專利名稱：含有VEGFR的Truncated Soluble cDNA的重組腺相關病毒及含有上述成份的基因治療劑的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種利用VEGF受體蛋白質(VEGFR)的truncated solublecDNA和利用腺相關病毒(AAV)系統的基因治療劑，尤其是一種包括含有VEGFR的truncated solublec DNA的rAAV載體及含有上述載體和VEGF-A反義(antisense)cDNA的rAAV載體的大腸癌、膀胱癌及/或肺癌特異性基因治療劑。
背景技術：
不管在國內外，癌癥死亡率呈逐年增加的趨勢。在全世界，癌癥與感染性疾病及心血管疾病成為人類死亡的主要原因。根據世界衛生組織(WHO)的世界健康報告(World Health Report)，在2004年，占總死亡人數的12.5％的7,121,00人死于癌癥。而且因為飲食習慣，環境的變化及壽命的延長，預計在今后的25年內，致癌人數將以每年3千萬的速度增加，而其中的2千萬將死于癌癥。
當前，用于癌癥治療的方法大致分為外科手術、放射線治療及藥物治療，而在治療癌癥的過程中，采用一種或一種以上的治療方法。通常，外科手術適用于癌癥的各個階段。初期階段的癌癥一般都可以采用外科手術的方法進行治療，但如果癌癥惡化或發生轉移，則很難用單純的外科手術進行治療，因此并用放射線治療或藥物治療。放射線治療是利用從外部照射的放射線或射入到體內的放射性物質所產生的X-線或γ-線照射癌細胞，由此對癌癥進行治療。藥物治療是通過口服或注射的方式將抗癌劑注入體內，從而破壞或抑制癌細胞增殖所需的DNA或相關的酶的方法。比起其它的方法，藥物治療的優點是藥物可以針對人體任何部位的癌癥，而且能夠對發生轉移的癌癥進行治療。因此，現在藥物治療是轉移性癌癥治療的主要方法。當然，轉移的癌癥不能單靠藥物治療痊愈，但可以起到緩解癥狀并延長壽命的重要作用。但是，成為藥物療法的主流的化學治療劑存在副作用較多，抗癌劑耐性強等問題。
但是，隨著生命科學的領域的快速發展，生物治療劑得到了長足的發展。生物治療劑通過恢復或增強人體自身的免疫功能來削弱癌細胞的活動能力并遏制癌癥的惡化。如果人體的免疫系統正常發揮作用，則可以有效地殺滅癌細胞，反之，則癌細胞容易增殖或受到其它病原菌的攻擊。為了彌補上述缺點，生物治療劑還可配合手術療法、放射線療法及化學治療劑等其他治療方法。
當前，最受生命科學領域關注的生物治療劑是反義抗癌劑及血管生成抑制劑。反義抗癌劑利用能夠與癌細胞的特異性mRNA互補結合的DNA片斷，阻礙mRNA的處理(processing)或蛋白質的表達(expression)，從而促使癌細胞死亡。因為得益于人類基因組計劃的發展，可讀出30,000多個基因的序列，而且掌握了100,000個mRNA的序列。因此也掌握了大量與癌細胞相關的mRNA候補群的信息，從而篩選出針對信息傳遞體系相關的基因和細胞死亡(apoptosis)及細胞增殖相關的基因的反義抗癌劑進行臨床實驗。
腫瘤的生長需要生成(angiogenesis)新的血管供應所需氧氣及營養。一般而言，隨著癌細胞的增殖腫瘤的內部將處于低氧狀態，從而導致組織的壞死。另外，因為腫瘤自身的壓力破壞血管，使上述低氧狀態惡化。為了克服上述低氧狀態，腫瘤將表達與新血管生成相關的因子(VEGF、bFGF、IL-8、PDGF及PD-EGF等)并由此促進新血管的生成。即，對于腫瘤的生長，新血管的生成是必需的過程。
新血管生成抑制劑通過阻礙上述腫瘤的新血管生成，抑制腫瘤的生長，從而達到治癌的目的。直接的新血管生成抑制劑阻礙血管內皮細胞的增殖及移動或抑制對新血管生成因子的反應，從而抑制新血管的生成。直接的新血管生成抑制劑具有較少誘發獲得性抗藥性(acquired drugresistance)的優點。間接的新血管生成抑制劑抑制活化新血管生成的腫瘤內的蛋白的表達，從而阻斷上述腫瘤蛋白與血管內皮細胞表面受體之間的結合，從而抑制新血管的生成。
如上所述，從治療方面的變化來看，是從利用人工合成的化學物質變化為利用人體內天然物質的方向發展。尤其是，通過對各種領域的基因研究，發現了成為各種疾病的病因的基因。為了將上述研究結果聯系到臨床治療或預防，將可以矯正功能消失或變形的基因導入體內，從而恢復正常的基因功能或活化治療功能的基因傳遞技術的研究，即對基因治療(gene therapy)領域的研究活動展開得相當活躍。在上述基因治療領域，隨著近年來的關注和研究，其研究結果也陸續顯現。
基因療法是通過基因傳遞及表達治療疾病的方法，與藥物療法不同，它是針對有缺陷的特定基因矯正基因性缺陷的療法。基因治療的最終目標是對存活的細胞進行基因性變形，從而取得有益的治療效果。上述療法因為能夠準確地將基因傳遞至患病部位，能夠在人體內完全分解，沒有毒性及免疫抗原性及基因能夠長時間穩定表達等優點，對于治療疾病而言是無可厚非的最佳療法。
基因治療的主要研究領域包括導入對特定的疾病具有治療效果的基因，為了對抗癌劑等表現抵抗性而增強正常細胞的抵抗功能或替代因各種基因性疾病而變形或消失的基因等。
基因療法大致分為體內(in vivo)和體外(in vitro)兩種。in vivo基因療法是將治療基因直接注入到體內的方法，而in vitro基因療法是首先在試管內培養目標細胞(target cell)并在上述細胞內導入基因之后，將基因變形的細胞重新注入體內的方法。在現有的基因療法中，相比invivo基因療法，in vitro基因療法的使用更普遍。
基因傳遞技術大致可分為將病毒作為載體的方法(viral vector-basedtransfer method)、利用合成磷脂或合成陽離子高分子的非病毒性方法(non-viral delivery method)以及通過對細胞膜進行瞬間的電刺激導入基因的電穿孔(electroporation)方法等物理性方法。
在上述基因傳遞技術中，利用病毒載體的方法因為可利用帶有被治療基因代替的基因的部分或整體復制能力缺損的載體有效傳遞基因，所以是基因治療的首選方法。可用作病毒載體的病毒主要有RNA病毒載體(逆轉錄病毒載體及慢病毒載體等)和DNA病毒載體(腺病毒載體及腺相關病毒載體等)，此外還有單純皰疹病毒載體(herpes simplex viralvector)和Alpha病毒載體(alpha viral vector)。其中，廣泛用于研究的是逆轉錄病毒和腺病毒。
對宿主細胞的基因組具有整合功能的逆轉錄病毒(Retrovirus)的特征為雖然對人體無害，但在進行整合時抑制正常細胞的功能，能夠被各種細胞感染，容易增殖，能夠收容1～7kb左右的外部基因及具有生成復制缺陷型病毒的能力。但是，同時還具有難以被有絲分裂之后的細胞感染，in vivo狀態下基因傳遞難以進行基因傳遞以及體細胞組織始終需要在in vitro環境中進行增殖等缺點。另外，因為逆轉錄病毒能夠被原癌基因(proto-oncogene)整合，因此存在基因突變的危險，而且也能使細胞壞死。
另外，腺病毒(Adenovirus)作為克隆載體(cloning vector)具有各種優點，如能夠在一般大小的細胞核內進行復制，臨床上無毒性，插入外部基因之后狀態穩定，不會發生基因的重新排序或損失現象，能夠轉化(transformation)真核生物，即使被宿主細胞的染色體整合其狀態較穩定，而且完成高水平的表達。腺病毒的好的宿主細胞是人類的造血、淋巴及骨髓的成因。但因為是線狀DNA，因此難以增殖，難以恢復被感染的病毒及病毒感染率低。另外，所傳遞的基因的表達在1～2周后最多，而在部分細胞中只能維持3～4周的表達時間。另外，最大的問題是具有較高的免疫抗原性。
腺相關病毒(Adeno-associated virus，AAV)不僅能夠彌補上述問題，而且還具有許多其他的優點，因此最近較為廣泛使用。AAV為一株前病毒(Provirus)，因此復制時需要輔助病毒，而且AAV基因組(genome)為4,680bp，因此可插入于感染細胞染色體19號特定部位。轉基因(trans-gene)可插入于通過各145bp的兩個反向末端重復(invertedterminal repeat，ITR)序列部分和信號序列(signal sequence)部分相連的質粒DNA(plasmid DNA)。與表達AAV rep部分和cap部分的其他質粒DNA一起進行轉染(transfection)，而腺病毒作為輔助病毒添加。AAV具有傳遞基因的宿主細胞的范圍較廣，反復注入時免疫副作用少，基因表達時間長等優點。尤其是，即使AAV基因組被宿主細胞的染色體整合也較安全，不會改變或重新排列宿主的基因表達。
1994年，含有CFTR基因的AAV載體在囊腫性纖維化(cysticfibrosis)的治療方面得到NIH的認可之后，廣泛用于各種疾病的臨床治療上。包含作為血凝因子的因子IX基因(factor IX gene)的AAV載體用于B型血友病(hemophilia B)的治療，而且正在進行利用AAV載體的A型血友病(hemophilia A)的治療劑的開發。另外，含有各種抗癌基因的AAV載體可用作腫瘤的疫苗。
作為利用VEGF的基因治療法的一例，有為了治療肺循環高壓而包含能夠對血管成形因子加密的核酸的重組缺損腺病毒(大韓民國申請專利10-2001-7013633)，但上述療法因為使用了VEGF鹽基序列，因此只能用在缺血性疾病的治療，而不能用在新血管生成疾病，尤其是癌的治療上。而且，腺病毒因為具有較高的免疫抗原性，對宿主細胞的感染性低及表達時間短的缺點，因此不適合用在治療上。
用在癌癥治療的多肽的研究已進行了很多，但上述大部分物質屬于化學治療劑。另外，雖然對多聚核苷酸的研究也仍在繼續，但在關于通過病毒載體有效地移動到體內的方法的研究上沒有大的突破。
另外，本發明的發明小組研究表明含有VEGF-A的反義cDNA的rAAV-AShVEGF-A載體(KR10-2004-54043)、VEGF-A、VEGF-B及含有VEGF-C的反義cDNA的rAAV-AShVEGF-ABC載體(PCT/KR2005/002435)為有效的基因治療劑并對其申請了專利。與此同時，也對包括含有VEGF-A的反義cDNA的rAAV-AShVEGF-A載體、含有VEGFR-1 truncated soluble cDNA的rAAV-TShVEGFR-1載體及VEGFR-2 truncated soluble cDNA的rAAV-TShVEGFR-2載體的癌癥基因治療劑也申請過專利(KR 10-2005-67661)。
為了開發出更有效的癌癥基因治療劑，本發明的發明小組經過不斷的努力和探索，制作出在抗癌效果較好的rAAV載體插入VEGFRtruncated soluble cDNA的rAAV-TShVEGFR-1及rAAV-TShVEGFR-2，并確認包括含有上述rAAV-hVEFGR-1和rAAV-hVEFGR-2及VEGF-A反義cDNA的rAAV載體的基因治療劑在in vivo上具有出色的腫瘤抑制效果，從而完成了本發明。
發明內容
本發明涉及一種含有VEGFR-1 truncated soluble cDNA的rAAV載體及含有VEGFR-2 truncated soluble cDNA的rAAV載體。
本發明還涉及一種包括含有上述VEGFR-1 truncated soluble cDNA的rAAV載體、含有VEGFR-2 truncated soluble cDNA的rAAV載體及含有VEGF-A反義cDNA的rAAV載體的大腸癌、膀胱癌及/或肺癌特異性基因治療劑。
對本發明的其他特點及實施例，將通過下述詳細說明及所附權利要求書進行更詳細的說明。
附圖簡單說明
圖1為rAAV-AShVEGF-A載體的粒子滴定標準曲線；圖2為rAAV-AShVEGF-A-IRES-EGFP載體的粒子滴定標準曲線；圖3為rAAV-TShVEGFR-1-GFP載體的粒子滴定標準曲線；圖4為rAAV-TShVEGFR-2-GFP載體的粒子滴定標準曲線；圖5為rAAV-IRES-EGFP載體的粒子滴定標準曲線；圖6為rAAV-EGFP載體的粒子滴定標準曲線；圖7為測定rAAV-AShVEGF-A的轉導效率的共焦顯微鏡照片；圖8為測定rAAV-TShVEGFR-1的轉導效率的共焦顯微鏡照片；圖9為測定rAAV-TShVEGFR-2的轉導效率的共焦顯微鏡照片；圖10為測定rAAV-IRES-GFP的轉導效率的共焦顯微鏡照片；圖11為顯示各癌細胞株中rAAV-AShVEGF-A載體的VEGF量減少效果的示意圖；圖12為顯示注射本發明的rAAV載體的腫瘤tumor模型裸小鼠身上腫瘤體積變化示意圖。
發明的詳細說明及優選實施例本發明涉及一種通過(a)將含有SEQ ID NO4的VEGFR-1的truncated soluble cDNA的pAAV載體、AAV rep-cap質粒DNA及腺病毒輔助質粒轉染至動物細胞株的步驟；(b)培養上述被轉染的動物細胞株的步驟；及(c)破碎經培養的上述細胞株并分離提純重組rAAV粒子的步驟制作而成，并含有SEQ ID NO4的VEGFR-1的truncated solublecDNA的rAAV載體。
另外，本發明還涉及一種通過(a)將含有SEQ ID NO9的VEGFR-2的truncated soluble cDNA的pAAV載體、AAV rep-cap質粒DNA及腺病毒輔助質粒轉染至動物細胞株的步驟；(b)培養上述被轉染的動物細胞株的步驟；及(c)破碎經培養的上述細胞株并分離提純重組rAAV粒子的步驟制作而成，并含有SEQ ID NO9的VEGFR-2的truncated solublecDNA的rAAV載體。
在本發明中，當注入上述含有VEGFR-1的truncated soluble cDNA的rAAV載體、含有VEGFR-2的truncated soluble cDNA的rAAV載體及含有VEGF-A反義cDNA的rAAV載體之后，進行in vivo實驗的結果，腫瘤的體積明顯減少。
因此，本發明還涉及一種包括上述含有VEGFR-1的truncated solublecDNA的rAAV載體、含有VEGFR-2的truncated soluble cDNA的rAAV載體及含有SEQ ID NO1的VEGF-A反義cDNA的rAAV載體的大腸癌、膀胱癌及/或肺癌特異性基因治療劑。
實施例下面，將對本發明的具體實施例進行說明，但一下實施例僅用以說明本發明而非限制，本領域的普通技術人員應當理解，可以對本發明進行修改、變形或者等同替換，而不脫離本發明的精神和范圍。
實施例1含有抑制新生血管功能的基因的pAAV質粒克隆根據克隆方法為了利用pAAV-FIX cis plasmid DNA(US 6,093，292)向反義方向把VEGF-A(NCBI accession#NM_003376 for human)cDNA插入于pAAV-FIX cis plasmid DNA，用VEGF-A isoform的反義cDNA替代包含于pAAV-FIX cis plasmid DNA中的factor IX cDNA基因，從而制作pAAV-AShVEGF-A的trans-gene constructs。另外，制作VEGF-Aisoform反義cDNA連接于IRES-EGFP的pAAV-AShVEGF-A-IRES-EGFP的trans-gene constructs。
作為與VEGF的三種isoform作用的受體的VEGFR-1(Flt-1；NCBIaccession#NM_002019 for human)和VEGFR-2(Kdr/Flk-1；NCBIaccession#AF06365 8 for human)的truncated soluble cDNA也用相同的方法插入或替代，從而制作pAAV-TShVEGFR-1及pAAV-TShVEGFR-2的trans-gene constructs。與此同時，在VEGF受體蛋白質cDNA中附加(tagging)GFP而制作pAAV-TShVEGFR-1-GFP及pAAV-TShVEGFR-2-GFP的兩種trans-gene constructs，而且為了確認以上六種質粒而利用測序(sequencing)方法進行詳細分析。trans-gene始終插入于通過各145bp的兩個末端反向重復序列部分(ITR)和humancytomegalovirus(CMV)immediate early promoter，SV40 early mRNApolyadenylation signal序列部分相連的質粒DNA中。
(1)pAAV-AShVEGF-A的制作從HUVEC(Cambrex Bio Science Walkersville，Inc.，USA)細胞提取RNA來合成cDNA，而且利用下述AShVEGF-A primer通過RT-PCR方法對429bp的人類VEGF-A isoform反義cDNA(SEQ ID NO1)進行擴增。將擴增片斷利用限制酶KpnI及XhoI進行處理之后，與用相同的限制酶切斷的pAAV-FIX cis質粒DNA進行連接(ligation)，從而制作pAAV-AShVEGF-A。
AShVEGF-A F2(SEQ ID NO2)GGGGTACCGTCTTGCTCTATCTTTCKpnI
AShVEGF-A R1(SEQ ID NO3)CCCTCGAGGGCCTCCGAAACCATGAACTXhoI(2)pAAV-AShVEGF-A-IRES-EGFP的制作將pEGFP-N1質粒DNA(Clontech，USA)利用限制酶KpnI及NotI進行處理，從而準備linearized insert之后，將上述pAAV-FIX cis plasmidDNA用限制酶KpnI及NotI進行處理并與上述insert進行連接，從而制作pAAV-EGFP。
將pIRES2-EGFP質粒DNA(Clontech，USA)利用限制酶NheI進行處理，用Klenow片斷blunt之后，利用限制酶NotI進行處理，準備linearized insert，而后將上述pAAV-EGFP質粒DNA用限制酶KpnI進行處理并利用T4 DNA聚合酶blunt之后，與利用限制酶NotI進行處理的linearized載體進行連接，從而制作出pAAV-IRES-EGFP。
將上述pAAV-IRES-EGFP質粒利用限制酶BamHI進行處理并將上述所制作的pAAV-AShVEGF-A質粒DNA利用限制酶BamHI進行處理，從而連接上述兩個DNA片斷而制作出pAAV-AShVEGF-A-IRES-EGFP。
(3)pAAV-TShVEGFR-1的制作從癌細胞株LCSC#1細胞(WO 02/061069)提取RNA而合成cDNA，并利用下述TShVEGFR-1 F1及TShVEGFR-1 R3 primer通過RT-PCR方法對1968bp的truncated soluble human VEGFR-1受體cDNA(SEQ IDNO4)進行擴增。將擴增片斷利用限制酶KpnI及XhoI進行處理之后，與用相同的限制酶切斷的pAAV-FIX cis質粒DNA進行連接，從而制作出pAAV-TShVEGFR-1。
TShVEGFR-1 F1(SEQ ID NO5)AAGGTACCGCCACCATGGTCAGCTACTGGGACAKpn I KozakTShVEGFR-1 R3(SEQ ID NO6)CGCTCGAGCTATCTGATTGTAATTTCTTTCTTCTGXho I stop codon(4)pAAV-TShVEGFR-1-GFP construct的克隆從癌細胞株LCSC#1細胞提取RNA而合成cDNA，并利用上述TShVEGFR-1 F1及下述TShVEGFR-1 R1 primer通過RT-PCR方法對1969bp的truncated soluble human VEGFR-1受體cDNA(SEQ ID NO7)進行擴增。將擴增片斷利用限制酶KpnI及ApaI進行處理之后，與用相同的限制酶切斷的pAAV-EGFP質粒進行連接，從而制作出在truncatedsoluble VEGFR-1 cDNA上標記有GFP標記蛋白的pAAV-TShVEGFR-1-GFP。
TShVEGFR-1 R1(SEQ ID NO8)CCGGGCCCCTCTGATTGTAATTTCTTTCTTCTGApa I(5)pAAV-TShVEGFR-2的制作從癌細胞株LCSC#1細胞提取RNA而合成cDNA，并利用下述TShVEGFR-2 F1及TShVEGFR-2 R2引物(primer)通過RT-PCR方法對2402bp的truncated soluble human VEGFR-2受體cDNA(SEQ ID NO9)進行擴增。將擴增片斷利用限制酶KpnI及XhoI進行處理之后，與用相同限制酶切斷的pAAV-FIX cis質粒DNA進行連接，從而制作出pAAV-TShVEGFR-2。
TShVEGFR-2 F1(SEQ ID NO10)GGGGTACCGCCACCATGGAGAGCAAGGTGCTKpn I KozakTShVEGFR-2 R2(SEQ ID NO11)CGCTCGAGTTAGCCTGTCTTCAGTTCCCCTCCATTXho I stop codon(6)pAAV-TShVEGFR-2-GFP construct的克隆從細胞株LCSC#1細胞提取RNA而合成cDNA，并利用上述TShVEGFR-2 F1及下述TShVEGFR-2 R1 primer通過RT-PCR方法對2397bp的truncated soluble human VEGFR-2受體cDNA(SEQ ID NO12)進行擴增。將擴增片斷用限制酶KpnI及ApaI進行處理之后，與用相同限制酶切斷的pAAV-EGFP質粒進行連接，從而制作出在truncated solubleVEGFR-1 cDNA上標記有GFP標記蛋白的pAAV-TShVEGFR-2-GFP。
TShVEGFR-2 R1(SEQ ID NO13)CCGGGCCCGTGTCTTCAGTTCCCCTCCAApa I實施例2制作抑制新生血管基因治療劑的rAAV載體為了制作用于基因治療的重組AAV(rAAV)載體，除了實施例1中所制作的各pAAV質粒DNA之外，還需要表達AAV rep部分和cap部分的AAV rep-cap質粒DNA(pAAV-RC質粒，Stratagene Co.，USA)和腺病毒輔助質粒(pHelper質粒，Stratagene Co.，USA)。將上述三種質粒DNA全部轉染至HEK293(human embryonic kidney 293；ATCCCRL-1573)細胞并培養96小時之后，搜集HEK293細胞并進行超聲波破碎，對重組AAV(rAAV)particle重復三次CsCl密度梯度離心分離，而后搜集RI(Refractive Index)為1.37～1.41 g/ml的部分進行提純分離。
上述經分離的rAAV particles的滴定(titration)方法如下制作CMV啟動區(promoter)部位的PCR primer[CMV F1(SEQ ID NO14)5′-GGGCGT GGA TAG CGG TTT GAC TC-3′及CMV R1(SEQ ID NO15)5′-CGG GGC GGG GTT ATT ACG ACA TT-3′]并通過定量(Quantitative)PCR方法進行滴定。此時，將已知濃度的各pAAV質粒DNA用作標準物質，而且可以確認通過上述方法分離產生的重組rAAV載體通常含有1012～1013viral particles/ml的rAAV particle titer。
下面，說明各rAAV的粒子滴定結果。
(1)rAAV-AShVEGF-A的粒子滴定連續稀釋利用分光光度計測定濃度的pAAV-AShVEGF-A DNA并完成標準曲線PCR之后，將不同濃度的電泳結果顯示在圖1a的左側面板。從左開始依次顯示104～108分子數的試料，而各條的經擴增的DNA帶的強度利用Imager densitometer(Alpha Innotech，USA)來測定。
連續稀釋上述提純分離的rAAV-AShVEGF-A載體并完成粒子滴定PCR之后，將不同濃度的電泳結果顯示在圖1a的右側面板。從左依次顯示10-3～100稀釋倍數的試料，而各條的經擴增的DNA帶的強度利用Imager densitometer來測定。
用上述標準曲線用PRC結果做出右側面板上的標準曲線，而將上述粒子滴定用PCR結果適用于標準曲線而得出5×1011viral particles/ml的滴定量(titer)(圖1b)。
(2)rAAV-AShVEGF-A-IRES-EGFP的粒子滴定連續稀釋利用分光光度計測定濃度的pAAV-AShVEGF-A-IRES-EGFP DNA并完成標準曲線用PCR之后，將不同濃度的電泳結果顯示在圖2a的左側面板。從右開始依次顯示103～109分子數的試料，而各條經擴增的DNA帶的強度用Imager densitometer(Alpha Innotech，USA)來測定。
連續稀釋上述提純分離的rAAV-AShVEGF-A-IRES-EGFP載體并完成粒子滴定用PCR之后，將不同濃度的電泳結果顯示在圖2a的右側面板。從右依次顯示10-4～100稀釋倍數的試料，而各條經擴增的DNA帶的強度用Imager densitometer來測定。
利用上述標準曲線用PCR結果制作右側面板上的標準曲線，而將上述粒子滴定用PCR結果適用于標準曲線而得到1.55×1011viralparticles/ml的滴定量(titer)(圖2b)。
(3)rAAV-TShVEGFR-1-GFP的粒子滴定連續稀釋利用分光光度計測定濃度的pAAV-TShVEGFR-1-GFPDNA并完成標準曲線用PCR之后，將不同濃度的電泳結果顯示在圖3a的左側面板。從左開始依次顯示103～108分子數的試料，而各條的經擴增的DNA帶的強度用Imager densitometer(Alpha Innotech，USA)來測定。
連續稀釋上述提純分離的rAAV-TShVEGFR-1-GFP載體并完成粒子滴定用PCR之后，將不同濃度的電泳結果顯示在圖3a的右側面板。從左依次顯示10-4～100稀釋倍數的試料，而各條經擴增的DNA帶的強度用Imager densitometer來測定。
利用上述標準曲線用PRC結果作出右側面板上的標準曲線，而將上述粒子滴定用PCR結果適用于標準曲線而得出1.36×1011viralparticles/ml的滴定量(titer)(圖3b)。
(4)rAAV-TShVEGFR-2-GFP的粒子滴定連續稀釋利用分光光度計測定濃度的pAAV-TShVEGFR-2-GFPDNA并完成標準曲線用PCR之后，將不同濃度的電泳結果顯示在圖4a的左側面板。從左開始依次顯示103～108分子數的試料，而各條經擴增的DNA帶的強度用Imager densitometer(Alpha Innotech，USA)來測定。
連續稀釋上述提純分離的rAAV-TShVEGFR-2-GFP載體并完成粒子滴定用PCR之后，將不同濃度的電泳結果顯示在圖4a的右側面板。從左依次顯示10-4～100稀釋倍數的試料，而各條經擴增的DNA帶的強度用Imager densitometer來測定。
利用上述標準曲線用PRC結果作出右側面板上的標準曲線，而將上述粒子滴定用PCR結果適用于標準曲線而得出1.12×1012viralparticles/ml的滴定量(titer)(圖4b)。
(5)rAAV-IRES-EGFP的粒子滴定連續稀釋利用分光光度計測定濃度的pAAV-IRES-EGFP DNA并完成標準曲線用PCR之后，將不同濃度的電泳結果顯示在圖5a的左側面板。從右開始依次顯示103～108分子數的試料，而各條經擴增的DNA帶的強度用Imager densitometer(Alpha Innotech，USA)來測定。
連續稀釋上述提純分離的rAAV-IRES-EGFP載體并完成粒子滴定用PCR之后，將不同濃度的電泳結果顯示在圖5a的右側面板。從右依次顯示10-4～100稀釋倍數的試料，而各條經擴增的DNA帶的強度用Imagerdensitometer來測定。
利用上述標準曲線用PRC結果作出右側面板上的標準曲線，而將上述粒子滴定用PCR結果適用于標準曲線而得出8.91×1011viralparticles/ml的滴定量(titer)(圖5b)。
(6)rAAV-EGFP 粒子滴定連續稀釋利用分光光度計測定濃度的pAAV-EGFP DNA并完成標準曲線用PCR之后，將不同濃度的電泳結果顯示在圖6a的左側面板。從右開始依次顯示105～109分子數的試料，而各條經擴增的DNA帶的強度用Imager densitometer(Alpha Innotech，USA)來測定。
連續稀釋上述提純分離的rAAV-EGFP載體并完成粒子滴定用PCR之后，將不同濃度的電泳結果顯示在圖6a的右側面板。從右依次顯示10-3～100稀釋倍數的試料，而各條經擴增的DNA帶的強度用Imagerdensitometer來測定。
利用上述標準曲線用PRC結果作出右側面板上的標準曲線，而將上述粒子滴定用PCR結果適用于標準曲線而得出5.36×109viralparticles/ml的滴定量(titer)(圖6b)。
實施例3癌細胞株培養及rAAV載體基因治療劑的處理為了研究in vitro狀態下防止癌轉移性的抗癌效果，在各細胞株的生長的最佳條件下培養人體大腸癌細胞株(T84ATCC CCL-248)、人體肺癌細胞株(LCSC#1WO 02/061069)及人體胃癌細胞株(NUGC3、MKN45、MKN74)等五種癌細胞株。為了實驗對上述癌細胞株的重組rAAV的抗癌治療效果，將上述癌細胞株在6well plate上各分株lO5cells/well培養24小時之后，添加總M.O.I.為lO5的各種組合的新生血管抑制rAAV載體并培養24小時。在本實施例中負控制(negative contril)選用未對rAAV進行處理的相同細胞群及未插入VEGF反義并只表達GFP的rAAV載體(rAAV-EGFP)，并在與實施例2的重組rAAV相同的條件下進行處理之后使用。對rAAV載體進行過處理的細胞，則用1xPBS進行兩次清洗之后重新添加最佳條件的新的培紙并培養72小時。
實施例4測定癌細胞株的轉導作用效率經培養的細胞的轉導作用(transduction)的效率是利用共焦顯微鏡(confocal microscopy)監控GFP蛋白的表達來進行測定的。
在實施例2中制造出的rAAV載體中，將表達GFP的rAAV向實施例3的五種癌細胞株(T84、LCSC#1、MKN45、MKN74及NUGC3)以其總M.O.I.為105的條件進行24小時的處理，并在經過48小時之后通過共焦顯微鏡方法(excitation 488nm；emission＞500nm)監控GFP蛋白的表達，從而測定轉導作用效率。預計rAAV-AShVEGF-A-IRES-EGFP能夠Bicistronic地獨立表達GFP蛋白，而且因為rAAV-TShVEGFR-1-GFP及rAAV-TShVEGFR-2-GFP載體能夠表達附著有GFP蛋白的fusion蛋白，從而可通過監控GFP蛋白的表達測定infection效率。另外，使用未對rAAV載體進行任何處理的陰性對照群細胞核經rAAV-IRES-EGFP處理的細胞對照群，一并監控GFP蛋白的表達。
結果，如FIGs.7～10所示，將上述四種rAAV載體感染至五種癌細胞株的結果，轉導作用效率將近100％，因此表明rAAV非常適合做基因治療用載體。
實施例5利用ELISA的癌細胞株內的rAAV載體的新生血管抑制效果(1)測定rAAV-AShVEGF-A載體的VEGF量減少效果將rAAV-AShVEGF-A載體向三種胃癌細胞株(NUGC3、MKN74及MKN45)、一種肺癌細胞株(LCSC#1)及一種大腸癌細胞株(T84)以總M.O.I為105的條件進行24小時處理，經72小時之后破碎細胞準備細胞lysate。作為對照群使用了未對rAAV載體進行任何處理的細胞群和對rAAV-EGFP載體進行處理的細胞群。對各細胞lysates的蛋白進行定量，利用10μg的總蛋白的lysates進行ELISA(RPN2779，AmershamBiosCiences，USA)，而根據rAAV-AShVEGF-A載體處理的VEGF的量的變化繁復測定了三次。
結果，如圖11及表1所示，在大腸癌細胞株T84上，比起對rAAV-EGFP載體進行處理的control群，對rAAV-AShVEGF-A載體進行處理的細胞群的VEGF的量減少了55％以上。而在肺癌細胞株LCSC#1上，比起control細胞群，VEGF的量減少了45％左右。相反，在三種胃癌細胞株上，幾乎看不到VEGF的量的變化。
表1根據rAAV-AShVEGF-A處理的癌細胞株的VEGF的量的變化
實施例6新生血管抑制in vivo抗癌效果研究向BABL/c裸小鼠(BABL/c nu/nu mouse，(株)中央實驗動物，JapanSLC，Inc.)的皮下注射NCI-H460人體肺癌細胞株(ATCC HTB-177)5×106個而制作出tumor model。
當上述注入癌細胞的BABL/c裸小鼠的腫瘤體積達到200～300mm3，則利用尾靜脈注射(tail vein injection)的方法轉導1011～1012viralparticles/1個體的各種組合的rAAV載體(rAAV-AShVEGF-A、rAAV-TShVEGFR-1、rAAV-TShVEGFR-2、[rAAV-TShVEGFR-1+rAAV-TShVEGFR-2]及[rAAV-TShVEGFR-1+rAAV-TShVEGFR-2+rAAV-AShVEGF-A])。在轉導作用之后的四周內，對動物的一般癥狀(一般狀態、活動性、外觀、自律神經及死亡與否)進行觀察，檢測體重并利用電子測徑器(Absolutedigimatic，Mitutoyo Corp.，Japan)測定腫瘤體積。轉導作用之后的第28天對老鼠進行尸體解剖并從中分離出實體癌(solid cancer)之后，利用Digital Plethysmometer(LE7500，Letica，Spain)測定腫瘤體積。切除各臟器(肝臟、脾臟、腎臟、心臟、肺、睪丸及副睪丸)和腫瘤之后，用10％中性福爾馬林及Bouin Solution(對于腫瘤、睪丸及副睪丸的情況)固定臟器并制作成石蠟包埋切片，以供進行免疫組織化學及組織學分析。為了測定內皮細胞的細胞密度，利用anti-CD34抗體進行免疫組織化學分析，并通過蘇木精/曙紅的染色進行組織學分析。
結果，如圖12所示，比起注射HEPES的陰性對照組，注射rAAV-AShVEGF-A、rAAV-TShVEGFR-1、rAAV-TShVEGFR-2、[rAAV-TShVEGFR-1+rAAV-TShVEGFR-2]及[rAAV-TShVEGFR-1+rAAV-TShVEGFR-2+rAAV-AShVEGF-A]的群，其腫瘤體積變得更小，尤其是，注射[rAAV-TShVEGFR-1+rAAV-TShVEGFR-2+rAAV-AShVEGF-A]的群的腫瘤體積明顯減少。
以上實施例僅用以說明本發明而非限制，盡管參照以上較佳實施例對本發明進行了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對本發明進行修改、變形或者等同替換，而不脫離本發明的精神和范圍，其均應涵蓋在本發明的權利要求范圍當中。
產業利用性如上所述，本發明具有提供基因治療用的含有VEGFR-1的truncatedsoluble cDNA或VEGFR-2的truncated soluble cDNA的rAAV載體的效果。另外，本發明還具有提供包括含有VEGFR的truncated soluble cDNA的rAAV載體和含有上述VEGFR的truncated soluble cDNA的rAAV載體及VEGF-A反義cDNA的rAAV載體的大腸癌、膀胱癌及/或肺癌特異性基因治療劑的效果。
本發明的基因治療劑通過抑制參與腫瘤的增殖及轉移所必需的新生血管的生長的VEGF的表達及功能，從而減少腫瘤的生長并從基因的層面上治療癌癥。
SEQUENCE LISTING<110>忠清北道(CHUNG CHOUNG BUK DO)<120>含有VEGFR的Truncated SolublecDNA的重組腺相關病毒及含有上述成分的大腸癌、膀胱癌及/或肺癌特異性基因治療劑<130>FP05KR065<150>KR10-2005-0067661<151>2005-07-26<160>15<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>429<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>1gggcctccga aaccatgaac tttctgctgt cttgggtgca ttggagcctt gccttgctgc 60tctacctcca ccatgccaag tggtcccagg ctgcacccat ggcagaagga ggagggcaga120atcatcacga agtggtgaag ttcatggatg tctatcagcg cagctactgc catccaatcg180agaccctggt ggacatcttc caggagtacc ctgatgagat cgagtacatc ttcaagccat240cctgtgtgcc cctgatgcga tgcgggggct gctgcaatga cgagggcctg gagtgtgtgc300ccactgagga gtccaacatc accatgcaga ttatgcggat caaacctcac caaggccagc360acataggaga gatgagcttc ctacagcaca acaaatgtga atgcagacca aagaaagata420gagcaagac429<210>2<211>25<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<400>2ggggtaccgt cttgctctat ctttc 25<210>3<211>28<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<400>3ccctcgaggg cctccgaaac catgaact 28<210>4<211>1967<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>4atggtcagct actgggacac cggggtcctg ctgtgcgcgc tgctcagctg tctgcttctc 60acaggatcta gttcaggttc aaaattaaaa gatcctgaac tgagtttaaa aggcacccag120cacatcatgc aagcaggcca gacactgcat ctccaatgca ggggggaagc agcccataaa180tggtctttgc ctgaaatggt gagtaaggaa agcgaaaggc tgagcataac taaatctgcc240tgtggaagaa atggcaaaca attctgcagt actttaacct tgaacacagc tcaagcaaac300cacactggct tctacagctg caaatatcta gctgtaccta cttcaaagaa gaaggaaaca360
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1.一種rAAV載體，其特征在于其含有SEQ ID NO4的VEGFR-1的truncated soluble cDNA，并通過以下步驟制造，即(a)將含有SEQ ID NO4的VEGFR-1的truncated solublecDNA的pAAV載體、AAV rep-cap質粒DNA及腺病毒輔助質粒轉染至動物細胞株的步驟；(b)培養上述被轉染的動物細胞株的步驟；(c)破碎經培養的上述細胞株并分離提純重組rAAV粒子的步驟。
2.一種rAAV載體，其特征在于其含有SEQ ID NO9的VEGFR-2的truncated soluble cDNA，并通過以下步驟制作，即(a)將含有SEQ ID NO9的VEGFR-2的truncated soluble cDNA的pAAV載體、AAV rep-cap質粒DNA及腺病毒輔助質粒轉染至動物細胞株的步驟；(b)培養上述被轉染的動物細胞株的步驟；(c)破碎經培養的上述細胞株并分離提純重組rAAV粒子的步驟。
3.一種大腸癌、膀胱癌及/或肺癌特異性基因治療劑，其特征在于包括含有權利要求項1的rAAV載體、權利要求項2的rAAV載體及SEQID NO1的VEGF-A反義cDNA的rAAV載體。
全文摘要
本發明涉及一種利用VEGF受體蛋白質(VEGFR)的truncated solublecDNA和腺相關病毒(AAV)系統的基因治療劑，尤其是一種包括含有VEGFR的truncated solublec DNA的rAAV載體及含有上述載體和VEGF－A反義(antisense)cDNA的rAAV載體的大腸癌、膀胱癌及/或肺癌特異性基因治療劑。本發明的基因治療劑通過抑制參與腫瘤的增殖及轉移所必需的新生血管的生長的VEGF的表達及功能，從而減少腫瘤的生長并從基因的層面上有效治療癌癥。
文檔編號C12N7/01GK1904056SQ20061000007
公開日2007年1月31日 申請日期2006年1月6日 優先權日2005年7月26日
發明者樸基娘 申請人:忠清北道