專利名稱：一種胚胎體外著床模型的建立方法及其用途的制作方法
技術領域：
發明涉及生殖醫學領域，具體涉及一種人類胚胎體外著床模型的建立方法及其用途。
背景技術：
目前隨著不育癥治療技術的提高，尤其是輔助生殖技術的開展，成熟卵母細胞的獲得率、體外受精的成功率及胚胎的植入率均明顯提高，但妊娠率卻很低，究其原因在于胚胎著床失敗。胚胎著床是指胚泡逐漸埋入子宮內膜的過程，可分為定位/黏附、突破和侵入三個階段，該過程復雜而精細。以往由于臨床觀察手段有限及妊娠后子宮內膜取材困難，因而無法直接觀察到人胚胎著床過程，著床機理也不十分清楚。為揭示著床機制的奧秘和克服在體研究中難以精確觀察到胚泡著床各階段的變化及各種有關因素間的協調作用，人們不斷探索并建立了多種動物著床模型。其中與人體內環境較接近的模型有以下兩類一類模型是用囊胚與子宮單層上皮細胞體外共培養。利用該模型，已發現了大量與胚胎著床有關的上皮細胞分泌的因子，如整合素、瘦素、IL-1等，觀察了17-B雌二醇(E2)對胚胎發育的促進作用及其粘附和擴展作用。但是該模型中的囊胚僅僅定位黏附在上皮細胞層上并不能侵入上皮細胞中，利用該模型僅能進行胚胎著床第一階段的研究；另一種著床模型是胚泡與子宮上皮細胞和基質細胞共培養，在這個著床模型中，子宮上皮細胞與基質細胞通過一個人工的基底膜分開，胚泡被種植在上皮細胞層上。光鏡及電鏡觀察到囊胚黏附并侵入到上皮細胞層中，但是未穿透基底膜到達基質細胞層。因此該模型也只能觀察到胚胎著床第二階段的過程。另外，用人子宮蛻膜細胞與小鼠胚泡共培養建立的著床模型，也只能觀察到小鼠胚泡在人蛻膜上能夠孵出、黏附、鋪展，同樣無法進行人類胚胎著床第三階段即囊胚侵入子宮內膜基質細胞階段的觀察及研究。
發明目的本發明旨在用人胚胎和人子宮內膜蛻膜化的基質細胞為材料，建立一個更為接近人在體著床過程的體外模型，對囊胚侵入子宮內膜基質細胞過程進行觀察和研究，深入了解人胚胎著床機制，進而提高不育癥治療技術水平及輔助生殖技術水平。
發明內容
為實現上述目的，本發明提供一種胚胎體外著床模型的建立方法，其特征在于它包括下列步驟a.無菌收集因婦科良性疾病行子宮切除術或清宮術的育齡婦女子宮內膜組織。
b.將無菌收集的子宮內膜組織用培養液充分洗滌后制成顆粒，加入10～20ml的消化酶恒溫震蕩消化50～120分鐘，然后用250μm的細胞篩過濾細胞懸液除去未消化的組織碎片，再用細胞篩過濾除去上皮細胞和腺體成分；c.將上述過濾后的細胞懸液梯度離心25～35分鐘，靜置后取梯度離心液交界面中的細胞，將其懸浮在緩沖液中，然后進行活細胞染色并計數；d.將上述細胞種植在組織培養瓶中，使細胞密度為1×106～1×105/ml，加入含10％～15％胎牛血清、100IU/ml的青霉素和100μg/ml鏈霉素的DMEM培養液(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium為美國Sigma公司產品)后，于培養箱中培養并傳代；e.傳代后2～8代基質細胞被種植在培養板的單孔底部蓋玻片上，待細胞貼壁匯合成層后，加入含0.5mM 8-溴-環磷酸腺苷的F12培養液繼續培養，培養3天后部分細胞蛻膜化；f.胚胎培養受精后2天的胚胎在BlastAsist System培養液中培養5～6天，直至進入孵化階段；g.將孵化的胚胎種植在預先準備好的蛻膜化的子宮內膜基質細胞上，在培養箱中培養48小時以上。
所述顆粒體積為0.5～1.5mm3。
所述消化酶采用膠原酶I或膠原酶I與DNA酶I組成的混合酶。
所述梯度離心液其濃度為25％和65％。
所述緩沖液為含有0.1％牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液。
所述活細胞染色所用染色劑為含0.4％臺盼蘭的染液。
該著床模型用于體外人胚胎著床過程的觀察。
將孵化的胚胎與預先準備好的蛻膜化的子宮內膜基質細胞共培養5～10小時后，胚胎黏附在子宮內膜基質細胞層上；共培養24～36小時后，可觀察到滋養層細胞逐漸從囊胚的兩個極端開始外延生長，隨著囊胚的鋪展及滋養細胞的外延生長，囊胚也漸漸變大；最終侵入蛻膜化的基質細胞中。至此，體外著床模型已經建立，利用該模型可進行一系列胚胎體外著床機理的研究。
本發明取得的技術進步本發明建立了使用蛻膜化的人子宮內膜基質細胞和人胚泡在體外進行共培養模型，并且觀察到了人胚胎黏附、外延生長及侵入整個著床過程。該模型更接近于人類在體胚胎著床環境，利用該模型可進行一系列與胚胎著床有關影響因素的研究，使在體外觀察人胚胎著床成為現實并為深入研究人胚胎著床機理提供了條件。而胚泡著床是生殖的關鍵環節，是在激素的調節下有多種因子參與的復雜過程。對著床機理的探討，是生命科學的重要基礎理論研究。通過對著床過程的控制可避免人口過度增長、促進牲畜的繁衍以及提高基因動物與克隆動物的成功率。此外還能提高不育癥治療技術水平及輔助生殖技術水平，改善育齡人群的生育質量、生活質量和生命質量，因此具有重大的社會效益和經濟效益。
具體實施例方式
一、選取實驗材料子宮內膜取自年齡在29-40歲因婦科良性疾病行子宮切除術或清宮術的婦女。上述病人月經周期應規則，且近三個月內未服用任何激素類藥物。胚胎由行IVF治療的病人捐贈。
二、人子宮內膜基質細胞的分離培養及蛻膜化的誘導①.清洗將無菌收集的子宮內膜組織用DMEM培養液洗滌3～5次，以去掉血及其黏液。
②.制備顆粒將上述收集的子宮內膜組織剪切成1mm3大小的顆粒，以利于消化。
③.消化將上述子宮內膜組織顆粒放入一個體積為30ml的帶蓋離心管內，加入10～20ml濃度為330IU/ml的膠原酶I，該酶采用美國Wathington生化公司產品，于37℃恒溫水浴箱中震蕩消化60分鐘，當組織顆粒消失變為圓形單個細胞時，結束消化。整個消化過程要隨時在倒置顯微鏡下觀察，以免消化過度損傷細胞或消化程度不夠。當使用一種消化酶消化一個小時，細胞依然呈現團狀聚集時，應再加入DNA酶I繼續消化，該酶采用美國Wathington生化公司產品。
④.細胞分離用250μm的細胞篩過濾上述消化后的細胞懸液，以除去未消化的組織碎片，然后用含0.1％BSA的PBS清洗1遍；再用40μm的細胞篩過濾除去上皮細胞和腺體成分，再用含0.1％BSA的PBS清洗2遍。該BSA即牛血清白蛋白為美國Sigma公司產品，PBS即磷酸鹽緩沖液，為美國Sigma公司產品；250um和40um的細胞篩為英國Lockertex公司產品。
⑤.梯度離心將上述過濾后的細胞懸液在25％和60％的梯度離心液中于12℃以1800轉/分鐘速度離心30分鐘，靜置后取25％和60％Percoll交界面中的細胞，然后將其懸浮在含有0.1％牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液中。上述梯度離心液為美國Sigma公司產品。
⑥.細胞計數用0.4％的臺盼蘭染色，用白細胞計數板在顯微鏡下進行活細胞計數，該臺盼蘭染液為美國Sigma公司產品。
⑦.種植將上述細胞種植在75cm2組織培養瓶中(細胞密度1×106/ml)，加入含10％胎牛血清、100IU/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的DMEM培養液15ml，于37℃、5％CO2的培養箱中培養并傳代，人子宮內膜基質細胞純度檢測大于95％。胎牛血清為美國Sigma公司產品。二氧化碳水套式培養箱(型號3110)為美國Forma Scientific公司產品。
⑧.誘導人子宮基質細胞蛻膜化，將傳代后2～8代基質細胞種植在4孔培養板上，使細胞密度為1×106/ml。此時細胞呈圓形，加入含10％胎牛血清、100IU/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的DMEM培養液，放入37℃，5％CO2的培養箱中培養。培養4～5天后細胞變成梭形并匯合成層時，換成含0.5mM 8-溴-環磷酸腺苷的F12培養液繼續培養，8-溴-環磷酸腺苷為美國Sigma公司產品，可誘導子宮內膜基質細胞蛻膜化，培養3天后基質細胞由梭形變成多邊形的蛻膜細胞，此時的子宮內膜細胞更接近于在體人胚胎著床時的內膜細胞。F12培養液為美國Sigma公司產品。
三、胚胎培養受精后2天的胚胎在BlastAsist System培養液中培養5～6天，直至透明帶脫落進入孵化階段。用德國ZEISS公司生產的倒置顯微鏡(型號Axiovert 135)密切觀察整個培養過程。BlastAsist System培養液為丹麥Medi Cult公司產品。
四、人胚胎與蛻膜化的子宮內膜基質細胞共培養將孵化的胚胎種植在預先準備好的蛻膜化的子宮內膜基質細胞層上，每孔加入500ml DMEM培養液，在37℃、5％CO2的培養箱中培養，分別在5、24、48、72、96小時時用倒置顯微鏡觀察并記錄胚胎黏附、外延生長及侵入情況。透明帶脫落為孵出；輕輕搖晃培養板胚泡不隨液體飄動者為黏附；在顯微鏡下見滋養細胞從附著處向外生長定為鋪展及外延生長；光鏡下觀察有滋養細胞侵入母體的細胞或細胞外基質為侵入。共培養5～10小時后，胚胎黏附在子宮內膜基質細胞層上；共培養24～36小時后，滋養層細胞逐漸從囊胚的兩個極端開始外延生長，隨著囊胚的鋪展及滋養細胞的外延生長，囊胚也漸漸變大；最終侵入蛻膜化的基質細胞中。至此，體外著床模型已經被建立。
權利要求
1.一種胚胎體外著床模型的建立方法，其特征在于它包括下列步驟a.無菌收集因婦科良性疾病行子宮切除術或清宮術的育齡婦女子宮內膜組織；b.將無菌收集的子宮內膜組織用培養液充分洗滌后制成顆粒，加入10～20ml的消化酶恒溫震蕩消化50～120分鐘，然后用250μm的細胞篩過濾細胞懸液除去未消化的組織碎片，再用35～42μm細胞篩過濾除去上皮細胞和腺體成分；c.將上述過濾后的細胞懸液梯度離心25～35分鐘，靜置后取梯度離心液交界面中的細胞，將其懸浮在緩沖液中，然后進行活細胞染色并計數；d.將上述細胞種植在組織培養瓶中，使細胞密度為1×106～1×105/ml，加入含10％～15％胎牛血清、100IU/ml的青霉素和100μg/ml鏈霉素的DMEM培養液后，于培養箱中培養并傳代；e.傳代后2～8代基質細胞被種植在培養板上，待細胞貼壁匯合成層后，加入含0.5mM 8-溴-環磷酸腺苷的F12培養液繼續培養，培養3天后部分細胞蛻膜化；f.胚胎培養受精后2天的胚胎在BlastAsist System培養液中培養5～6天，直至進入孵化階段；g.將孵化的胚胎種植在預先準備好的蛻膜化的子宮內膜基質細胞上，在培養箱中培養48小時以上。
2.根據權利要求1所述的胚胎體外著床模型的建立方法，其特征在于所述顆粒體積為0.5～1.5mm3。
3.根據權利要求1所述的胚胎體外著床模型的建立方法，其特征在于所述消化酶采用膠原酶I或膠原酶I與DNA酶I組成的混合酶。
4.根據權利要求1所述的胚胎體外著床模型的建立方法，其特征在于所述梯度離心液其濃度為25％和65％。
5.根據權利要求1所述的胚胎體外著床模型的建立方法，其特征在于所述緩沖液為含有0.1％牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液。
6.根據權利要求1所述的胚胎體外著床模型的建立方法，其特征在于所述活細胞染色所用染色劑為含0.4％臺盼蘭的染液。
7.一種如權利要求1所述的胚胎體外著床模型的用途，其特征在于該著床模型用于體外人胚胎著床過程的觀察。
全文摘要
本發明公開了一種胚胎體外著床模型的建立方法及用途，它包括選取子宮內膜、人子宮內膜基質細胞的分離培養及蛻膜化的誘導、胚胎培養、人胚胎與蛻膜化的子宮內膜基質細胞共培養等過程，由于本發明建立了使用蛻膜化的人子宮內膜基質細胞和人胚泡在體外進行共培養模型，并且觀察到了人胚胎黏附、外延生長及侵入整個著床過程。該模型更接近于人類在體胚胎著床環境，利用該模型可進行一系列與胚胎著床有關影響因素的研究，使在體外觀察人胚胎著床成為現實并為深入研究人胚胎著床機理提供了條件。能提高不育癥治療技術水平及輔助生殖技術水平，改善育齡人群的生育質量、生活質量和生命質量，具有重大的社會效益和經濟效益。
文檔編號C12N5/08GK1873738SQ200610012750
公開日2006年12月6日 申請日期2006年5月19日 優先權日2006年5月19日
發明者劉芳, 高亞萍 申請人:劉芳