專利名稱：畢赤酵母ω3－脂肪酸脫氫酶啟動子序列及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，特別是一種從畢赤酵母中分離的ω3-脂肪酸脫氫酶啟動子序列及其應用。從畢赤酵母總DNA中克隆出這一ω3-脂肪酸脫氫酶啟動子，并與不同的表達載體連接，轉化不同的微生物，使其轉基因微生物表達其下游基因的方法和應用。
背景技術：
PUFAs(polyunsaturated fatty acids)是以多種形式存在于細胞中，如細胞膜、儲存脂、甘油三脂、鞘脂和脂蛋白等，在細胞內行使不同的生物學功能。PUFAs主要有兩大類，n-6和n-3，它們是分別以亞油酸(Linoleic acid，LA表示為18:29，12n-6)和α-亞麻酸(α-Linolenic acid，ALA表示為18:3Δ9，12，15n-3)為底物合成的。兩類不飽和脂肪酸在生物體內不僅代謝途徑不同，而且有著不同的生物活性，例如在n-6類PUFA中LA是神經酰氨的重要組成成分；AA是類花生酸的前體，類花生酸包括白細胞三烯、前列腺素和凝血烷等功能激素，這些激素參與一些生理和病理過程，如分娩起始，血小板聚集，腎臟的電解質調節，胚細胞移植及免疫細胞的激活；n-6PUFA還可能在細胞間信號傳導方面充當第二信使的作用。而在n-3類PUFA除了為代謝過程提供能量和碳原子外，EPA和DHA也可以作為類花生酸的前體，但是與AA衍生的類花生酸相比，只是在EPA和DHA含量很高的組織內才能形成相當數量的這些激素類物質，因此可能只是起到了一些抗炎的作用；DHA在維持視網膜和神經組織的細胞膜功能方面起到非常重要的功能。視網膜和神經組織中如果缺乏n-3PUFAs則會被22:5n-6代償性的替代，這樣的微小改變會足以引起記憶的喪失和視力的損壞。
在大部分真菌和植物體內，n-6類不飽和脂肪酸都是經ω3-脂肪酸脫氫酶催化脫氫生成n-3類不飽和脂肪酸的，所以ω3-脂肪酸脫氫酶是n-3類高不飽和脂肪酸合成過程的限速酶，因此受到多個水平的調節，例如底物或產物水平調節，溫度調節，細胞調控因子調節等等，而且這些調節都是通過直接或間接的與其上游啟動子相互作用來實現的。雖然目前已從多種生物體內克隆到ω3-脂肪酸脫氫酶基因序列，但對其啟動子序列的克隆和分析尚未見報道。
發明內容
本發明的目的是提供一種從畢赤酵母中分離的ω3-脂肪酸脫氫酶啟動子序列及其應用。本發明在于轉基因微生物中使其外源基因的表達，畢赤酵母中ω3-脂肪酸脫氫酶的表達調控和菌體內α-亞麻酸的含量調節。因此，本發明對改良轉基因微生物品質來生產藥用α-亞麻酸和高不飽和脂肪酸非常有用。
本發明提供從畢赤酵母中分離的ω3-脂肪酸脫氫酶啟動子核苷酸序列，具體講是畢赤酵母ω3-脂肪酸脫氫酶啟動子核苷酸序列及其應用。將該啟動子下游銜接其它外源基因，并與不同的表達載體連接，轉化到微生物中，表達其下游基因的方法和應用。
本發明的目的是提供含有該啟動子核苷酸序列與其它外源基因連接，構建功能性表達的表達載體。
本發明的另一個目的是提供含有該啟動子核苷酸序列或該啟動子核苷酸序列與其它外源基因連接的表達載體轉化宿主細胞或宿主孢子及其后代。
本發明的另一個目的是提供一種用含有該啟動子核苷酸序列或該啟動子核苷酸序列與其它外源基因連接的表達載體轉化宿主細胞或宿主孢子及其后代細胞，并以此來進行轉基因微生物品質改良來生產藥用α-亞麻酸和高不飽和脂肪酸等。
本發明提供的畢赤酵母ω3-脂肪酸脫氫酶啟動子序列包括(1)具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列；或(2)與(1)所述的核苷酸序列互補的核苷酸序列；或(3)與(1)或(2)的核苷酸序列具有基本序列同源性的核苷酸序列；或(4)是(1)、(2)或(3)的核苷酸序列的類似物的核苷酸序列；或(5)與(1)、(2)、(3)或(4)的核苷酸序列，在雜交條件下雜交的核苷酸序列。
本發明的第二方面，提供了含有上述核苷酸序列與質粒載體所構建的重組表達載體。如表達載體pYEPppw3P。
本發明提供一種基因工程化的宿主細胞，它是選自1)用所述的核苷酸序列轉化或轉導的宿主細胞；2)用所述的重組表達載體轉化或轉導的宿主細胞。所述的宿主細胞是微生物宿主細胞的后代、蛋白質組成已經改變的微生物細胞。所述的微生物是大腸桿菌或釀酒酵母。
所述的宿主細胞是釀酒酵母細胞。
本發明提供了一種用含有該啟動子核苷酸序列或該啟動子核苷酸序列與其它外源基因連接的表達載體轉化的宿主細胞及其后代細胞來進行轉基因微生物蛋白質組成改良來生產藥用α-亞麻酸和高不飽和脂肪酸等。
本發明所述的在微生物細胞中表達ω3-脂肪酸脫氫酶啟動子的方法，包括下述步驟1)將含有上述核苷酸序列的表達載體載體導入微生物細胞。
2)使所述的微生物細胞生長形成菌體細胞。
本發明可用于生產人類食品、動物飼料、化妝品或藥品。
本發明所述的畢赤酵母ω3-脂肪酸脫氫酶啟動子序列的分離方法包括下述步驟1)提取畢赤酵母總DNA，將基因組用SalI單酶切。
2)以深黃被孢霉(Mortierella isabellina)Δ6-脂肪酸脫氫酶開放閱讀框架雙酶切(BamHI&SalI)所得片段(663bp-1090bp，SEQ ID NO2)作為接頭，將酶切后基因組和接頭按摩爾比1∶3的比例進行過夜連接。
3)設計并合成如下三條引物引物1GAACTCCTCA GCGGTGTATG GAACAAAGAC引物2ATGACCTGTT GCCTTATGAT GC引物3GGCGATTGT GTTCTCGCTC
4)以連接產物為模板，進行PCR反應反應組分 加入量緩沖液(10×)(含20mmol/L MgCl2)5μldNTP(2.5mmol/L)2μl引物1(1μmol/L)2μl引物2(1μmol/L)2μlTaq(5u/μl)0.5μlH2O 36.5μl模板DNA(0.1μg/μl)1μl總體積 50μl擴增條件94℃5min；94℃30s，56℃1min，72℃2min，共30個循環；72℃10min。
5)以PCR產物100倍稀釋作為模板，以引物1、3，作為引物，如上體系，如上條件進行PCR。
6)回收PCR片段，亞克隆到測序載體；再轉化到大腸桿菌感受態細胞，在含氨芐青霉素，終濃度為50-100μg/ml的LB(Luria-Bertani)固體培養基上培養過夜；挑取平板上生長的白色菌落，接入含氨芐青霉素的LB液體培養基中培養過夜，離心收集菌體按堿裂解法提取質粒，經NcoI和SacI雙酶切鑒定和PCR擴增鑒定陽性克隆。
7)對陽性克隆質粒進行測序，確證啟動子片段。
本發明中所述的核苷酸序列可以是其中一個或多個核苷酸發生取代、缺失、插入、倒位的核苷酸序列，即原始分離序列的人工突變體，它還具有它的啟動子功能。還可以是所述的核苷酸序列與其它的啟動子序列的融合序列。
本發明中所述的其它外源基因是指任何一段核苷酸序列，并具有編碼某種蛋白質或其它活性物質功能的，包括RNA或DNA序列，該序列與ω3-脂肪酸脫氫酶啟動子正常情況不相結合。此核苷酸序列包括不同于啟動子的微生物種類得到的異源核苷酸序列，以及從相同于啟動子的微生物種類得到的同源核苷酸序列，但這些序列與野生型(非轉基因)微生物的啟動子無關。
本發明中所述的表達載體是指現有技術中已知的、能夠在微生物中進行表達的任何一種載體，例如pYES2.0、pYEP356等。
本發明中所述的轉化是指現有技術中已知的、能夠將外源基因導入微生物細胞或微生物孢子的任何轉化方法，如細胞電脈沖轉化法等。
本發明中所述的宿主細胞或及其后代細胞是指所有微生物細胞或微生物孢子或由這些細胞或孢子繁殖的微生物體。
術語“核苷酸序列”指含有天然存在的堿基，糖和糖之間(支鏈)的鍵的核苷酸或核苷單體的序列。該序列也包括含有發揮相似功能的非天然存在的單體或其部分的修飾的或取代的序列。是指寡核苷酸、核苷酸或多核苷酸及其片段或部分，也可也指基因組或合成的DNA，它們可以是單鏈或雙鏈，代表有義。
術語“ω3-脂肪酸脫氫酶啟動子”是指在啟動子控制下表達的基因在有或沒有基本表達的微生物細胞中優先表達。
術語“具有基本序列同源性的序列”是指與(1)具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列或(2)與(1)具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列互補的核苷酸序列之中的序列相比有輕微的或無關緊要的序列變化的那些核苷酸序列，這些序列以基本相同的方式發揮作用并且能夠驅動其下游基因的表達。這些變化可能是由于局部的突變或結構上的修飾。
術語“雜交的序列”是指可以在嚴格雜交條件下與所述的核苷酸序列(1)、(2)、(3)或(4)之中的序列雜交的核苷酸序列。“嚴格雜交條件”是指本領域技術人員已知的，或者可以在《分子克隆實驗指南》(J.薩姆布魯克、E.F.弗里奇、T.曼尼阿蒂斯編著，科學出版社，第二版，1993)中的通用方案中找到。
本發明克隆的畢赤酵母ω3-脂肪酸脫氫酶基因啟動子是首次克隆到的畢赤酵母ω3-脂肪酸脫氫酶基因啟動子，而且是這一啟動子的ω3-脂肪酸脫氫酶啟動子活性的功能驗證。本發明在于轉基因微生物中使其外源基因的表達，避免了外源基因在其它部位持續表達所帶來的不利影響。因此，本發明對轉基因微生物來生產藥用蛋白非常有用。這一啟動子的研究和開發，對今后轉基因植物，轉基因微生物具有重大應用前景。
圖1釀酒酵母表達載體pYEPpp3示意圖。
圖2釀酒酵母重組表達載體pYEPppw3P示意圖。
圖3A、顯示α-亞麻酸甲基酯標準物的氣相色譜圖。
圖3B、含pYEPppw3載體的轉基因酵母的氣相色譜圖。
圖3C、含重組質粒pYEPppw3P的轉基因酵母的氣相色譜圖。
具體實施例方式
實施例1.畢赤酵母ω3-脂肪酸脫氫酶基因啟動子序列(ppw3P)的分離提取畢赤酵母總DNA，將基因組用SalI單酶切。以深黃被孢霉(Mortierellaisabellina)Δ6-脂肪酸脫氫酶開放閱讀框架雙酶切(BamHI&SalI)所得片段(663bp-1090bp，SEQ ID NO2)作為接頭，將酶切后基因組和接頭按摩爾比1∶3的比例進行過夜連接。設計并合成如下三條引物引物1GAACTCCTCA GCGGTGTATG GAACAAAGAC引物2ATGACCTGTT GCCTTATGAT GC引物3GGCGATTGT GTTCTCGCTC以連接產物為模板，進行PCR反應反應組分 加入量緩沖液(10×)(含20mmol/L MgCl2)5μldNTP(2.5mmol/L)2μl引物1(1μmol/L)2μl引物2(1μmol/L)2μlTaq(5u/μl)0.5μlH2O 36.5μl模板DNA(0.1μg/μl)1μl總體積 50μl擴增條件94℃5min；94℃30s，56℃1min，72℃2min，共30個循環；72℃10min。
以PCR產物100倍稀釋作為模板，以引物1、3，作為引物，如上體系，如上條件進行PCR。回收PCR片段，亞克隆到測序載體；再轉化到大腸桿菌感受態細胞，在含氨芐青霉素，終濃度為50-100μg/ml的LB固體培養基上培養過夜；挑取平板上生長的白色菌落，接入含氨芐青霉素的LB液體培養基中培養過夜，離心收集菌體按堿裂解法提取質粒，經NcoI和SacI雙酶切鑒定和PCR擴增鑒定陽性克隆。對陽性克隆質粒進行測序，得到含有潛在啟動子序列(SEQ ID NO1，392-779)的ω3-脂肪酸脫氫酶的上游序列(SEQ ID NO1)。
實施例2釀酒酵母重組表達載體的構建根據SEQ ID NO1，392-779所示序列，設計出基因特異性擴增引物(引物5和6)分離其潛在啟動子序列引物45-GGCAAGCTTATGTCAAAAGTCACTGTTTCGGG-3`；引物55`GCCTCTAGATTAGGTATCC TTAGG-3`；引物65`-GGCGGTACCGCCGAAGAAAGTAGAAGAGAAG-3`引物4和5的5`端黑體分別含有HindIII和XbaI酶切位點，用于分離ω3-脂肪酸脫氫酶的開放閱讀框架(ppw3)。引物6和5的5`端黑體分別含有KpnI和XbaI酶切位點，用于分離ω3-脂肪酸脫氫酶的開放閱讀框架及其潛在的啟動子序列(ppw3p)。所用的擴增條件和反應組分同上，然后分別取50μl PCR產物和1μl pYEP356分別進行雙酶切，回收酶切大片段，并用T4連接酶在4度冰箱中過夜連接。連接產物轉化大腸桿菌DH5α，通過質粒提取和PCR篩選陽性克隆，并進行測序鑒定。質粒構建結果見附圖2和3，所構建的含有ω3-脂肪酸脫氫酶基因的開放閱讀框架酵母表達質粒命名為pYEPppw3。該質粒是由pYEP356和引物4和引物5的PCR產物構建而成。質粒和分別經HindIII和XbaI雙酶切后，電泳回收純化，經T4DNA Ligase連接，連接產物轉化大腸桿菌DH5α，篩選鑒定出重組質例，命名為pYEPppw3。所構建的含有ω3-脂肪酸脫氫酶基因的開放閱讀框架及其潛在的啟動子序列的酵母表達質粒命名為pYEPppw3p。該質粒是由pYEP356和引物6和引物5的PCR產物構建而成。質粒和分別經KpnI和XbaI雙酶切后，電泳回收純化，經T4DNA Ligase連接，連接產物轉化大腸桿菌DH5α，篩選鑒定出重組質粒，命名為pYEPppw3p。
實施例3電擊介導的重組質粒釀酒酵母轉化將釀酒酵母菌株INVSc1從甘油管中劃線接種于YEPD平板上，30℃培養48h進行活化；挑取單菌落于5ml YEPD液體培養基中，30℃、250rpm振蕩過夜培養；檢測菌液的OD600值，取適量菌液稀釋于50ml YEPD液體培養基中，使OD600＝0.4，繼續培養2-4h2500rpm離心沉淀細胞，去上清，加50ml提前冰浴的無菌水離心洗滌兩次，冰浴的1mol/L山梨醇離心洗滌兩次；2ml 1mol/L山梨醇重懸細胞重懸細胞，并以100μl/管分裝，至于冰上盡快使用。在100μl感受態酵母細胞中加入10μg重組表達質粒輕柔混勻；設置MicroPulser到“ScaI”擋，參數為Voltage 2.0kV，Number of pulses1；將質粒和酵母細胞混合液轉入提前冰浴的0.2cm電擊杯中，使液體盡量流到管底，至于電轉化儀上進行電擊；取下電擊杯；立即加入1ml冰浴的1mol/L山梨醇并涂布于SC-Ura(無尿嘧啶)選擇性固體培養基(含2％的葡萄糖)上，置30℃培養48h或直至轉化子出現實施例5酵母工程菌的誘導表達挑取SC-Ura(無尿嘧啶)選擇培養基平板上出現的陽性轉化，接種于15ml SC-Ura選擇培養基(含2％的葡萄糖)，28℃搖菌過夜培養，以5％的接種量加入含有2％的葡萄糖的100ml SC-Ura培養基，28℃繼續培養72h；2500rpm收集菌體，用去離子水洗滌三次，50℃烘干，研碎，取100mg加入5ml 5％的KOH-CH4OH溶液，70℃反應2-3h；反應結束，冷卻到室溫，用6mol/L的鹽酸調節溶液的pH值到2.0，加入4ml 14％BF3-CH3OH，70℃反應1.5h，合成脂肪酸甲酯；再加入飽和的NaCl溶液10ml，劇烈震蕩混勻，并轉移到分液漏斗中，用8ml 1∶4的氯仿∶己烷抽提兩次，合并提取液；加入適量無水Na2SO4干燥提取液，靜置1h，去掉Na2SO4，把含有脂肪酸甲酯的上清液用氮氣吹干，用200μL的正己烷回溶樣品，后用0.45mm的微孔濾膜過濾。
實施例6脂肪酸氣相色譜分析按如下條件進行儀器為島津GC-7A，柱子彈性石英毛細管柱，0.32×30m，固相支持物聚二乙二醇丁二酸酯(Poly-diethylene glycol succinate，DEGS)鍍膜物聚酰亞胺。載氣N2，線速10cm/s。分流比100∶1，氣化室溫度250℃，柱溫180℃，尾吹50ml/min，檢測器氫火焰離子化檢測器。以Sigma公司生產的LA甲酯為標準品，把上述方法制備的脂肪酸甲酯化的樣品，進行GC分析，上樣量為1μl；分析軟件Anstar，分析之星色譜工作站。
色譜分析結果見附圖4，附圖4顯示亞油酸甲基酯標準物(4A)、含pYEPppw3載體的轉基因酵母(4B)和含重組質粒pYEPppw3p的轉基因酵母(4C)的氣相色譜圖。通過與已知的脂肪酸甲基酯標準物的保留時間進行比較鑒別出各個峰。圖4C中保留時間為14.76min對應的峰即為畢赤酵母ω3-脂肪酸脫氫酶催化油酸產生的亞油酸，而圖4B中沒有相應的峰出現。由此可知，所分離的ω3-脂肪酸脫氫酶的上游序列具有啟動子活性。
序列列表 SEQUENCE LISTING<110>南開大學<120>畢赤酵母ω3-脂肪酸脫氫酶啟動子序列及其應用<130>2006 07 21<160>2<170>Patentln version 3.3<210>1<211>780<212>DNA<213>畢赤酵母(Pichia pastoris)<400>1gtcgacattg tcaagcgaag aagattacta aacattttca ctgagcatgt agtcacactg60tcttgcaatg cttatggatc acacattatg gacaaattat ggcaattctc catcaagttg120aatctcttca aagacagaat tgcactggct ctgtttgaaa acaaagacaa aatcaaggac180agcatctatg gaaaacttgt ttggaagaac tggtctatgg agttatattg ccgaagaatg240tatgactgga aaaatcttat aaaacagcag gagttggagc ttttccccga tcatagagga300gctccaactc tcttgaagaa aaggccccta gaagagccga agaaagtaga agagaagaag360gacaaaagta gaggacgtag aagatatcat tagaagtaaa ttaatatata attgttatta420taattgtgct tttttatagg gtcctttgaa gtaatgggcg agctctattg tacccaaaat480ctggggatga accaaattac acgtaaaacc tatacaactt ttaatttcta tttccaacca540aaaatgtcat atttgacggc aacacgttca agtcaccaca agaaagtctc ctagagtgta600atacaccttt agtattttaa taatataatg gccaataata aaagcctaat acctatcact660
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權利要求
1.一種分離的畢赤酵母ω3-脂肪酸脫氫酶啟動子序列，其特征在于它包括(1)具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列；或(2)與(1)所述的核苷酸序列互補的核苷酸序列；或(3)與(1)或(2)的核苷酸序列具有基本序列同源性的核苷酸序列；或(4)是(1)、(2)或(3)的核苷酸序列的類似物的核苷酸序列；或(5)與(1)、(2)、(3)或(4)的核苷酸序列，在雜交條件下雜交的核苷酸序列。
2.一種重組表達載體，其特征在于它是由權利要求1所述的核苷酸序列與質粒載體所構建的重組表達載體。
3.按照權利要求3所述的重組表達載體，其特征在于它是pYEP356w3。
4.一種基因工程化的宿主細胞，其特征在于它是選自1)用權利要求1所述的核苷酸序列轉化或轉導的宿主細胞；2)用權利要求2所述的重組表達載體轉化或轉導的宿主細胞。
5.按照權利要求4所述的宿主細胞，其特征在于所述的宿主細胞是微生物宿主細胞的后代或蛋白質組成已經改變的微生物細胞。
6.按照權利要求5所述的宿主細胞，其特征在于所述的宿主細胞是釀酒酵母。
7.一種在微生物細胞中表達權利要求書1所述的ω3-脂肪酸脫氫酶啟動子的方法，其特征在于它的步驟包括1)將權利要求書3所述的重組載體導入微生物細胞；2)使所述的微生物細胞生長形成菌體細胞。
8.按照權利要求7所述的方法，其特征在于所述的微生物是大腸桿菌或釀酒酵母。
9.權利要求書1所述的畢赤酵母ω3-脂肪酸脫氫酶啟動子序列的分離方法，其特征在于它包括下述步驟1)提取畢赤酵母總DNA，將基因組用SalI單酶切；2)以深黃被孢霉(Mortierella isabellina)Δ6-脂肪酸脫氫酶開放閱讀框架雙酶切(BamHI&SalI)所得片段(663bp-1090bp，SEQ ID NO2)作為接頭。將酶切后基因組和接頭按摩爾比1∶3的比例進行過夜連接；3)設計并合成如下三條引物引物1GAACTCCTCA GCGGTGTATG GAACAAAGAC引物2ATGACCTGTT GCCTTATGAT GC引物3GGCGATTGT GTTCTCGCTC4)以連接產物為模板，進行PCR反應反應組分加入量緩沖液(10×)(含20mmol/L MgCl2)5μldNTP(2.5mmol/L) 2μl引物1(1μmol/L) 2μl引物2(1μmol/L) 2μlTaq(5u/μl) 0.5μlH2O 36.5μl模板DNA(0.1μg/μl) 1μl總體積 50μl擴增條件94℃5min；94℃30s，56℃1min，72℃2min，共30個循環；72℃10min；5)以PCR產物100倍稀釋作為模板，以引物1、3，作為引物，如上體系，如上條件進行PCR；6)回收PCR片段，亞克隆到測序載體；再轉化到大腸桿菌感受態細胞，在含氨芐青霉素，終濃度為50-100μg/ml的LB固體培養基上培養過夜；挑取平板上生長的白色菌落，接入含氨芐青霉素的LB液體培養基中培養過夜，離心收集菌體按堿裂解法提取質粒，經NcoI和SacI雙酶切鑒定和PCR擴增鑒定陽性克隆；7)對陽性克隆質粒進行測序，確證啟動子片段。
10.權利要求1所述的畢赤酵母ω3-脂肪酸脫氫酶啟動子序列用于生產人類食品、動物飼料、化妝品或藥品。
全文摘要
本發明涉及一種從畢赤酵母中分離到的ω3－脂肪酸脫氫酶啟動子序列及其應用。本發明包括具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。本發明包括利用該啟動子序列來改變微生物細胞蛋白質成分的微生物基因工程方法，更具體的說，在這一啟動子下游銜接異源或同源基因，并構建到微生物表達載體，轉化宿主微生物，在其細胞中表達目的蛋白，實現品質改良或藥用用途。本發明克隆畢赤酵母的ω3－脂肪酸脫氫酶基因啟動子對今后所有轉基因微生物的研究具有重大應用前景。
文檔編號C12N1/19GK1966688SQ200610015658
公開日2007年5月23日 申請日期2006年9月14日 優先權日2006年9月14日
發明者李明春, 張昕欣, 魏東盛, 邢來君, 周皓 申請人:南開大學