血液淋巴細胞中子宮內膜異位癥的分子診斷標志物的鑒定的制作方法

專利名稱：：血液淋巴細胞中子宮內膜異位癥的分子診斷標志物的鑒定的制作方法血液淋巴細胞中子宮內膜異位癥的分子診斷標志物的鑒定相關申請本申請要求于2005年2月18日提交的美國60/654,331號臨時申請的權益，在此通過引用的方式將該申請整體并入。發明領域使用DNA微陣列鑒定的基因目標對子宮內膜異位癥患者外周血白細胞的基因表達模式的分析，用于對所述疾病的非侵入式診斷測定。發明背景子宮內膜異位癥是一種相當普遍的婦科疾病，影響多達10%的育齡婦女(Mahmood,T.A.andTempleton，A.1991//wm6:544-549)。子宮內膜異位癥的發病機理仍然不清楚，并且對子宮內膜異位癥損害的建立、發展及遷移到盆外位置的機理也還沒有充分理解(Wkz，C.A.etal.2003i^/wFeW!76:34-40)。子宮內膜異位癥的診斷通常是通過腹腔鏡對盆腔進行視覺檢查(Attaran，M.etal.2002C7eve/Merf69:647-653)。這種診斷方法依賴于外科醫生的專業技術因此本質上是不精確的。另外，腹腔鏡方法的侵入性及與之關聯的疾病排除了其用于監控疾病的復發及對治療的響應。盡管迫切需要診斷子宮內膜異位癥的非手術方法及用于預后及治療監控的非侵入式手段，目前仍然沒有基于血液中標志物鑒定的特異性實驗室檢驗(Falcone，T.andMascha，E.2003FeW/Sten780:886-888)。此外，那些遭受長期劇烈痛苦、不育及精神痛苦的患病婦女沒有多少治療選擇，這些治療方式都不能治愈該病。尋找用以建立子宮內膜異位癥特異性檢驗的候選基因被證明很有挑戰性。因此，我們決定應用DNA微陣列技術來加速鑒定子宮內膜異位癥的分子生物標志物。DNA微陣列日益被用于鑒定與諸如癌癥、糖尿病和心血管疾病等復雜基因疾病相關的基因表達鐠(Hughes,T.R.andShoemaker,D.D.2001CwrC^z>2CAem5/o/5:21-25)。這種有效的技術揭示了基因表達中的疾病特異4莫式，因此加速了候選基因的鑒別(Albertson,D.G.andPinkel，D.2003//wmMo/Gewe/12:R145國52)。迄今為止，關于用DNA微陣列來發現子宮內膜異位癥相關基因只有5篇報道。所有5項研究都將腹腔鏡手術中得到子宮內膜異位組織的基因表達譜與正常的子宮內膜比較，但分別關注該病的不同方面(即不育、深部子宮內膜異位及卵巢子宮內膜異位嚢腫)。在Eyster等人(2002)的一項研究中，所分析的4，133個基因中的8個與對比的子宮內膜相比在子宮內膜異位嚢腫中顯示過表達(Eyster，K.M.etal.2002FeW/S&n777:38-42)。過表達的基因是細胞骨架元件(波形蛋白、/5-肌動蛋白及a-2-肌動蛋白)，管家基因(40S核糖體蛋白S23)或免疫相關蛋白(Ig下輕鏈、Ig胚系H鏈、補體、主要組織相容性復合體I類)。作者提出諸如波形蛋白的細胞骨架蛋白的表達水平提高能夠解釋子宮內膜異位細胞的侵入潛力，以及免疫細胞滲透進子宮內膜移植物能夠說明所觀察到的免疫球蛋白基因的過表達。Arimoto等人(2003)也應用DNA微陣列來鑒定卵巢子宮內膜異位嚢胂的基因表達鐠(Arimoto，T.etal.2003/"Z/(9腳/22:551-560)。子宮內膜嚢腫中顯示上調節的基因包括HLA抗原，補體因子，核糖體蛋白及轉化生長因子B1(TGFBI)。下調節的基因包括TP53、生長停滯及DNA損傷誘導蛋白(GADD34、GADD45A及GADD45B)、p53誘導的蛋白(PIGll)以及輸卵管糖蛋白(OVGPl)。Lebovic及其同事(2002)比較了在子宮內膜異位中被IL-ljS誘導的597個人類基因與正常的子宮內膜活組織檢查的基因表達水平(Lebovic，D.I.etal.2002FeW//^m778:849-854)。他們觀察到細胞周期調節基因Tob-l在異位的基質細胞中被IL-1/3下調節，并且提出抑制該基因的表達可能促進子宮內膜異位細胞的生長。Kao等人(2003)用DNA微陣列分析與子宮內膜異位相關的不育癥的分子基礎(Kao,L.C.etal.2003五wdocn'"o/ogy144:2870-2881)。在植入的時間窗口期間在正常子宮內膜中通常上表達，但在子宮內膜異位癥中凈皮發現下降的基因包括IL-15(NK細胞增殖及功能的強促進因子)、補體4結合蛋白(C4BP;其可能通過與LRP5相互作用而干擾Wnt信號傳導)及glycodelin(其受孕酮調節且被認為干擾受精)。最后，最近發現深部子宮內膜異位損害具有增加的血小板衍生生長因子受體a(PDGFRA)、蛋白激酶CjSl(PKCj81)及janus激酶1(JAK1)的表達，提供了RAS/RAFIMAPK途徑參與子宮內膜異位癥的病理生理學的證據(Matsuzaki,S.etal.2004A/o/Z/wm10:719-728)。發明延續本研究的目的是為了鑒定來自子宮內膜異位癥患者與對照組的血液淋巴細胞的基因表達i普的區別。盡管在子宮內膜異位癥中血液可能不是主要的靶組織，但有一些證據表明這種疾病與炎性成分有關，且可以在外周血淋巴細胞中被監控甚至測定(Bedaiwy,M.A.etal.2002/^wie;^od17:426-431)。即使血液淋巴細胞不直接參與疾病過程，已經顯示這些細胞的基因表達譜指示并診斷疾病的狀態(Tang,Y.etal.2001^"rtA^wro/50:699-707)。因此，我們假設鑒定在外周血淋巴細胞中差異表達的基因會揭示能用于理解疾病發病機理并且，非常重要的，用于設計特異的能夠輔助診斷的非侵入式分子檢驗的基因目標。我們報導基因目標的鑒定，這種鑒定被預想為使用血液樣本診斷子宮內膜異位癥的基礎。發明概述本發明包括在女性個體中鑒定或預測易患子宮內膜異位癥體質的至少一種差異表達的基因或蛋白或肽的基因表達水平以提供第一值，測定對照或參考標準中所述白細胞的至少一種差異表達的基因或蛋白或肽的基因表達水平以提供第二值，比較所述第一值與第二值之間是否有差異。本發明包括方法，其中測定選自LOXL1、IL2RG、LRP5、MPB、TNF、MAN2A2、P4HA1及PDGF的成員的基因表達水平。本發明還包括方法，其中對于選自LOXL1,IL2RG,LRP5，MPB，TNF，MAN2A2，P4HA1及PDGF的成員，比較的蛋白或肽水平提高或降低。本發明還包括對被鑒定患有子宮內膜異位癥的個體在治療前后進行監控的方法，所述方法包括在治療前測定個體的外周血白細胞或外周血樣本中外周血白細胞的至少一種差異表達基因的基因表達水平以提供第一值，在治療后測定所述白細胞的至少一種差異表達基因的基因表達水平以提供第二值，比較治療前后所述個體的基因表達水平的差異。本發明還包括篩選用于治療子宮內膜異位癥的候選試劑的方法，包括使能夠表達至少一種差異表達的基因的細胞離體與候選試劑接觸，測定細胞中至少一種差異表達的基因的基因表達水平以提供第一值，測定候選試劑不存在時細胞中相同的至少一種差異表達的基因的基因表達水平以提供第二值，并比較所述第一值與第二值，其中基因表達水平的差異表示試劑可能能夠用于子宮內膜異位癥的治療。本發明還包括治療或預防子宮內膜異位癥的方法，包括給予個體有效量的試劑，該試劑能夠誘導至少一種差異表達的基因或基因表達產物的基因表達、合成或活性水平的升高或降低。本發明還包括生產用于治療或預防子宮內膜異位癥的藥物的方法，該藥物包括有效量的試劑，該試劑能夠誘導至少一種差異表達的基因或基因表達產物的基因表達、合成或活性水平的升高或降低。本發明還包括鑒定或預測女性個體中的易患子宮內膜異位癥體質的試劑盒，包括下列裝置測定個體的外周血白細胞或外周血樣本中外周血白細胞的至少一種差異表達基因的基因表達水平以提供第一值，測定對照或參考標準中所述白細胞的至少一種差異表達基因的基因表達水平以提供第二值，比較所述第一值與第二值是否有差異。附圖的簡要說明圖1.根據基因選擇程序(arrayanalysis.nih.gov,見實施例l)的9個最能夠區別的基因的表達。每行代表一種基因，每列代表一個樣品。對于每個基因，紅色(深灰色)表示比平均值水平高的表達，綠色(淺灰色)表示比平均值水平低的表達。下面的標尺表示偏離平均值的標準偏差的數值。(斜體的克隆ID不是IMAGE克隆。Unigene/基因符號來自UniGenebuild#173)。圖2.子宮內膜異位癥患者對正常對照組的相對基因表達。y-軸顯示9個最能夠區別的基因經相對管家基因GAPDH的表達進行標準化之后的平均相對表達(2—AAct)。p值用雙邊不成對t檢驗來計算。**p<0.001;*p<0.01。圖3.子宮內膜異位癥患者對正常對照組的基因的mRNA表達(組1)。圖4.子宮內膜異位癥患者對正常對照組的基因的mRNA表達(組2)。圖5.子宮內膜異位癥患者對正常對照組的相對基因表達(組2)。圖6.組1對組2的相對表達比較。圖7，相對表達(全部)。優選實施方案詳述本研究的目的是為了用DNA微陣列鑒定外周血淋巴細胞中的子宮內膜異位癥的分子生物標志物。作為多中心學術研究計劃的一部分進行了病例-對照研究。分析了患有或未患有子宮內膜異位癥的絕經前婦女，其是否患病是由婦產科專家在手術過程中確定的。微陣列分析包括6位子宮內膜異位癥患者和5位對照；15位子宮內膜異位癥患者和15位對照用實時RT-PCR分析。包含了不同疾病階段的患者。將子宮內膜異位癥患者及對照組的血液淋巴細胞中的mRNA表達水平與標準總RNA的表達水平進行比較。基因表達數據用實時RT-PCR分析驗證。基因選擇程序鑒定在子宮內膜異位癥患者的樣本中差異表達的基因。為驗證基因表達數據，用實時RT-PCR分析了9個最能夠區別的基因。所鑒定的9個基因中的兩個，白介素2受體下(嚴重聯合免疫缺陷)(IL2RG)和賴氨酰氧化酶樣1(LOXLl)顯示有顯著的表達差異，白介素2受體7包含如Genbank登記號AY692262的核芬酸及氨基酸序列，賴氨酰氧化酶樣1包含如Genbank登記號BC015090的核苷酸及氨基酸序列。這是首次報道在子宮內膜異位癥患者的外周血淋巴細胞中差異表達的基因，這為該病的發病機理提供了重要的線索。此外，預期將它們考慮作為子宮內膜異位癥的非侵入式診斷化驗的目標并預期在更大量人群中得到驗證。除非另外定義，本文所用的技術及科學術語與本領域普通技術人員的一般理解具有相同的含義。例如參見SingletonPandSainsburyD.，DictionaryofMicrobiologyandMolecularBiology(微生物學及分子生物學詞典)3rded.,J.Wiley&Sons,Chichester,NewYork,2001及TheGlossaryofgenetics(遺傳學詞匯),5thEd"R,Riegeretal.(eds.)，SpringerVerlag(1991)。本發明文中的"差異表達"是指與對照組個體(如診斷為陰性或患有無法察覺的子宮內膜異位癥的人、正常或健康的個體)相比，在患有子宮內膜異位癥的個體的外周血白細胞中以不同的量表達的轉錄表達產物及基因表達產物(如蛋白或肽、mRNA、cDNA)。"轉錄本"是指用另一條核酸鏈作為模板合成的核酸的一條鏈。本發明中"蛋白或多肽或肽"預期包括它們的任何片段，特別是免疫學上可檢測的片#更。本領域技術人員會認識到細胞釋放的蛋白能夠被降解或切割成這樣的片段。另外，某些蛋白或多肽以未活化的形式被合成，隨后通過蛋白水解得到活化。特定蛋白的這樣的片段可以作為蛋白本身的替代品被檢測。蛋白可以是分泌的(排出的)或非分泌的。非分泌的蛋白可以是細胞內的(在細胞內部的)或在細胞表面上的。本文所用的術語"樣本"是指從個體得到的用于鑒定、診斷、預測或監控目的的樣本。在本發明的某些方面中釆集這樣的樣本可以是為了確定正在發生的疾病狀態的結果或子宮內膜異位癥的治療方案的效果。優選的測試樣本包括血液、血清或血漿。另外，本領域技術人員會認識到有些測試樣本在分離或純化程序后會更容易分析，這些程序例如將全血分成血清或血漿成分。本文所用的術語"血液，，是指未經過事先分離的全血、外周血白細胞、外周血單核細胞(PBMCs)或血液的其它亞組分。術語"外周血"是指系統循環中的血液。"基因表達水平"或"肽水平"中的差異是相對的差異。例如，其可以是從患有子宮內膜異位癥的個體中取得的樣本的基因表達水平與對照組個體或參考標準之間的差異。可以比較有患子宮內膜異位癥風險的個體與已知不患有給定疾病狀態的，即"正常的，，或"對照組，，個體的基因表達水平。或者，可以與已知與良好結果(如不患有子宮內膜異位癥)相關的"參考標準"進行比較，這種"參考標準"例如是在不患有子宮內膜異位癥的正常個體群中發現的平均水平。根據本發明，能夠進行基因表達水平與發展出子宮內膜異位癥的個體的鑒定或體質之間的比4交。檢測樣本中存在的基因表達水平或蛋白/肽的水平可以是絕對量的(如pg/ml)或相對量的(如信號的相對強度)。如果一個樣本中基因表達的量或蛋白/肽的水平在統計學上與另一個樣本中的基因表達的量或蛋白/肽的水平顯著不同，則兩個樣本之間存在差異。例如，如果一個樣本中基因表達的量或蛋白/肽的水平比另一個樣本中高至少約20%、至少約30%、至少約50%、至少約80%、至少約100%、至少約200%、至少約400%、至少約600%、至少約800%或至少約1000%,則兩個樣本的基因表達或蛋白/肽的水平之間存在差異。鑒定或預測易患子宮內膜異位癥的體質可以被認為是一種診斷技術。診斷方法的靈敏性和特異性不同。技術人員往往在一個或多個診斷指標的基礎上做出診斷。在本發明中，這些指標為差異表達基因的表達水平和/或其多肽水平。差異表達基因或其多肽的存在、缺失或含量表示子宮內膜異位癥的存在、嚴重程度或不存在。可以進行對一種或多種基因的基因表達和/或多肽水平的多次測定，以及測定基因表達或多肽豐度隨時間的變化，這可以用來監控疾病的發展或疾病的治療。例如，可以在初始時間測定基因表達/多肽豐度，然后在第二時間再次測定。在這方面，基因表達和/或多肽水平從初始時間到第二時間的升高可以診斷子宮內膜異位癥。類似地，基因表達和/或多肽水平從初始時間到第二時間的下降可以表示個體對子宮內膜異位癥特定治療方式的反應。此外，一種或多種基因的基因表達的變化可能與子宮內膜異位癥的嚴重程度以及未來的不利事件相關。在本發明的一個實施方案中，測定至少一種基因的基因表達水平和/或其多肽水平。在一個實施方案中，測定下列基因的基因表達水平和/或其多肽水平賴氨酰氧化酶樣1(L0XL1)如Genbank號BC015090;白介素2受體？(嚴重聯合免疫缺陷)(IL2RG)，如Genbank號AY692262;低密度脂蛋白受體相關蛋白5(LRP5)，如Genbank號AF064548;髓鞘堿性蛋白(MBP),如Genbank號Ll8866;胂瘤壞死因子(TNF超家族，成員2;TNF)，如Genbank號BC028148;甘露糖苷酶，a，2A類，成員2(MAN2A2)，如Genbank號NM—006122;前膠原脯氨酸，2-氧代戊二酸酯4-加雙氧酶(脯氨酸4-羥化酶)a多肽1(P4HA1)，如Genbank號AK222960;或血小板彩亍生生長因子D/DNA損傷誘導蛋白1(PDGFD)，如Genbank號AF336376。在另一個實施方案中，觀'J定LOXLl，IL2RG，LRP5，MPB，TNF，MAN2A2,P4HA1及PDGF多個基因的表達水平。技術人員會理解，盡管在特定的方面對基因表達的比較測定是通過對相同基因在多個時間點進行測定來進行的，還可以在一個時間點測定一種給定的基因，在第二個時間點測定第二種基因，并且比較這些基因的基因表達可以提供診斷信息或監控疾病的發展。在本發明的一個方面，可以在不同的時間點比4交地測定一種或多種基因的基因表達。本文所用的用語"子宮內膜異位癥存在的可能性"指的是技術人員能夠用來預測個體狀況的方法。它不是指100%精確地預測子宮內膜異位癥的能力。相反，技術人員會理解，它指的是子宮內膜異位癥存在或發展的增加了的可能性。例如，當與對照或參考標準如未患有子宮內膜異位癥或不具有易患子宮內膜異位癥體質的個體比較時，在IL2RG高水平表達和/或IL2RG多肽水平提高和/或LOXL1表達水平下降和/或LOXL1多肽水平下降的個體中，子宮內膜異位癥更有可能發生。在本發明的一個方面中，存在子宮內膜異位癥的可能性為約50%的機會、約60%的機會、約75%的機會、約90%的機會和約95%的機會。此處術語"約，，是指±1%。技術人員會理解，將特定的基因與易患子宮內膜異位癥的體質相關聯是一個統計學分析。另外，基因表達和/或肽的水平相對于基線的變化可能反映患者的預后，基因表達的變化程度與不利事件的嚴重程度相關。經常通過比^1兩組或更多組個體并確定p值來確定統計顯著性。優選的p值為0.1，0.05,0.025，0.02，0.01,0.005，0.001及0.0001。在另一個方面，本發明涉及鑒定個體中子宮內膜異位癥的試劑盒。這些試劑盒中包括測量個體樣本中的基因表達和/或測定多肽水平的裝置和試劑以及進行測定和闡釋結果的說明書。這樣的試劑盒優選含有足夠的試劑以進行一次或多次這樣的測定。按照本發明，測定的"靈敏度"為檢驗為陽性的患病個體(患有子宮內膜異位癥的)的百分數("真陽性"的百分數)。測定沒有檢驗出的患病個體為"假陰性"。沒有患病也檢驗為陰性的個體稱為"真陰性"。診斷檢驗的"特異性"為l減去假陽性率，其中"假陽性率"定義為那些沒有患病卻被檢驗為陽性的部分。盡管特定診斷方法不一定提供疾病狀態的確定診斷，但如果該方法提供幫助診斷的陽性指示就足夠了。基因表達的測量才支術人員公知許多檢測和分析本發明的基因表達以及測量多肽水平的方法和設備。術語"基因表達，，指的是特定基因的存在或其含量，所述基因包括但不限于mRNA、cDNA或特定基因的多肽、肽或蛋白表達產物。在本發明的優選方面中，測定L0XL1，IL2RG，LRP5，MPB,TNF,MAN2A2,P4HA1和/或PDGF的基因表達和/或相應多肽的水平。在本發明的一個實施方案中，通過測量RNA水平來測定基因表達。可以使用基于PCR的測定來檢測基因表達。例如，逆轉錄酶PCR(RT-PCR)用于檢測RNA的表達。在RT-PCR中，使用逆轉錄酶將RNA轉變為cDNA。然后該cDNA被用作PCR反應的模板。可以用任何合適的方法檢PCR產物，這些方法包括但不限于凝膠電泳以及使用DNA特異染料染色或與標記的探針雜交。在本發明的另一個方面，可以使用含有竟爭性模板的標準化混合物的定量RT-PCR。在本發明的另一個實施方案中，用雜交測定來檢測基因表達。在雜交測定中，根據樣本中的核酸雜交互補核酸分子的能力確定生物標志物的存在與否，所述互補核酸分子例如寡核苷酸探針。有多種雜交測定可供使用。在本發明的一些實施方案中，通過可視化結合的探針來直接檢測探針和目的序列的雜交，例如通過Northern或Southern測定。在這些測定中，分離DNA(Southern)或RNA(Northem)。然后用一系列在基因組中很少切割且不在任何一個被測定標志物的附近切割的限制酶來切割DNA或RNA。然后分離該DNA或RNA,例如在瓊脂糖凝膠上，并將其轉移到膜上。使諸如通過結合放射性核普酸而被標記的一個或多個探針在低、中和高嚴緊條件下與膜接觸。除去未結合的探針，通過可視化標記的探針來檢測結合的存在。在本發明中，測定LOXLl,IL2RG，LRP5,MPB，TNF，MAN2A2,P4HA1和/或PDGF的基因表達。核酸陣列序列的任何組合，包括血液中的核酸轉錄本種類。本發明的微陣列優選包括介于10、100、500、1000、5000、10,000和15,000個之間的核酸成員，并且更優選地包括至少5000個核酸成員。該核酸成員是已知的或是本文描述的新的核酸序列或是它們的任意組合。本發明的微陣列用于測定健康人與患病者相比，血液樣本中存在的轉錄本RNA表達譜的差異水平。微陣列包括那些包含在個體中表達的轉錄本的陣列。在一個實施方案中，微陣列包含在人中表達的轉錄本。在另一個實施方案中，本發明的微陣列可以是基于cDNA的陣列或基于寡核苷酸的陣列。定量實時RT-PCR在本發明的另一個方面，可以用定量方法測定本發明的一個或多個種類的轉錄本的水平，這些方法包括QRT-PCRJ吏用定量逆轉錄(RT)聯合聚合酶鏈式反應(PCR)PCR來自血液的RNA。來自血液的總RNA或mRNA被用作模板，對本發明基因的轉錄部分特異的引物被用于引發逆轉錄。可以用可商購的軟件(如PrimerDesigner1.0，ScientificSofware等)來完成引物設計。逆轉錄的產物隨后被用作PCR的模板。PCR提供快速擴增特定核酸序列的方法，該方法使用由熱穩定的、DNA依賴的DNA聚合酶催化的DNA復制的多次循環來擴增感興趣的目標序列。PCR要求存在待擴增的核酸、位于待擴增序列兩側的兩條單鏈寡核苷酸引物、DNA聚合酶、脫氧核苷三磷酸鹽、緩沖液以及鹽。PCR方法為本4頁^/>知。如MullisandFaloona,1987，Af"/zoc^五"2^mo/.，155:335中所述進行PCR。使用模板DNA或cDNA(至少fg;更有效地，l-1000ng)以及至少25pmol的寡核苷酸引物進行PCR。典型的反應混合物包括100ng的DNA、25pmol的寡核苷酸引物、2.5pl的10XPCR緩沖液1(Perkin畫Elmer,FosterCity，CA)、0.4的1.25/xMdNTP、0.15pi(或2.5單位)的TaqDNA聚合酶(PerkinElmer,FosterCity，CA)，加去離子水至總體積25/xl。任選用礦物油覆蓋，用可編程的熱循環儀進行PCR。根據有效力的嚴緊性要求調節PCR循環的每一步的時間和溫度以及循環次數。退火溫度及時間由期望的引物退火到模板上的效率及可以容忍的錯配程度來決定。對引物退火條件嚴緊性的優化在本領域普通技術人員的能力范圍內。所用的退火溫度為30。C至72。C。模板分子的初始變性通常在92。C至99°C進行4分鐘，然后進行20-40個循環，每個循環包括變性(94-99。C，15秒至1分鐘)、退火(如上所述確定溫度；1-2分鐘)及延伸(72。C，1分鐘)。通常在72。C進行4分鐘的最終延伸步驟，可以隨后在4°C下進行無限期(0-24小時)步驟。還可以進行性質上定量的QRT-PCR，使用兩步過程的逆轉錄和PCR，或者一步方案的逆轉錄和PCR,使得提供血液中一種或多種RNA轉錄本水平的定量測量。這些技術之一是用轉錄本特異的反義探針來進行的，對于該技術已有可商購的試劑盒，例如Taqman(PerkinElmer,FosterCity,CA)。這種探針對PCR產物(如來自基因的核酸片段)是特異的，它是用淬滅劑和復合在寡核苷酸5'末端的熒光報道探針制備的。在不同的報道物上連接不同的熒光標志物，使得能夠在一個反應中測量兩個產物。TaqDNA聚合酶活化后，依靠其5'至3'核酸外切酶活性來切割掉結合到模板上的探針的熒光報道物。當不存在淬滅劑時報道物發熒光。報道物的顏色變化與每一種特異產物的含量成比例并且可以用熒光計測量；由此測量每種顏色的量并確定PCR產物的量。PCR反應在96孔板上進行，使得可以同時處理和測量源自許多個體的樣本。Taqman系統具有不要求凝膠電泳的額外優點，而且在與標準曲線一起使用時可以做到定量。不用電泳方法定量檢測PCR產物的第二種技術是使用插入染料，例如可商購的QuantiTectTMSYBRGreenPCR(Qiagen，Valencia,CA)。RT-PCR的進行是用在PCR階段結合到PCR產物中的SYBRgreen作為熒光標記，產生與PCR產物的含量成比例的熒光。Taqman和QuantiTectTMSYBR⑧系統都可以用在RNA的逆轉錄之后。另外，已知其它定量測量一種或多種轉錄本的系統，包括分子信標(MolecularBeacons),它利用含有熒光分子和淬滅劑分子的探針，所述探針能夠形成發夾結構，使得在發夾形式時熒光分子被淬滅，而當雜交后熒光增加，給出一種或多種RNA轉錄本的定量測量。按照本發明還可以使用幾種其它的不用電泳檢測PCR產物的技術(例i口參見PCRProtocols,AGuidetoMethodsandApplications(PCR方案方法及應用指南)，Innisetal.,AcademicPress,Inc.N.Y.,(1990))。蛋白表達的測量在本發明的另一個實施方案中，通過測量多肽基因表達產物來測定基因表達。在本發明的優選方面，通過鑒定由LOXL1,IL2RG，LRP5，MPB，TNF,MAN2A2，P4HA1和/或PDGF基因編碼的一種或多種多肽的含量來測量基因表達。本發明不受檢測或測量基因表達的方法的限制。可以用合適的方法檢測由LOXL1，IL2RG，LRP5，MPB，TNF,MAN2A2，P4HA1和/或PDGF基因編碼的蛋白或多肽或肽表達產物。對于樣本中的肽、多肽或蛋白，經常使用免疫測定裝置和方法。這些裝置和方法能夠在各種"夾心"、竟爭性或非竟爭性測定形式中使用標記的分子以產生與目的分析物的存在或含量相關的信號。另外，某些方法和裝置，如生物傳感器和光學免疫測定，可用于測定分析物的存在或含量而不需要標記的分子。通常通過使用特異抗體和檢測特異結合來測定蛋白或多肽或肽的存在或含量。可以使用任何合適的免疫測定，如酶聯免疫測定(ELISA),放射性免疫測定(RIAs)，竟爭結合測定等等。抗體與蛋白或多肽的特異免疫結合能夠被直接或間接地檢測。直接標記包括連接在抗體上的熒光或冷光標簽、金屬、染料、放射性核等。間接標記包括本領域公知的各種酶，如堿性磷酸酯酶、辣根過氧化物酶等等。本發明還考慮使用對蛋白或多肽特異的固定抗體。可以將抗體固定在各種固體載體上，如磁性或色譜基質微粒、測定板的表面(如微量滴定孔)、固體基層材料片(如塑料、尼龍、紙)等等。通過使用抗體或陣列排列的多種抗體包被固體載體能夠制備測定條。可以把測定條浸入試樣中，然后通過洗滌及4企測步驟迅速處理以產生可測量的信號，如有顏色的點。可以分別進行或用一個試樣同時進行對本發明的多個基因和/或多肽的分析。另外，本領域技術人員會認識到測試來自同一個體的多個樣本(例如，在連續的時間點)的價值。這種連續樣本的測試使得能夠確定基因表達和/或多肽水平隨時間的變化。基因表達水平的提高或降低以及基因表達和/或多肽水平的不變能夠提供關于疾病狀態的有用信息，包括但不限于，確定從事件發生開始的大概時間，可回收的樣本的存在及含量，藥物治療的適當性，由癥狀消退顯示的不同療法的有效性，不同類型子宮內膜異位癥的區別，事件嚴重性的鑒定，疾病嚴重性的鑒定以及包括未來事件風險在內的患者結果的鑒定。可以構建含有上述基因的組以提供與子宮內膜異位癥的診斷或預后以及患有子宮內膜異位癥的個體的管理有關的信息。這樣的組可以優選地用LOXL1,IL2RG,LRP5，MPB，TNF,MAN2A2，P4HA1和/或PDGF的序列來構建。本領域技術人員可以單獨分析單一基因或含有更大組基因的基因子集，也可以合并分析單一的多肽或多肽的子集以最優化靈敏度或特異性。也可以用各種物理形式進行基因表達的分析和/或多肽水平的測定。例如可以使用樣i量滴定板或自動控制以幫助以高通量方式處理大量的試樣。在本發明的另一方面中提供陣列，在序列上與基因產物，如cDNAs、mRNAs、cRNAs、多肽及其片段對應的探針能夠在所述陣列的已知位置上特異雜交或結合。在本發明的一個實施方案中，所述陣列是基質，其中每個位置代表一個供產物結合的離散的結合點，所述產物是由LOXLl，IL2RG,LRP5，MPB，TNF，MAN2A2和/或PDGF的基因編碼的。在本發明的另一個方面，"結合點"，以下稱"點"，為特定關聯cDNA能夠特異雜交的核酸或核酸類似物。結合點的核酸或類似物例如可以是合成低聚物、全長cDNA、短于全長的cDNA或基因片段。另一方面，本發明提供用于分析基因表達和/或多肽水平的試劑盒。這樣的試劑盒優選包括用于分析至少一個試樣的裝置和試劑以及進行測定的說明書。試劑盒可任選地包含一種或多種將基因表達和/或多肽的含量轉變成個體中子宮內膜異位癥的診斷或預后的裝置。個體中基因表達的模式與對照或參考標準的比較可以顯示該個體是否患有子宮內膜異位癥。在本發明的一個實施方案中，所述試劑盒包含對LOXLl，IL2RG,LRP5，MPB，TNF，MAN2A2，P4HA1和/或PDGF中至少一種特異的抗體。在其它實施方案中，所述試劑盒包含對檢測核酸特異的試劑，例如寡核香酸探針或引物。在一些實施方案中，所述試劑盒包含進行檢測測定所必需的所有成分，包括所有的對照物以及進行測定和結果分析的說明書。在本發明的一個實施方案中，所述試劑盒包含說明書，其中按照美國食品及藥物管理局(FDA)或國外對等機構對體外診斷測定和/或藥物或食品產品標注的要求包括了關于預期應用的陳述。本發明的另一個方面提供篩選用于治療子宮內膜異位癥的試劑的方法。特別考慮能夠誘導IL2RG的基因表達水平、合成或活性下降和/或誘導LOXLl的基因表達水平、合成或活性提高的試劑。例如，在一個實施方案中，首先用測試試劑治療已知患有子宮內膜異位癥的測試個體，然后分析該個體的典型樣本中基因或序列的表達水平和/或多肽水平，所述的基因或序列的表達響應子宮內膜異位癥而變化。然后將樣本的分析與已知患有子宮內膜異位癥，但沒有給予所述測試化合物的對照組比較以鑒定能夠改變所述基因表達的測試化合物。在本發明的另一個實施方案中，治療可以基于LOXLl,IL2RG,LRP5,MPB,TNF,MAN2A2，P4HA1和/或PDGF的序列。例如試圖降低IL2RG的表達和誘導LOXL1水平的提高。本領域技術人員會了解提高或降低所述基因的表達的方法。補充表達的實例包括向個體提供基因的額外拷貝。降低表達的一個實例包4舌RNA反義4支術或藥物介入。使用DNA樣￡陣列鑒定血液淋巴細胞中子宮內膜異位癥的分子標志物微陣列數據分析如實施例1所述對數據進行分析。如通常在DNA微陣列數據分析中應用的，將認為是過表達的倍數差別設定為22。我們用來自患者和對照組的外周血淋巴細胞總RNA分析了總共15,097個cDNA克隆(14,185個已知的基因和912個表達序列標簽位點)。每個基因的區分兩個組的區別能力用t-統計(我,，見表l)來評價。列出了最能夠區別的上調節及下調節的基因。從與對照組相比，發現在患者中過表達的基因中選出9種權重超過4且平均比率差異大于2.0的做進一步分析(圖1)。這些基因是信號識別顆粒受體B亞基(SRPRB);前膠原-脯氨酸，2-氧代戊二酸酯4-加雙氧酶(脯氨酸4-羥化酶)a多肽1(P4HA1);賴氨酰氧化酶樣1(LOXL1);白介素2受體7(嚴重聯合免疫缺陷)(IL2RG);低密度脂蛋白受體相關蛋白5(LRP5);髓鞘堿性蛋白(MBP);腫瘤壞死因子(TNF超家族，成員2;TNF);甘露糖苷酶，a，2A類，成員2(MAN2A2)及血小板衍生生長因子D/DNA損傷誘導蛋白1(PDGFD)(表l)。與對照組相比，所有9種基因在患者的外周血淋巴細胞中的表達都增加了S2倍。表1:子宮內膜異位癥患者和對照組中基因的微陣列及相對實時RT-PCR分析。<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>a6名患者對5名對照得到的結果。1515名患者對15名對照得到的結果。如實施例1所述確定區別4又重4直。用雙邊不成對t枱、驗確定RT-PCR數據的p值，顯著性設為0.05。用實時RT-PCR確認微陣列數據用相對實時RT-PCR在來自另外的患者(N-15)及對照組(N-15)的血液淋巴細胞中進一步評價了9種最能夠區別的基因的表達。結果總結于表1。實時RT-PCR證明選出的9種基因中的2種有差異表達患者相對于對照組，IL2RG被上調節(6.49倍；p=0.0037),LOXL1被下調節(0.06倍；p=0.0002)(圖2)。雖然RT-PCR顯示LRP5，MBP，TNF,MAN2A2及PDGFD上調節超過2倍，但病例與對照組的基因表達水平之間的差異沒有達到統計顯著。討論近年來致力于尋找生物標志物的研究大大增加(Colbum,W.A.2003/C/iw尸/頻腳/43:329-341;Frank,R.andHargreaves，R.2003Atoi>wg￡fecov2:566-580)。才艮據生物標志物定義工作組(BiomarkersDefinitionWorkingGroup)的定義，生物標志物是"凈皮客，見地測量和評價的特征，指示正常生物學過程、致病過程或對治療干涉的藥理學反應，，(BiomarkersDefinitionsWorkingGroup2001C/z"尸Awmaco/7Tier69:89-95)。然而，潛在的i貪斷生物標志物的數量比那些被看作藥物開發的潛在目標的生物標志物少得多(Levenson,V.V.2004尸/ammcogewo聰'cs5:459-461)。基因表達的全面分析可能加快新的診斷或預后生物標志物的發現，這些生物標志物隨后需要在更大量人群中進行驗證。因此，我們進行本研究是出于這樣的假定對非常容易得到的組織一一外周血淋巴細胞中基因表達模式的表征可能加速可用作子宮內膜異位癥診斷或預后生物標志物的基因的鑒定。與研究子宮內膜異位植入物、子宮內膜異位嚢腫或腹膜液的目的相反，我們假設血液淋巴細胞轉錄本語的微陣列分析能更好地服務于尋找用于所述疾病的非侵入式標志物。這個假設是基于最近的研究顯示在患有和未患有子宮內膜異位癥婦女的血清和腹膜液中各種炎性分子/生長因子的水平顯著不同(Bedaiwy，M.A.etal.2002i/wm17:426-431;Navarro,J,2003OZ^dGy"eco/C7z'"WoW力爿m30:181-192;Iwabe，T,etal.2002G少"eco/(9Zwte/7m^W53Suppl1:19-25)。另外，有足夠的證據證明在子宮內膜異位癥患者與不患病的個體之間存在遺傳差異，且這些差異在血液淋巴細胞中可以很明顯(Taylor,R.N.etal.2002FeW/S&n778:694-698;Nakago,S.etal.2001Mo/〃m附i印ra^7:1079-1083)。最后，大家廣泛接受免疫系統在子宮內膜異位癥中起著重要作用，因此全身免疫應答的分析可以反映局部(即腹膜腔)的免疫應答(Gagne，D.etal.扁3尸e^//80:43-53;Gagne,D.etal.2003尸er"75^〃780:876-885)。到目前為止，在血清或血液淋巴細胞中只檢測到幾種子宮內膜異位癥的可能標志物，主要是細胞因子、生長因子、粘附分子及激素。Bedaiwy及其同事(2002)顯示血清IL-6及腹膜液TNF-a可以被用來區分患有或未患有宮內膜異位癥的個體，其具有很高的靈敏度和特異性(Bedaiwy，M.A.etal.2002i/謂17:426-431;Bedaiwy，M.A.andFalcone,T.2004C7z/附340:41-56)。但腹膜液TNF-a的測量仍然需要侵入式方法，因此不能構成子宮內膜異位癥筒化測試的基礎。Barrier和Sharpe-Timms(2002)凈艮道了患有晚期子宮內膜異位癥的婦女具有更高的血清VCAM-l水平和更低的血清ICAM-1水平(Barrier，B.F.andSharpe-Ti麵s，K.L.2002JSocG^"eco//"ve"g9:98-101)。他們推斷，可溶粘附分子的異常水平不僅幫助解釋子宮內膜異位癥的發病機理，而且還能夠用作判斷該病階段的生物標志物。Pizzo及其同事(2002)顯示患有子宮內膜異位癥的患者具有較高的血清TNF-a、IL-8及MCP-1水平，這些水平隨著病情嚴重性而下降，與之相反，血清TGF-/3水平隨嚴重性而上升(Pizzo,A.etal.2002(少"eco/OfcZC/m^W54:82-87)。另外，與對照組相比，患者中血管內皮生長因子(VEGF)的溶解水平也顯著增加，雖然該觀察不能被其它研究所重復(Matalliotakis,I.M.etal.2004in//附附wwop/iamaco/4:159-160;Gagne,D.etal.2003//w附及印rod18:1674_1680)。其它在子宮內膜異位癥患者的血清中顯著增加的蛋白有促黃體素(LH),Fas配體，可溶性腫瘤壞死因子受體及ICAM-1,雖然后面兩個只在患者月經周期的特定階段顯著升高(Ulera，J.C.etal.2001及epra^/c"on121:761-769;Garcia-Velasco，J.A.etal.2002Fert〃》"778:855-859;Koga,K.etal.2000Afo/6:929誦933;Steff，A.M.etal.2004T/w挑及e;nJ19:172-178)。總而言之，上面所有的研究都沒有能夠鑒定子宮內膜異位癥的非侵入式標志物，這種標志物對于診斷不同病情階段的患者是有用的，且其表達在測試時不依賴于患者的月經周期階段。迄今為止，關于用DNA微陣列技術鑒定基因表達的子宮內膜異位癥特異模式的報導只有5篇(Hughes，T.R.andShoemaker,D.D.2001O^rC^zwCAem所o/5:21-25;Albertson，D.G.andPinkel，D.2003/fwwMo/Gewef12:R145匪52;Eyster,K.M.etal.2002Fer"7Sfe"777:38-42;Arimoto,T.etal.2003/。腳/22:551-560;Lebovic,D.I.etal.2002Fw"7版"78:849-854;Kao,L.C.etal.2003f油cn.wo/ogy144:2870-2881;Matsuzaki,S.etal.2004Mo///w附/印rad10:719-728;Giudice，L.C.etal.2002顛ATv4cW《"955:252-264;Discussion293-295,396-406)。但這些研究中沒有一個特別專注于這樣的事實，即沒有用于這種使人虛弱的疾病的基于血清或血液的特異診斷測試。因此雖然收集了能夠幫助仔細研究涉及子宮內膜異位癥病理生理學的分子機理的重要數據，但這些研究沒有能夠鑒定能夠通過檢測血液或血清而幫助診斷和治療監控的通用特異標記。此外，由于這些研究著眼于疾病的不同亞型(即不育、深部子宮內膜異位癥或卵巢子宮內膜異位癥)，而實際上這些亞型可以用截然不同的基因表達譜來表征，因此報道的數據有分歧，不能^^皮廣泛應用。為了鑒定在血液中子宮內膜異位癥的分子生物標志物，我們比較了從6名患者和5名對照分離的血液淋巴細胞中約15,000個基因/ESTs的基因表達。列出了上調節和下調節的基因，用實施例1中所述的t-統計來評價每個基因區分兩個試驗組的區別能力。在過表達的基因中，我們進一步分析了9種權重超過4.0及組平均倍數改變超過2的基因。它們被分為以下幾組i)與免疫應答有關的蛋白TNF，它是一種促炎性細胞因子，以前顯示其在子宮內膜異位癥患者的腹膜液中以升高的水平存在(Eisermann，J.etal.1988FeW/S&n750:573-579)，以及IL-2R鏈(IL2RG)，也叫做公共^鏈，它是功能性IL-2、IL-4及IL-7受體的重要組分(Nakajima,H.etal.1997￡^185:189-195);ii)與膠原代謝有關的酶脯氨酸-4羥化酶(P4HA1)催化膠原中4-羥基脯氨酸的形成(Annunen,P.etal.1997C/zem272:17342-17348)，以及賴氨酰氧化酶樣1(LOXL1),其調節胞外基質中不溶性膠原的形成(Molnar，J.etal.2003所oc/n'w爿cto1647:220-224);iii)與促進細胞增殖/致瘤有關的基因a-甘露糖苦酶(MAN2A2)是一種處理N-連接聚糖的糖基水解酶，其表達水平與體外惡性行為相關(Misago，M.etal.1995胸/,92:11766-11770;Yue，W.etal.2004/"f/108:189-195);低密度脂蛋白受體5(LRP5)，其作為癌基因Wnt的共同受體而起作用，顯示它能夠正向調節乳腺癌細胞的細胞增殖和侵入(Li，Y.etal.1998/"vawowMetosto^18:240-251);信號識別顆粒B亞基(SRPRB)，其在凋亡細胞和惡性細胞中上調節(Yan，W.etal.2003『orW/Gks&oew&ra/9:1719-1724);以及血小板衍生生長因子D/DNA損傷誘導蛋白l(PDGFD)，其特征是在間葉細胞起源的細胞中有促有絲分裂的作用(Hamada，T.etal.2000i^5S丄e"475:97-102);以及iv)髓鞘堿性蛋白(MBP)，它是髓磷脂鞘的主要蛋白，在中樞神經系統和造血細胞中表達，并且顯示TNF提高其表達(Marty,M.C.etal.2002尸rocAAw/^cad99:8856-8861;Huang，C丄etal.2002A^wmscz'20:289-296)。當用實時RT-PCR分析來自患者和對照組的另外樣本時，顯示IL2RG及LOXLl的相對mRNA表達的差異顯著。IL-2RG或公共y鏈是所有已知T細胞生長因子受體(例如IL-2、IL畫4、IL-7、IL-9、IL-15及IL-21)的一部分(Habib,T.etal.2003J」〃agvC""/附ww"o/112:1033-1045)。這樣，此受體鏈關4建性地涉及調節TW免疫應答發展的信號的產生。眾所周知，子宮內膜異位癥患者顯示提T.etal.2002G戸co//騰W53Suppl1:19-25;Szyllo,K.etal.2003AfeA^OM/"yamw12:131-138;Wu,M.Y,andHo，H.N.2003爿mJi2印rac/mmw"o/49:285-296)。此外，已經顯示患有II期至IV期子宮內膜異位癥的狒狒的外周血中具有升高的IL-2R+細胞水平(D'Hooge，T.M.etal.1996//wma"11:1736-1740)。在子宮內膜異位癥患者中觀察到該基因的表達提高。另一方面，LOXL1被暗示為腫瘤抑制基因，盡管這種作用還沒有被完全闡明(Contente，S.etal.19卯249:796-798;Hamalainen，E.R.etal.1995/S/o/C力em270:21590-21593)。LOXL1涉及TGF-Z3信號轉導途徑，并且已經顯示在頭頸鱗片細胞癌和前列腺癌中下調節(Dairkee，S.H.etal.2004G譜附/cs5:47;Rost，T.etal.2003顛/畫cer23:1565-1573;Ren,C.etal.1998C麵wto58:1285-12卯)。雖然我們不能解釋L0XL1的實時RT-PCR和微陣列數據之間的差異，但該推定的腫瘤抑制基因在用RT-PCR研究的所有子宮內膜異位癥患者中均顯著下調節的事實讓人很感興趣，值得進一步研究。關于微陣列與實時PCR結果在兩個方向及表達水平的差異以前有報導(Orr,W.E.etal.2003Mo/Ps9:482-496;Jenson,S.D.etal.2003Mo/尸函/56:307-312;Ginestier,C.etal.2002為J/WAo/161:1223-1233;Mutch，D.M.etal.Nov2001G，me編2:PREPRINT0009(電子出版)；Goodsaid，F.M.etal.2004五"v/row/fe^A尸er^e"112:456-460)。由于RT-PCR被看作基因表達水平測定的黃金標準(Goodsaid,F.M.etal.2004五wv/raw戶era/ecZ112:456-460)，并且考慮到在用RT-PCR研究的所有患者中LOXL1均顯著降低的事實，后面的結果可能更好地反映了在患者身上發生的事實。對另外樣本的RT-PCR分析能夠確認LRP5、MBP、TNF、MAN2A2及PDGFD的微陣列數據，盡管患者與對照組之間的相對mRNA表達的差異沒有達到統計顯著。這可能是由于個體差異及分析樣本較少。雖然患者中MAN2A2的表達是對照組的12.93倍，但大的標準誤(7.4)可以解釋該差異沒有達到統計顯著的事實。眾所周知，TNF與子宮內膜異位癥的病理生理學有很強的聯系。但已經顯示其表達隨著月經周期的階段而變化(Hunt,J.S.etal.1997/及印toJ/附附m"o/35:87-99)，并且證明其表達在輕微患者中比在嚴重患者中具有更高的水平(Pizzo,A.etal.2002G;;weco//"veW54:82-87)，這能夠解釋該特定基因缺乏顯著性。本研究還顯示，DNA微陣列分析顯示在患者樣本中PDGFD的表達上調節。這個觀察結果與Matsuzaki等人(2004)報道的數據一起支持血小板衍生生長因子系統在此疾病中的關鍵作用他們報道了在深部子宮內膜異位損害中PDGF受體的表達提高，而我們證明了其配體在子宮內膜異位癥患者的血液淋巴細胞中上調節。PDGFD已經被顯示能夠刺激細胞增殖及轉化，并且在血管發生中起作用(Ustach,C.V.etal.2004C維w及es64:1722-1729;Li，H.etal.2003O腳g置22:1501-1510);因此誘導人推測PDGF系統的活化可以幫助促進子宮內膜細胞在異常位置的生長。這是關于子宮內膜異位癥患者的外周血淋巴細胞中差異表達基因的首次報導，可能會為該疾病的發病機理提供重要的線索。我們的分析導致基因的鑒定，考慮對這些基因與疾病的共分離，結構改變或表達i脊進行進一步研究以更好地明確它們作為疾病標志物的用途。在另一個實施方案中，我們提出對基因組合的基因表達水平的分析會提高最小侵入性子宮內膜異位癥檢測方法的特異性和靈敏度。同樣，用微陣列分析和RT-PCR在更大量人群中進行的確認研究被預想為通過候選基因血清蛋白水平的測量和通過子宮內膜異位樣本的高密度組織微陣列分析來補足。可以根據疾病的嚴重程度(如嚴重、中度、輕微、最小)或癥狀(如不育、痛經或二者均有)將本研究中分析的患者分成各種不同的臨床類別；這種分析又可以反映不同的遺傳類型。同樣，考慮諸如月經周期階段、合并感染及當前藥物治療等可能影響淋巴細胞基因表達模式的因素是很重要的(Willis,C.etal.2003//"w18:1173-1178;Dosiou,C.etal.2004/C//w五"docn.wo/M"a689:2501-2504)。由于每一類中患者數目太少，不可能比較這些類之間的差異。因此，基于現有的數據，比較子宮內膜異位癥患者和對照組的表達分析只能檢測所研究的所有患者類別中共同的基因表達差異。這些發現的價值在于一一IL-2RG及LOXLl基因表達的差異顯著，而與疾病亞型、當前藥物治療或患者月經周期階段無關。我們實驗室正在進行的預期研究經特別設計以闡明目的基因的表達模式，即基因表達水平的差異是否根據月經周期階段變化，以及是否能夠將這些差異與臨床表現或疾病特征(如嚴重疾病或輕微疾病；痛經或不育)聯系起來。總之，本研究揭示了新的子宮內膜異位癥的靶遺傳基因座，它們被預想作為開發非侵入的、特異的診斷測定以及這種慢性的、致虛弱的疾病的新療法的基礎。實施例1研究人群通過在整個波多黎各開業的合作婦產科診所推舉來征募研究個體(患者及對照組)。所研究的患者人群包括在手術中被婦產科專家診斷患有子宮內膜異位癥的絕經前婦女，并且包括所有疾病階段的患者嚴重(ll)，中度(6),輕微(3)，最小(l)。用于微陣列的患者樣本(N二6;年齡范圍32-39歲；平均35.5歲)以及用于實時RT-PCR確認的患者樣本(N-15;年齡范圍26-39歲；平均31.2歲)是從我們的核酸庫中隨機選取的。在取得樣本的時候21名患者中的13名(62%)沒有接受任何藥物治療。那些接受藥物治療的患者服用了GnRH激動劑(6)、口服避孕藥(l)及炔睪醇(l)。對照組(N-4對于微陣列；N-15對于RT-PCR)是那些為無關的婦科疾病狀態(如子宮肌瘤，DUB，絕育)而進行腹腔鏡檢查或剖腹手術的婦女，她們經手術證明不患有子宮內膜異位癥。從一位男性志愿者得到的樣本在^t陣列實驗中被包括在對照組中。對照組樣本是完全匿名的，因此與人口統計學信息沒有關聯。用于微陣列和RT-PCR實驗的來自患者和對照組的樣本沒有重疊。在任何實驗之前，研究方案經龐塞醫學院和NHGRI-NIH的IRB委員會評價和批準。所有的參與者在進入本研究之前閱讀和簽署了一份告知同意表。血液樣本在得到書面的告知同意后，由研究護士使用標準的無菌方法通過靜脈穿刺采集血液樣本。進入實驗室后，首先在Histopaque(Sigma,St.Louis,MO)中通過在2000rpm離心40分鐘將淋巴細胞從全血中分離。用TrizolLS并遵循廠商的說明書(Invitrogen,Carlsbad,CA)從淋巴細胞中分離總RNA。用cDNA微陣列進行的表達分析我們用基因選擇程序(見下t)分析了6個患病婦女和5個對照組的血液樣本。所用的陣列有15097個cDNA克隆，用先前描述的方法制備并將它們印刷在玻璃片上(DeRisi,J.etal.19967Va,Ge"e《14:457-460;Shalon,D.etal.1996Gew,e7^s6:639-645;Mousses,S.etal.inGeneexpressionanalysisbycDNAmicroarravs(通過cDNA孩吏陣列的基因表達分4斤)，inFunctionalGenomics(功能基因組),F丄LiveseyandS.P.Hunt(Eds.),2000,OxfordUniversityPress,Oxford,pp.113-137)。在這些克隆中，912個是表達序列標簽，其余14,185個克隆是已知的基因。按先前所述的方法進4亍雜交和雜交后的、洗、漆(Mousses，S,etal.inGeneexpressionanalysisbycDNAmicroarrays(通過cDNA孩史陣列的基因表達分析)，inFunctionalGenomics(功能基因組),F.J.LiveseyandS.P.Hunt(Eds.),2000,OxfordUniversityPress,Oxford,pp.113-137;Monni，O.etal.2001/Voc扁Jcad《"固98:5711-5716;Pollack,J.R.etal.2002尸tociVw/99:12963-12968)。簡單地說，通過使用Superscript逆轉錄酶(Invitrogen,Carlsbad,CA)的逆轉錄分別用Cy3畫dUTP或Cy5-dUTP(Amersham-Pharmacia，Piscataway，NJ)標記約15至20jLig的來自個體的血液淋巴細胞總RNA和等量的標準參照物(UniversalHumanReferenceRNA，Stratagene，LaJolla，CA)。標記的探針經過堿氷解，純化，用Microcon30(Millipore，Billerica，CA)濃縮。在密封的增濕的腔中，在65。C下在水溶液中進行雜交過夜(16-24hr)。cDNA微陣列數據的統計學分析為了鑒定在兩組(患有和未患有子宮內膜異位癥)中顯著差異表達的基因，使用先前描述的基因選擇程序(arrayanalysis.nih.gov)(Bittner，M.etal.2000Mm/re406:536-540;Hedenfalk,I.etal.2001W五"g//344:539-548)。首先通過測量質量評價過濾基因表達數據，并且計算t-統計作為區別權重值。除去那些不含有有意義生物信息和多余的數據后，我們列出了最能區別的基因(即那些權重超過4.0，組平均倍數改變(兩組之間的平均比率差異)超過2.0的基因)。首先將基因表達比率進行對數轉換，然后根據它們相對于所有實驗的平均表達水平的標準偏差(ff)用顏色編碼，過表達用紅色(深灰)表示，低表達用綠色(淺綠)表示(圖1)。用實時RT-PCR確認基因表達數據為了確認用DNA微陣列得到的基因表達數據，我們用來自另外的患者(N=15)和女性對照N=15)的外周血淋巴細胞的總RNA進行了相對實時RT-PCR。所有的實驗都重復3次。簡而言之，用TrizolLS試劑(Invitrogen，Carlsbad,CA)從外周血淋巴細胞中分離總RNA。為除去污染DNA,用DNAseI(DNA-free，Ambion,Austin,TX)處理樣本。在PTC-200熱循環儀(MJResearch,Waltham，MA)上按照廠商說明書用iScriptcDNA合成試劑盒(Bio-Rad，Hercules，CA)進行逆轉錄。cDNA合成之后，用iQSYBRGreenSuperMix試劑盒按照廠商的推薦(Bio-Rad，Hercules,CA)用特異寡聚引物對進行PCR反應。PCR擴增程序如下94。C/4分鐘，然后是50個循環的94。C/30秒變性，基因特異退火溫度/30秒和72。C/40秒延伸。在每次實驗后產生熔解曲線以檢驗引物的特異性。用iCycleriQ光學系統軟件3.0a版(Bio-Rad,Hercules,CA)進行PCR擴增的實時分析。從公共數據庫得到特異寡聚引物對并在新澤西醫學院的分子資源設施(MolecularResourceFacility)處合成。在相對管家基因GAPDH(Livak，K丄200125:402-408)進行標準化之后計算了每個樣本的相對表達水平。用不成對雙邊t檢驗進行統計學分析以比較患者和對照組的相對mRNA表達水平(GraphPadInStat3)。將統計學顯著定義為；？值<0.05。實施例2我們完成了來自另外14名患者的數據分析。我們包括了原始數據(組l)的散點圖以更好地代表這些標志物的個體變化(圖3)。重要的，散點圖顯示LOXL1的低表達水平出現在迄今為止測試的所有患者中。同樣，我們包括了另一亞組14名患者的另外的數據(組2)，這些數據確認了最初的發現。下面的圖給出所研究的第二組患者的結果總結。圖4包括顯示組2中每個基因的個體變化的散點圖。圖5表示組1(上圖)和組2(下圖)患者的平均倍數表達結果，而圖6顯示兩組結果的比較。圖7將迄今為止測試的39名患者的數據作圖。盡管為了清楚和理解的目的對本發明進行了某些具體的描述，本領域技術人員會理解，可以在不背離本發明的實際范圍的情況下作出形式及細節上的各種改變。據此以參考的形式包括所有的圖、表和附件以及上述的專利、申請及出版物。權利要求1.在女性個體中鑒定或預測易患子宮內膜異位癥體質的方法，所述方法包括(a)測定個體的外周血白細胞或外周血才羊本中外周血白細月包的至少一種差異表達的基因的基因表達水平以提供第一值；(b)測定對照或參考標準中所述白細胞的所述至少一種差異表達的基因的基因表達水平以提供第二值；以及(c)比較所述第一值與第二值是否有差異。2.權利要求l所述的方法，其中從沒有患有子宮內膜異位癥的個體或一組個體中確定所述對照或參考標準。3.權利要求l或2所述的方法，其中所述第一值高于第二值指示子宮內膜異位癥的存在或預測。4.權利要求1或2所述的方法，其中所述第一值低于第二值指示子宮內膜異位癥的存在或預測。5.權利要求1-4中任一個權利要求所述的方法，其中對子宮內膜異位癥存在的預測有至少50%的概率。6.權利要求1-5中任一個權利要求所述的方法，其中所述第一值比第二值高或低至少20%。7.權利要求1-6中任一個權利要求所述的方法，其中所述基因表達水平的測定包括測量所述基因的轉錄的多核苦酸的基因表達。8.權利要求7所述的方法，其中所述轉錄的多核苷酸是mRNA或cDNA。9.權利要求7或8所述的方法，其中通過樣支陣列分析、Northern印跡分析、逆轉錄PCR或RT-PCR檢測所述表達水平。10.權利要求1-9中任一個權利要求所述的方法，其中測定選自L0XL1、IL2RG、LRP5、MPB、TNF、MAN2A2、P4HA1和PDGF的成員的基因表達水平。11.在女性個體中鑒定或預測易患子宮內膜異位癥體質的方法，所述方法包括(a)測定個體的外周血白細月包或外周血樣本中外周血白細胞的至少一種差異表達的蛋白或肽的水平以提供第一值；(b)測定對照或參考標準中所述白細胞中所述至少一種差異表達的蛋白或肽的水平以提供第二值；以及(c)比較所述第一值與第二值是否有差異。12.權利要求11所述的方法，宮內膜異位癥的存在或預測。13.權利要求11所述的方法，宮內膜異位癥的存在或預測。14.權利要求1所述的方法，測量蛋白表達產物。其中所述第一值高于第二值指示子其中所述第一值低于第二值指示子其中所述基因表達水平的測定包括15.權利要求ll所述的方法，其中用特異結合所述蛋白的抗體、抗體衍生物或抗體片段來檢測所述蛋白或肽的含量。16.對確定患有子宮內膜異位癥的個體在治療前后進行監控的方法，所述方法包括(a)在治療前測定所述個體的外周血白細胞或外周血樣本中外周血白細胞的至少一種差異表達的基因的基因表達水平以提供第一值；(b)在治療后測定所述白細胞的所述至少一種差異表達的基因的基因表達水平以提供第二值；以及(c)比較所述個體治療前和治療后的基因表達水平的差異。17.篩選用于治療子宮內膜異位癥的候選試劑的方法，所述方法包括(a)使能夠表達至少一種差異表達基因的細胞離體與候選試劑接觸；(b)測定所述細胞中所述的至少一種差異表達基因的基因表達水平以提供第一值；(c)測定沒有候選試劑存在時細胞中相同的至少一種差異表達基因的基因表達水平以提供第二值；以及(d)比較所述第一值與第二值，其中基因表達水平的差異指示試劑潛在能夠被用于治療子宮內膜異位癥。18.治療或預防子宮內膜異位癥的方法，包括給予個體有效量的試劑，所述試劑能夠誘導至少一種差異表達的基因或基因表達產物的基因表達、合成或活性水平升高或降低。19.生產用于治療或預防子宮內膜異位癥的藥物的方法，所述藥物包括有效量的試劑，所述試劑能夠誘導至少一種差異表達的基因或基因表達產物的基因表達、合成或活性水平升高或降低。20.鑒定或預測女性個體中易患子宮內膜異位癥體質的試劑盒，所述試劑盒包括用于以下目的的裝置(a)測定個體的外周血白細胞或外周血樣本中外周血白細胞的至少一種差異表達基因的基因表達水平以提供第一值；(b)測定對照或參考標準中所述白細胞的所述至少一種差異表達基因的基因表達水平以提供第二值；以及(c)比較所述第一值與第二值是否有差異。全文摘要本發明包括在女性個體中鑒定或預測易患子宮內膜異位癥體質的方法，包括測定個體的外周血白細胞或外周血樣本中外周血白細胞的至少一種差異表達的基因或蛋白或肽的基因表達水平以提供第一值，測定對照或參考標準中所述白細胞的至少一種差異表達的基因或蛋白或肽的基因表達水平以提供第二值，比較所述第一值與第二值是否有差異。文檔編號C12Q1/68GK101124340SQ200580048449公開日2008年2月13日申請日期2005年12月9日優先權日2005年2月18日發明者伊達哈里茲·弗洛里斯,埃斯特爾·羅森布盧姆,斯皮羅·莫薩斯申請人:美國政府健康及人類服務部;龐塞醫學院