專利名稱：人源參與微絲組裝調控的核蛋白及其制備和應用方法
技術領域：
本發明屬于生物基因領域，具體地說是一種人源參與微絲組裝調控的核蛋白，本發明也涉及這種人源參與微絲組裝調控的核蛋白的制備和應用方法。
背景技術：
微絲是胞漿中一組由纖維狀結構組成的網架。微絲幾乎遍布于一切真核細胞，不僅僅是活細胞的支撐結構，形成微絨毛，而且在細胞器的運動、質膜的流動性、胞質環流以及頂體反應等細胞活動中扮演重要的角色。肌肉的收縮也主要靠微絲的運動來實現，當細胞受到外來信號的刺激時，也是依靠細胞膜下肌動蛋白結構的變化而進行信號的轉導的。
微絲是由一些小的蛋白分子通過組裝形成的網狀結構，而且微絲一些重要功能(如參與細胞運動、細胞黏附)都是通過骨架蛋白的組裝和解聚來實現的，因此研究微絲的組裝和解聚，尤其是研究發現參與微絲組裝和解聚的分子具有十分重要的意義。
通過差異顯示技術從人肺上皮細胞中發現了一種mRNA序列，同時通過生物信息學分析確定其編碼區，并推測其是一種膜結合相關蛋白。本發明從肺上皮細胞中分離了其編碼蛋白P18的基因序列，并對其功能進行了研究，發現P18蛋白參與了微絲的組裝和細胞黏附。
發明內容本發明的目的在于提供一種來自于人源的參與微絲組裝和細胞黏附的核蛋白。本發明的目的還在于提供這種人源參與微絲組裝調控的核蛋白的制備和應用方法。
本發明的目的是這樣實現的本發明的人源參與微絲組裝和細胞黏附的核蛋白，來源于人正常肺上皮細胞，它是由173個氨基酸殘基組成的蛋白質。它具有SEQ IDNo.1所示的核酸序列。其名稱為大腸桿菌JM 109/pET-28b-p18(Escherichia coli JM109/pET-28b-p18)；保藏于中國典型培養物保藏中心；保藏單位地址中國.武漢.武漢大學(郵政編碼430072)；保藏日期為2005年8月25日；保藏編號CCTCC NOM205092。
本發明的蛋白質是采用下列方法來制備的首先提取正常人類肺組織的總RNA，通過逆轉錄PCR的方法合成cDNA，用特異性引物擴增所述的人P18基因蛋白編碼序列，將所述人參與微絲組裝與細胞黏附的核蛋白編碼序列插入真核細胞表達載體，得到含有所述人參與微絲組裝與細胞黏附的核蛋白編碼序列的重組表達載體，將該重組表達載體導入真核細胞，通過免疫印跡的方法確認了所述的人參與微絲組裝與細胞黏附的核蛋白的表達。
本發明的蛋白質在參與微絲組裝與細胞黏附方面的應用是采用下列方法來進行的將所述人參與微絲組裝與細胞黏附的核蛋白編碼序列插入真核細胞表達載體，得到含有所述人參與微絲組裝與細胞黏附的核蛋白編碼序列的重組表達載體，將該重組表達載體導入真核細胞，從導入了所述的人參與微絲組裝與細胞黏附的核蛋白編碼序列的重組表達載體的細胞中觀察到細胞微絲結構的變化。
在概括和以特定的實施方案描述本發明前，列舉在描述本發明的上下文中所用的縮寫及代號。未在下文或說明書的其他部分定義的那些縮寫及代號具有本領域認同的意義。
縮寫“P18”是指本發明所提供的人源的參與微絲組裝和細胞黏附的核蛋白，具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。
代號“Invitrogen公司”指的是一家總部在美國的生物公司。
代號“TRIZOL”指的是Invitrogen公司的一種提取RNA的試劑的商標。
代號“Dnase I”指的是脫氧核糖核酸酶I，是一種將單鏈和雙鏈的DNA降解為寡聚脫氧核糖核酸的酶。
代號“ThermoScriptTMRT-PCR System”指的是Invitrogen公司的一種逆轉錄試劑盒的名稱。
縮寫“ORF”指的是基因中的開放讀碼框，其是蛋白質的編碼基因。
縮寫“PCR”指的是聚合酶鏈式反應，是一種將核酸片段大量擴增的技術。
代號“pcDNA3.1D/V5-His-TOPO”指的是Invitrogen公司的一種真核表達質粒的名稱。
縮寫“LB”指的是Luria-Bertani培養基，是一種細菌生長用的培養基。
代號“Roche公司”指的是一家總部在德國的生物公司。
代號“FuGENETM6 Transfection Reagent”指的是Roche公司的細胞轉染試劑。
代號“NIH3T3”指的是一種小鼠成纖維細胞株。
縮寫“FBS”指的是胎牛血清。
代號“Western blot”指的是蛋白質免疫印跡反應。
代號“anti-P18-IgY”指的是雞抗人P18抗體。
縮寫“K4M”指的是一種細胞或組織的包埋劑。
縮寫“FITC”指的是異硫氰酸熒光黃，是一種熒光染料。
代號“Northern blot”指的是RNA印跡反應。
圖1是P18蛋白表達的分析圖；圖2、3是P18蛋白的亞細胞定位圖；圖4、5是P18蛋白參與微絲組裝的激光共聚焦圖片；圖6是P18 mRNA表達的組織分布圖。
具體實施方式
下面結合附圖舉例對本發明作更詳細的描述1、人參與微絲組裝與細胞黏附的核蛋白全編碼區的克隆步驟1 cDNA第一條鏈的合成(1)正常肺組織總RNA的提取應用Invitrogen公司TRIZOL RNA提取試劑，按說明書提供的方法提取正常肺組織的總RNA。并用DNase I處理所提組織總RNA，然后再用TRIZOL總RNA提取試劑純化RNA，通過RNA/DNA計算器測定RNA含量，調整濃度約為1μg/μl，于1％甲醛變性瓊脂糖凝膠上電泳檢測所提RNA標本的完整性。
(2)采用Invitrogen公司的ThermoScriptTMRT-PCR System，采用隨機六堿基引物(random hexamer)進行高溫逆轉錄合成cDNA的第一條鏈。反應條件25℃10min→60℃ 60min→85℃ 5min。
步驟2 PCR擴增P18蛋白的ORF區為增強反應的特異性，采用巢式PCR擴增P18ORF區。根據軟件預測的ORF區設計引物。第一次PCR 所用的上游引物為5′-GGACTAAGAGGGGAGCAAGGCGAGGAG-3′，下游引物為5′-CTCTGGCTGTTCCCAAGAGCAGGCTC-3′。第二次PCR所用的上游引物為5′-CACCATGCTCCCGCCGCCCCCGCGCCAG-3′，下游引物為5′-AGCCGCCACCTCCTGCTTGCCCTGGCAG-3′。第一次PCR所用引物位于第二次PCR所用引物的外側。同時，為減少PCR過程中的錯誤堿基摻入，采取增大模板量，盡量減少PCR循環數的策略。
步驟3 真核表達載體的構建(1)連接與轉化采用Invitrogen公司pcDNA3.1D/V5-His-TOPO質粒作為真核表達載體。參照說明書的方法進行連接，并參照《分子克隆》(1989)所述的方法進行轉化大腸桿菌。涂布于含有氨芐青霉素抗性的LB平板。
(2)重組體的確認隨機挑選40個菌落，置于5ml含氨芐青霉素(100ng/ml)的LB培養基中，37℃振蕩培養16h，取1ml細菌培養物用于重組質粒序列測定(上海英駿生物技術有限公司)。
2、P18真核表達載體穩定轉染細胞系的建立步驟1 細胞轉染采用Roche公司的FuGENETM6 Transfection Reagent作為轉染試劑，并參照說明書將P18重組質粒轉染NIH3T3細胞。
步驟2 篩選穩定表達的細胞克隆(1)轉染后72h，將細胞以1∶6的比例傳代，此時用含新霉素(G418)的培養基進行培養。
(2)根據細胞狀態，每3天換液一次，直至抗性克隆形成。
(3)將已形成的抗性克隆細胞轉移到24孔板中，加入新鮮的含10％FBS的全培養基進行傳代培養，直至有足夠的細胞數量用于后續試驗，其間維持G418的篩選濃度。
步驟3 Western blot確認P18蛋白的表達用雞抗人anti-P18-IgY抗體用作一抗，參照《分子克隆》(1989)所述方法進行Western blot分析。結果如圖1所示，從圖中清晰可見轉染后，蛋白表達量明顯增加。
3、P18蛋白的亞細胞定位步驟1 K4M低溫包埋電子顯微鏡標示的制備穩定表達P18蛋白的細胞經戊二醛和多聚甲醛溶液固定，重蒸水洗滌，乙醇系列脫水，包埋劑滲透，乙醇/K4M混合液浸透，再經純K4M浸透。樣品在-30℃下紫外照射聚合24h以上，然后將樣品放在室溫下繼續用紫外照射聚合2-3天。
步驟2 抗P18抗體免疫電鏡觀察細胞經K4M包埋后，超薄切片。切片浸入PBSTT(磷酸鹽緩沖液+BSA+TritonX100+Tween-20)中室溫下作用15min，PBS充分洗滌。用雞抗人P18抗體室溫下作用60min。PBS洗滌3次，每次5min。再與15nm蛋白A-膠體金復合物于室溫下作用60min。PBS和重蒸水充分洗滌，5％醋酸雙氧鈾染色15min。重蒸水充分洗滌后，在透射電子顯微鏡下觀察照相。
對照實驗中，一抗用抗體稀釋液代替抗P18抗體。其他步驟與抗P18抗體標記步驟相同。結果如圖2，上圖為轉染前，下圖為轉染后。箭頭所示為轉染后在核內大量出現金顆粒，表明此蛋白主要定位于細胞核內。
4、P18蛋白對微絲組裝的影響從培養皿中取出細胞培養片后，PBS洗滌；室溫下用多聚甲醛固定，并用PBS洗滌。然后將載有細胞的蓋玻片浸入TritonX-100中于室溫作用10min，并用PBS洗滌。經BSA封閉后，用FITC標記的鬼筆環肽在室溫下進行。然后用PBS洗滌兩次。最后滴加n-Propyl gallate(n-丙基沒石子酸酯)進行封片，用激光共聚焦顯微鏡觀察。結果如圖3所示，上圖為轉染前，下圖為轉染后。從圖中可以清晰地看出，轉染含有P18序列的質粒后，細胞微絲結構發生紊亂，細胞間連接消失，說明P18蛋白參與了細胞微絲的組裝調控，對細胞間連接產生了直接的影響。
5、P18 mRNA在人類12種組織的分布以P18基因的cDNA為探針，對人正常多組織雜交膜(Clontech公司)進行Northern blot分析。參照說明書所提供的方法，結果如圖4所示。
序列表SEQ ID No.1序列信息<110>哈爾濱工業大學<120>人源參與微絲組裝調控的核蛋白P18編碼序列<160>2<210>1<211>522<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>1atg ctc ccg ccg ccc ccg cgc cag ccg ccg ccc cag gcg cgt gcg gcc cgc ggc gcg gtg 60Met Leu Pro Pro Pro Pro Arg Gln Pro Pro Pro Gln Ala Arg Ala Ala Arg Gly Ala Val5 10 15 20cgc ctg cag cgg ccc ttc ctg cgc agc ccg ctg ggc gtg ttg cgg ctg ctg cag ctg ctg 120Arg Leu Gln Arg Pro Phe Leu Arg Ser Pro Leu Gly Val Leu Arg Leu Leu Gln Leu Leu25 30 35 40gcc ggc gct gcc ttc tgg atc act atc gcc acc agc aag tac cag ggc ccc gtg cac ttc 180Ala Gly Ala Ala Phe Trp Ile Thr Ile Ala Thr Ser Lys Tyr Gln Gly Pro Val His Phe45 50 55 60gcg ctc ttc gtg tcc gtg ctc ttc tgg ctg ctc acc ctg ggc ctc tac ttc ctc acg ctg 240Ala Leu Phe Val Ser Val Leu Phe Trp Leu Leu Thr Leu Gly Leu Tyr Phe Leu Thr Leu65 70 75 80ctg ggc aag cac gag ctg gtc ccc gtg ctg ggc tcg cgc tgg ctc atg gtc aac gtg gcg 300Leu Gly Lys His Glu Leu Val Pro Val Leu Gly Ser Arg Trp Leu Met Val Asn Val Ala85 90 95 100cac gat gtg ctg gcg gcc gcg ctc tac ggc gcc gcc acc ggc atc atg agc gac cag atg 360His Asp Val Leu Ala Ala Ala Leu Tyr Gly Ala Ala Thr Gly Ile Met Ser Asp Gln Met105 110 115 120cag cgc cac agc tac tgc aac ctc aag gat tac ccg ctc ccc tgc gcc tac cac gcc ttc 420Gln Arg His Ser Tyr Cys Asn Leu Lys Asp Tyr Pro Leu Pro Cys Ala Tyr His Ala Phe125 130 135 140ctg gcg gcc gcc gtc tgc ggc ggc gtc tgc cac ggc ctc tac ctg ctt tcg gcg ctc tat 480Leu Ala Ala Ala Val Cys Gly Gly Val Cys His Gly Leu Tyr Leu Leu Ser Ala Leu Tyr145 150 155 160ggc tgc ggg cgt cgc tgc cag ggc aag cag gag gtg gcg tga 522Gly Cys Gly Arg Arg Cys Gln Gly Lys Gln Glu Val Ala165 170<210>2<211>173<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>2Met Leu Pro Pro Pro Pro Arg Gln Pro Pro Pro Gln Ala Arg Ala5 10 15Ala Arg Gly Ala Val Arg Leu Gln Arg Pro Phe Leu Arg Ser Pro
20 25 30Leu Gly Val Leu Arg Leu Leu Gln Leu Leu Ala Gly Ala Ala Phe35 40 45Trp Ile Thr Ile Ala Thr Ser Lys Tyr Gln Gly Pro Val His Phe50 55 60Ala Leu Phe Val Ser Val Leu Phe Trp Leu Leu Thr Leu Gly Leu65 70 75Tyr Phe Leu Thr Leu Leu Gly Lys His Glu Leu Val Pro Val Leu80 85 90Gly Ser Arg Trp Leu Met Val Asn Val Ala His Asp Val Leu Ala95 100 105Ala Ala Leu Tyr Gly Ala Ala Thr Gly Ile Met Ser Asp Gln Met110 115 120Gln Arg His Ser Tyr Cys Asn Leu Lys Asp Tyr Pro Leu Pro Cys125 130 135Ala Tyr His Ala Phe Leu Ala Ala Ala Val Cys Gly Gly Val Cys140 145 150His Gly Leu Tyr Leu Leu Ser Ala Leu Tyr Gly Cys Gly Arg Arg155 160 165Cys Gln Gly Lys Gln Glu Val Ala170
權利要求
1.一種人源參與微絲組裝調控的核蛋白，其特征是人參與微絲組裝和細胞黏附的核蛋白來源于人正常肺上皮細胞，它是由173個氨基酸殘基組成的蛋白質。
2.根據權利要求1所述的人源參與微絲組裝調控的核蛋白，其特征是所述的人源參與微絲組裝調控的核蛋白具有SEQ ID No.1所示的核酸序列。
3.根據權利要求2所述的人源參與微絲組裝調控的核蛋白，其特征是所述的SEQ ID No.1核酸序列為Met Leu Pro Pro Pro Pro Arg Gln Pro Pro Pro Gln Ala Arg Ala5 10 15Ala Arg Gly Ala Val Arg Leu Gln Arg Pro Phe Leu Arg Ser Pro20 25 30Leu Gly Val Leu Arg Leu Leu Gln Leu Leu Ala Gly Ala Ala Phe35 40 45Trp Ile Thr Ile Ala Thr Ser Lys Tyr Gln Gly Pro Val His Phe50 55 60Ala Leu Phe Val Ser Val Leu Phe Trp Leu Leu Thr Leu Gly Leu65 70 75Tyr Phe Leu Thr Leu Leu Gly Lys His Glu Leu Val Pro Val Leu80 85 90Gly Ser Arg Trp Leu Met Val Asn Val Ala His Asp Val Leu Ala95 100 105Ala Ala Leu Tyr Gly Ala Ala Thr Gly Ile Met Ser Asp Gln Met110 115 120Gln Arg His Ser Tyr Cys Asn Leu Lys Asp Tyr Pro Leu Pro Cys125 130 135Ala Tyr His Ala Phe Leu Ala Ala Ala Val Cys Gly Gly Val Cys140 145 150His Gly Leu Tyr Leu Leu Ser Ala Leu Tyr Gly Cys Gly Arg Arg155 160 165Cys Gln Gly Lys Gln Glu Val Ala170
4.一種人源參與微絲組裝調控的核蛋白的制備方法，其特征是首先提取正常人類肺組織的總RNA，通過逆轉錄PCR的方法合成cDNA，用特異性引物擴增所述的人P18基因蛋白編碼序列，將所述人參與微絲組裝與細胞黏附的核蛋白編碼序列插入真核細胞表達載體，得到含有所述人參與微絲組裝與細胞黏附的核蛋白編碼序列的重組表達載體，將該重組表達載體導入真核細胞，通過免疫印跡的方法確認了所述的人參與微絲組裝與細胞黏附的核蛋白的表達。
5.一種人源參與微絲組裝調控的核蛋白的應用方法，其特征是將所述人參與微絲組裝與細胞黏附的核蛋白編碼序列插入真核細胞表達載體，得到含有所述人參與微絲組裝與細胞黏附的核蛋白編碼序列的重組表達載體，將該重組表達載體導入真核細胞，從導入了所述的人參與微絲組裝與細胞黏附的核蛋白編碼序列的重組表達載體的細胞中觀察到細胞微絲結構的變化。
全文摘要
本發明設計的是人源參與微絲組裝調控的核蛋白及其制備和應用方法。它來源于人正常肺上皮細胞，它是由173個氨基酸殘基組成的蛋白質。首先提取正常人類肺組織的總RNA，通過逆轉錄PCR的方法合成cDNA，用特異性引物擴增所述的人P18基因蛋白編碼序列，將所述人參與微絲組裝與細胞黏附的核蛋白編碼序列插入真核細胞表達載體，得到含有所述人參與微絲組裝與細胞黏附的核蛋白編碼序列的重組表達載體，將該重組表達載體導入真核細胞，通過免疫印跡的方法確認了所述的人參與微絲組裝與細胞黏附的核蛋白的表達。
文檔編號C12N15/10GK1865441SQ20061000977
公開日2006年11月22日 申請日期2006年3月8日 優先權日2006年3月8日
發明者李鈺, 呂冰潔, 赫杰, 王山, 雷露 申請人:哈爾濱工業大學