專利名稱：用于檢測對蝦白斑綜合癥病毒的引物序列及檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術中的DNA序列，使用該序列對一種病毒進行檢測的試劑盒，特別是涉及一種用于檢測對蝦病毒的引物序列及檢測試劑盒。
背景技術：
上世紀80年代以來，我國水產業迅速發展，并且在農業產值中所占的比重逐年上升，已成為我國農業的四大支柱產業之一。但令人遺憾的是水生動物疾病，尤其是因病毒引起的暴發性流行病明顯增多，危害極為嚴重。在1992年，由于對蝦白斑綜合癥病毒的蔓延與流行，給水產養殖業造成了上億元的經濟損失。
水生動物病毒病具有潛伏期長短不一、癥狀復雜多變、傳染性強和導致高死亡率的特點。特別是病毒個體微小，侵染動物后在宿主細胞內復制，而抗生素對病毒基本無抑制作用，而化學藥物在殺滅病毒前就可能使宿主動物受損或致死。由于水生動物水生的特性和病毒的細胞內寄生的特性，要從根本上消除細胞內的病毒而不影響宿主細胞在目前是不可能的。因此必須做好水生動物病毒病的預防工作，做好此項工作的基礎就是要建立病毒的快速診斷與檢測技術。
對病毒病檢測技術的研究多依賴于對病毒病病理和病原的研究基礎，主要采用的方法有形態學、組織病理學、免疫學等研究方法。主要包括現場目視觀察法、生物測定法、光學顯微鏡檢查法、電子顯微鏡檢查法、免疫熒光檢查法等。這些方法耗時長，且大多要依靠經驗判斷，這對病毒的檢測造成了一定的困難。
多聚酶鏈式反應(Polymerase chain reaction，簡稱PCR)技術檢測靈敏度高，特異性強，檢驗周期短，操作相對簡便。但目前尚無用此種方法對對蝦白斑綜合癥病毒快速診斷與檢測的報導。
發明內容
本發明的目的是克服現有技術中的不足，提供一種用于檢測對蝦白斑綜合癥病毒的引物序列。
本發明的第二個目的是提供一種對養殖南美白對蝦、中國對蝦、斑節對蝦等的對蝦白斑綜合癥病毒進行跟蹤監測，并具有簡便、快速、靈敏、特異特點的對蝦白斑綜合癥病毒檢測試劑盒。
本發明的技術方案概述如下一種用于檢測對蝦白斑綜合癥病毒的引物序列，它由上游引物和下游引物組成，所述上游引物具有序列表中SEQ ID No1所述的核苷酸序列，所述下游引物具有序列表中SEQID No2所述的核苷酸序列。
一種對蝦白斑綜合癥病毒檢測試劑盒，由下述試劑組成試劑A將1-3g的十六烷基三甲基溴化胺加入100ml的水，使其中含有0.5-2.5M NaCl、10-30mM乙二胺四乙酸和10-30mM羥基甲基氨基甲烷-鹽酸，調節pH＝7.5制成；試劑B濃度為0.05g/mL-0.5g/mL的硅膠水溶液；試劑C體積百分濃度為60％-90％的乙醇水溶液；試劑D將10倍PCR反應緩沖液2.5-5.0μL、Taq DNA聚合酶1-2.5U、滅菌雙蒸水12-18μL混合制成；試劑E將10μM SEQ ID No1所述的核苷酸序列0.2-1.0μL，10μM SEQ ID No2所述的核苷酸序列0.2-1.0μL，10mM dNTPs 0.2-0.8μL，25mM MgCl21.5-3.5μL混合制成；試劑F對蝦白斑綜合癥病毒的基因組總DNA；試劑G滅菌雙蒸水；試劑H取50mL 20倍TBE電泳緩沖液，使其中含有0.09mol羥基甲基氨基甲烷-硼酸，2mmol乙二胺四乙酸制成；試劑I0.3-0.6g瓊脂糖，使其中含溴化乙錠15-30μg。
一種對蝦白斑綜合癥病毒檢測試劑盒，優選的方案是試劑A為將2g的十六烷基三甲基溴化胺加入100ml的水，使其中含有1.4M NaCl、20mM乙二胺四乙酸和20mM羥基甲基氨基甲烷-鹽酸，調節pH＝7.5制成；試劑B為濃度為0.3g/mL的硅膠水溶液；試劑C為體積百分濃度為75％的乙醇水溶液；試劑D為將10倍PCR反應緩沖液2.5μL、Taq DNA聚合酶1.25U、滅菌雙蒸水16.75μL混合制成；試劑E為將10μM SEQ ID No1所述的核苷酸序列0.5μL，10μM SEQ ID No2所述的核苷酸序列0.5μL，10mM dNTPs 0.5μL，25mM MgCl22.5μL混合制成；試劑F對蝦白斑綜合癥病毒的基因組總DNA；試劑G滅菌雙蒸水；試劑H取50mL 20倍TBE電泳緩沖液，使其中含有0.09mol羥基甲基氨基甲烷-硼酸，2mmol乙二胺四乙酸制成；試劑I為0.3g瓊脂糖，使其中含溴化乙錠20μg。
對蝦白斑綜合癥病毒的基因組總DNA是用下述方法提取的用滅菌剪刀取已感染對蝦白斑綜合癥病毒的對蝦的鰓絲50-100mg，置于滅菌的1.5mlEppendorf管內，加入150μL質量百分比為1％的十六烷基三甲基溴化胺水溶液，充分剪碎組織，加700μL質量百分比為1％的十六烷基三甲基溴化胺水溶液，25℃作用2h，加入600μL體積比為25∶24∶1的苯酚/氯仿/異戊醇，混勻30s，經12000r/m離心5min，取上層水相，加入700μL體積比為24∶1的氯仿/異戊醇，混勻30s，12000r/m離心5min，取上層水相，加入兩倍體積的-20℃無水乙醇，沉淀8-12小時，15000r/m離心30min，棄掉上清液，晾干，100ul滅菌雙蒸水溶解，-20℃保存。
本發明的優點利用對蝦白斑綜合癥病毒的基因保守序列設計一對引物，優化PCR反應條件和反應體系，建立起檢測對蝦白斑綜合癥病毒的PCR檢測方法，在此基礎上裝配出簡便、快速、靈敏、特異的一種對蝦白斑綜合癥病毒檢測試劑盒，該試劑盒可用于對養殖南美白對蝦、中國對蝦、斑節對蝦等的對蝦白斑綜合癥病毒的跟蹤監測，具有很高的實用價值。
圖1為檢測對蝦白斑綜合癥病毒電泳結果圖。
具體實施例方式
下面結合具體實施例對本發明作進一步的說明。
實施例1一種用于檢測對蝦白斑綜合癥病毒的引物序列，是它由上游引物和下游引物組成，所述上游引物具有序列表中SEQ ID No1所述的核苷酸序列，所述下游引物具有序列表中SEQID No2所述的核苷酸序列。
序列表SEQ ID No15’--CCAAGACATACTAGCGGATA--3’SEQ ID No25’--GACGACCCTGACAGAATTAC--3’實施例2一種對蝦白斑綜合癥病毒檢測試劑盒，由下述試劑組成試劑A為將2g的十六烷基三甲基溴化胺加入100ml的水，使其中含有1.4M NaCl、20mM乙二胺四乙酸(EDTA)和20mM羥基甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)，調節pH＝7.5制成；試劑B為濃度為0.3g/mL的硅膠水溶液；試劑C為體積百分濃度為75％的乙醇水溶液；(試劑A、試劑B和試劑C為對蝦白斑綜合癥病毒基因組DNA提取試劑)試劑D(PCR反應預混試劑)將10倍PCR反應緩沖液2.5μL、Taq DNA聚合酶1.25U、滅菌雙蒸水16.75μL混合制成；試劑E(PCR反應引物試劑)將10μM SEQ ID No1所述的核苷酸序列0.5μL，10μM SEQ ID No2所述的核苷酸序列0.5μL，10mM dNTPs 0.5μL，25mM MgCl22.5μL混合制成；試劑F(陽性對照)對蝦白斑綜合癥病毒的基因組總DNA；對蝦白斑綜合癥病毒的基因組總DNA是用下述方法提取的用滅菌剪刀取已感染對蝦白斑綜合癥病毒的對蝦的鰓絲100mg，置于滅菌的1.5mlEppendorf管內，加入150μL質量百分比為1％的十六烷基三甲基溴化胺水溶液，充分剪碎組織，加700μL質量百分比為1％的十六烷基三甲基溴化胺水溶液，25℃作用2h，加入600μL體積比為25∶24∶1的苯酚/氯仿/異戊醇，混勻30s，經12000r/m離心5min，取上層水相，加入700μL體積比為24∶1的氯仿/異戊醇，混勻30s，12000r/m離心5min，取上層水相，加入兩倍體積的-20℃無水乙醇，沉淀10小時，15000r/m離心30min，棄掉上清液，晾干，100ul滅菌雙蒸水溶解，-20℃保存。
試劑G(空白對照)滅菌雙蒸水；(二次蒸餾水)試劑H(電泳試劑)取50mL 20倍TBE電泳緩沖液，使其中含有0.09mol羥基甲基氨基甲烷-硼酸(Tris-硼酸)，2mmol乙二胺四乙酸制成(按此比例，可獲得任何體積的試劑H)；試劑I(顯色試劑)0.3g瓊脂糖，使其中含溴化乙錠20μg。
滅菌牙簽一包。
實施例3一種對蝦白斑綜合癥病毒檢測試劑盒的檢測對蝦白斑綜合癥病毒的步驟1、無菌狀態下取待檢樣品組織約50-100mg，加入200μL試劑A，用滅菌牙簽搗碎1-2min；2、12000rpm/min離心3min，取上清，加入20μL試劑B(用前需搖勻)，室溫放置3-5min，其間不斷搖勻；3、10000rpm/min離心30sec，棄掉上清液，加入200μL試劑C，10000rpm/min離心30sec，棄掉上清液；4、打開離心管蓋，放置60℃3min，加20μL試劑G懸浮沉淀，稍離心，取上清作為PCR反應的模板；5、PCR擴增取19μL試劑D與4μL試劑E混合，加入2μL PCR反應模板(用20μL試劑G溶解的試劑F)，同時取2μL試劑F和試劑G分別加入另外兩個19μL試劑D與4μL試劑E混合的PCR反應管中，分別作為陽性對照和空白對照，在PCR儀上進行擴增，反應條件為94℃ 4min預變性，94℃ 1min，55℃ 1min，72℃ 1min，29個循環，72℃10min，4℃保存；6、反應結束后，取試劑H用蒸餾水做40倍稀釋。將試劑I倒入100mL的三角瓶內，加入稀釋后的試劑H，加熱，直至溶液清亮，稍冷卻，倒入制膠槽；7、取5-10μL PCR反應產物加2μL上樣緩沖液，經1％瓊脂糖凝膠電泳30-35min后于紫外儀上觀察。若在235bp處出現反應條帶，則為對蝦白斑綜合癥病毒陽性，若無條帶為陰性，陽標應在235bp處出現反應條帶，空白應無反應條帶(見圖1，圖中1為235bp處)。
本試劑盒所建立的PCR方法可在5-6h內從病料中檢測出對蝦白斑綜合癥病毒。
本發明主要涉及對象為養殖南美白對蝦、中國對蝦、斑節對蝦等的病原對蝦白斑綜合癥病毒(white spot sydrome virus，簡稱WSSV)。對蝦白斑綜合癥病毒是采用中華人民共和國質量監督檢驗檢疫總局發布的中華人民共和國出入境檢驗檢疫行業標準中的對蝦白斑病毒聚合酶鏈式反應(PCR)檢測方法進行檢測的。
實施例4一種對蝦白斑綜合癥病毒檢測試劑盒，由下述試劑組成試劑A將1g的十六烷基三甲基溴化胺加入100ml的水，使其中含有0.5M NaCl、10mM乙二胺四乙酸和10mM羥基甲基氨基甲烷-鹽酸，調節pH＝7.5制成；試劑B濃度為0.05g/mL的硅膠水溶液；試劑C體積百分濃度為90％的乙醇水溶液；試劑D將10倍PCR反應緩沖液2.5μL、Taq DNA聚合酶1U、滅菌雙蒸水12μL混合制成；試劑E將10μM SEQ ID No1所述的核苷酸序列0.2μL，10μM SEQ ID No2所述的核苷酸序列0.2μL，10mM dNTPs 0.2μL，25mM MgCl21.5μL混合制成；試劑F對蝦白斑綜合癥病毒的基因組總DNA；試劑G滅菌雙蒸水；試劑H取50mL 20倍TBE電泳緩沖液，使其中含有0.09mol羥基甲基氨基甲烷-硼酸，2mmol乙二胺四乙酸制成；試劑I0.3瓊脂糖，使其中含溴化乙錠15μg。
實施例5一種對蝦白斑綜合癥病毒檢測試劑盒，由下述試劑組成試劑A將3g的十六烷基三甲基溴化胺加入100ml的水，使其中含有2.5M NaCl、30mM乙二胺四乙酸和30mM羥基甲基氨基甲烷-鹽酸，調節pH＝7.5制成；試劑B濃度為0.05g/mL的硅膠水溶液；試劑C體積百分濃度為60％的乙醇水溶液；試劑D將10倍PCR反應緩沖液5.0μL、Taq DNA聚合酶2.5U、滅菌雙蒸水18μL混合制成；試劑E將10μM SEQ ID No1所述的核苷酸序列1.0μL，10μM SEQ ID No2所述的核苷酸序列1.0μL，10mM dNTPs 0.8μL，25mM MgCl23.5μL混合制成；試劑F對蝦白斑綜合癥病毒的基因組總DNA；試劑G滅菌雙蒸水；試劑H取100mL 20倍TBE電泳緩沖液，使其中含有0.18mol羥基甲基氨基甲烷-硼酸，4mmol乙二胺四乙酸制成；試劑I0.6g瓊脂糖，使其中含溴化乙錠30μg。
權利要求
1.一種用于檢測對蝦白斑綜合癥病毒的引物序列，其特征是它由上游引物和下游引物組成，所述上游引物具有序列表中SEQ ID No1所述的核苷酸序列，所述下游引物具有序列表中SEQ ID No2所述的核苷酸序列。
2.一種對蝦白斑綜合癥病毒檢測試劑盒，其特征是由下述試劑組成試劑A將1-3g的十六烷基三甲基溴化胺加入100ml的水，使其中含有0.5-2.5M NaCl、10-30mM乙二胺四乙酸和10-30mM羥基甲基氨基甲烷-鹽酸，調節pH＝7.5制成；試劑B濃度為0.05g/mL-0.5g/mL的硅膠水溶液；試劑C體積百分濃度為60％-90％的乙醇水溶液；試劑D將10倍PCR反應緩沖液2.5-5.0μL、Taq DNA聚合酶1-2.5U、滅菌雙蒸水12-18μL混合制成；試劑E將10μM SEQ ID No1所述的核苷酸序列0.2-1.0μL，10μM SEQ ID No2所述的核苷酸序列0.2-1.0μL，10mM dNTPs 0.2-0.8μL，25mM MgCl21.5-3.5μL混合制成；試劑F對蝦白斑綜合癥病毒的基因組總DNA；試劑G滅菌雙蒸水；試劑H取50mL 20倍TBE電泳緩沖液，使其中含有0.09mol羥基甲基氨基甲烷-硼酸，2mmol乙二胺四乙酸制成；試劑I0.3-0.6g瓊脂糖，使其中含溴化乙錠15-30μg。
3.根據權利要求2所述的一種對蝦白斑綜合癥病毒檢測試劑盒，其特征是所述試劑A為將2g的十六烷基三甲基溴化胺加入100ml的水，使其中含有1.4M NaCl、20mM乙二胺四乙酸和20mM羥基甲基氨基甲烷-鹽酸，調節pH＝7.5制成；所述試劑B為濃度為0.3g/mL的硅膠水溶液；所述試劑C為體積百分濃度為75％的乙醇水溶液；所述試劑D為將10倍PCR反應緩沖液2.5μL、Taq DNA聚合酶1.25U、滅菌雙蒸水16.75μL混合制成；所述試劑E為將10μM SEQ ID No1所述的核苷酸序列0.5μL，10μM SEQ ID No2所述的核苷酸序列0.5μL，10mM dNTPs 0.5μL，25mM MgCl22.5μL混合制成；所述試劑I為0.3g瓊脂糖，使其中含溴化乙錠20μg。
4.根據權利要求2或3所述的一種對蝦白斑綜合癥病毒檢測試劑盒，其特征是所述對蝦白斑綜合癥病毒的基因組總DNA是用下述方法提取的用滅菌剪刀取已感染對蝦白斑綜合癥病毒的對蝦的鰓絲50-100mg，置于滅菌的1.5ml Eppendorf管內，加入150μL質量百分比為1％的十六烷基三甲基溴化胺水溶液，充分剪碎組織，加700μL質量百分比為1％的十六烷基三甲基溴化胺水溶液，25℃作用2h，加入600μL體積比為25∶24∶1的苯酚/氯仿/異戊醇，混勻30s，經12000r/m離心5min，取上層水相，加入700μL體積比為24∶1的氯仿/異戊醇，混勻30s，12000r/m離心5min，取上層水相，加入兩倍體積的-20℃無水乙醇，-20℃沉淀8-12小時，15000r/m離心30min，棄掉上清液，晾干，100ul滅菌雙蒸水溶解，-20℃保存。
全文摘要
本發明公開了一種用于檢測對蝦白斑綜合癥病毒的引物序列及檢測試劑盒，試劑盒組成是，試劑A十六烷基三甲基溴化胺加水，使含有NaCl、EDTA和Tris－HCl；試劑B硅膠水溶液；試劑C乙醇水溶液；試劑D將PCR反應緩沖液、Taq DNA聚合酶、滅菌雙蒸水混合；試劑E將SEQ ID No1、SEQ ID No2序列，dNTPs，MgCl
文檔編號C12Q1/68GK1944666SQ200610016169
公開日2007年4月11日 申請日期2006年10月19日 優先權日2006年10月19日
發明者孫金生, 薛淑霞, 劉爽 申請人:天津市水產研究所