性為雜合型的基因組上各等位基因的cDNA表達量的步驟；(e)當來自于各等位基因的cDNA表達量顯著不同時，選擇比較所使用的遺傳多態性的步驟。2.權利要求l的方法，其中DNA聚合酶為029DNA聚合酶。3.權利要求1或2的方法，其中步驟(c)和(d)包括將擴增的cDNA標記，進行使用了遺傳多態性特異性探針的雜交，根據該反應比較來自于各等位基因的表達量。4.權利要求13中任一項的方法，其中遺傳多態性為單核苷酸多態性SNP。5.與表型相關的遺傳多態性的檢索方法，其包括使用通過權利要求1~4中任一項的方法檢索的遺傳多態性，研究遺傳多態性或基因表達量與表型的關系。6.權利要求5的方法，其中表型選自疾病的病態和嚴重程度、疾病的發病危險、對藥物的應答性、對食品的應答性、對化學物質的應答性以及對環境因子的應答性。7.與遺傳多態性相關的表型的檢索方法，其包括使用通過權利要求14中任一項的方法檢索的遺傳多態性，研究遺傳多態性或基因表達量與表型的關系。8.權利要求7的方法，其中表型選自疾病的病態和嚴重程度、疾病的發病危險、對藥物的應答性、對食品的應答性、對化學物質的應答性以及對環境因子的應答性。全文摘要本發明涉及用于判定在等位基因之間表達量不同的基因的遺傳多態性的檢索方法，以及與表型相關的遺傳多態性的檢索方法。更具體地說，本發明涉及利用存在于核內RNA上的遺傳多態性，有效地判定等位基因之間表達量不同的基因的方法。文檔編號C12N15/09GK101124341SQ20058004845公開日2008年2月13日申請日期2005年12月15日優先權日2004年12月17日發明者油谷浩幸,石川俊平申請人:國立大學法人東京大學;株式會社哈普羅制藥