專利名稱：中國荷斯坦牛紅毛基因快速檢測方法及檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及基因快速檢測方法及檢測試劑盒，尤其涉及中國荷斯坦牛紅毛基因的快速檢測方法及檢測試劑盒。
背景技術：
牛的毛色是品種的重要特征之一，其種類較多，且與乳、肉等生產性能有直接的關系。牛的毛色主要是由皮膚與毛發中的真黑色素(褐與黑)與偽黑色素(紅與黃)的相對數量與分布情況所決定的。現有研究表明牛黑素皮質素受體1基因(melanocortin-1-receptor gene，MC1R)是奶牛黑白花和紅白花形成過程中的主效基因。牛MC1R基因在黑色素細胞中表達，與天然配體α-促黑素細胞激素(α-MSH)相互作用，經由G蛋白耦合的cAMP信號通路，調節黑色素細胞內的一系列級聯反應，最終經多巴或多巴胺合成各自的衍生物-褐黑素或真黑色素，使動物呈現不同的毛色或羽色。
牛MC1R基因定位在第18號染色體，長954bp，編碼317個氨基酸，主要存在3個等位基因(ED，E+，e)。ED在T296C的置換突變，在表型上主要表現黑色毛色；E+為野生型基因，表現各種毛色；e為隱性基因，表現或強或弱的紅毛表型。
中國荷斯坦牛是我國產奶量最高、數量最多，分布最廣的乳牛品種，毛色以黑白花為主，偶爾出現紅白花。因此，通常人們以毛色為黑白花的牛作為純種牛的特征，由于過度追求品種毛色的統一性，紅白花牛被當作不受歡迎的個體，牛場主不希望出現紅白花牛，當牛場中出現紅白花牛，牛場主就悄悄淘汰掉，以免買主對其牛群純度懷疑，影響其銷售和收入。鑒于此，有必要建立一種對中國荷斯坦牛紅毛基因的快速檢測方法，利用對奶牛紅毛基因進行檢測，不僅有助于優秀種公牛純度鑒別，避免由此引起的一些經濟糾紛，而且對優化我國奶牛育種技術體系具有重要作用。
發明內容
針對現有技術的不足，本發明要解決問題是利用PCR-RFLP技術和DNA測序技術建立一種中國荷斯坦牛紅毛基因快速檢測方法，并進一步細化制備出應用試劑盒，為優質種公牛純度鑒別及奶牛育種提供方便。
本發明所述中國荷斯坦牛紅毛基因的檢測方法，包括牛血樣品采集(ACD抗凝)，提取基因組DNA，設計特異性引物，PCR擴增，限制性內切酶消化，凝膠電泳之步驟；其特征在于所述特異性引物序列是15’-CATCCCTGACGGGCTCTTTCTC-3’，25’-AGCACCTCTTGGAGCGTCTTCC-3’；所述PCR擴增的反應體系為15μL，其中含有基因組DNA 100ng，引物0.2mM，dNTPs 0.2mM，MgCl21.5mM，Taq酶1U；所述PCR擴增的條件為95℃預變性5min，然后94℃變性30s，62℃復性30s，72℃延伸30s，35個循環，最后72℃延伸7min；所述限制性內切酶消化用等量的限制性內切酶MspI和限制性內切酶MspA1I。
本發明所述中國荷斯坦牛紅毛基因快速檢測試劑盒，其特征在于包括PCR試劑盒、RFLP試劑盒兩部分，其中PCR試劑盒包括10×buffer，由100mM Tris-HCl，500mM KCl組成；2.0mM dNTPs；10mM上下游引物；15mM Mg2+；dd H2O；5U/μLTaq酶；保存溫度-20℃；
上述PCR體系為10×buffer 1.5μL；dNTPs 1.5μL；上下游引物MC1R2-F5’-CATCCCTGACGGGCTCTTTCTC-3’，MC1R2-R5’-AGCACCTCTTGGAGCGTCTTCC-3’各0.3μL；Mg2+1.5μL；dd H2O 8.4μL，Taq酶1U，DNA 100ng；RFLP試劑盒包括10U/μL限制性內切酶MspI；10U/μ L限制性內切酶MspA1I；dd H2O；Buffer，由330mM Tris-Ac pH7.9，100mM Mg-Ac，5mM Dithiothreitol，660mMK-Ac組成；0.1％BSA；保存溫度-20℃；上述RFLP體系為10U/μL限制性內切酶MspI 1μL；10U/μL限制性內切酶MspA1I1μL；dd H2O 6μL；Buffer 2μL；0.1％BSA 2μL；PCR產物8μL。
以往對動物毛色的研究多集中在色素的量上，方法繁瑣，定量困難，準確度不高，且難以大范圍操作；本發明利用PCR-RFLP技術和DNA測序技術在基因水平上進行操作，并且成功建立了適于對奶牛紅毛基因進行快速檢測方法以及檢測試劑盒，不僅方法簡便、快速、價格低廉，而且結果準確、可靠；經實驗證明本發明方法對紅毛基因的檢出率可達100％，為優質種公牛純度鑒別及奶牛育種提供了有力的手段，對優化我國奶牛育種技術體系，保證牛群種質，保持奶業的可持續發展，具有重要意義。
圖1MC1R 3個等位基因的基因型。
其中PCR產物用MspA1I(左邊)和MspI(右邊)酶切后在2％的瓊脂糖凝膠上電泳。
圖2中國4品種牛典型序列以及NCBI上已發表的MC1R基因序列比對。
其中中國荷斯坦紅白花牛和魯西黃牛310位置缺失了G；渤海黑牛存在T296C的置換突變；所有所測序牛編碼區725位置都為C，而NCBI上序列都為A。
具體實施例方式
1.牛血樣品采集對牛進行頸靜脈采血，加ACD抗凝(血液∶ACD＝6∶1)。共采集血樣420份，包括中國荷斯坦黑白花牛共160份采自山東冷水溝奶牛場120頭，山東農科院奶牛中心40頭；中國荷斯坦紅白花牛共20份，采自山東冷水溝奶牛場8份，天津4份，北京8份；魯西黃牛共124份采自山東唐王牛場；渤海黑牛共116份采自濱州牛場。采樣方式為隨機抽樣。
2.血液DNA提取根據常規苯酚氯仿法提取牛血液基因組DNA。
3.引物設計引物序列為MC1R2-F5’-CATCCCTGACGGGCTCTTTCTC-3’MC1R2-R5’-AGCACCTCTTGGAGCGTCTTCC-3’4.利用本發明所述中國荷斯坦牛紅毛基因快速檢測試劑盒進行實驗(1)PCR擴增反應反應體系為15μL，其中含有基因組DNA約100ng，引物0.2mmol/L，dNTPs0.2mmol/L，MgCl21.5mmol/L，Taq酶1U。
PCR擴增條件為95℃預變性5min；然后35個循環94℃變性30s，62℃復性30s，72℃延伸30s。最后72℃延伸7min。
(2)限制性內切酶消化反應體系為20μL，其中限制性內切酶MspI 1μL，限制性內切酶MspA1I 1μL，dd H2O 6μL，Buffer2μL，0.1％BSA 2μL，PCR產物8μL。
(3)凝膠電泳檢測用2％瓊脂糖凝膠電泳，80V，1.5h，凝膠成像系統照相，分析圖形(見圖1)。
(4)PCR-RFLP檢測結果MspI酶切E/E得到328bp、249bp、192bp的片段；E/e到519bp、328bp、249bp、192bp的片段；e/e到519bp、249bp的片段(圖1右面)。
當瓊脂糖凝膠電泳圖出現Marker右一條帶情況者即為紅毛表型；出現Marker右二情況者為紅毛基因攜帶者(不表現紅毛表型)。
MspA1I酶切ED/ED得到593bp、229bp的片段；ED/E+得到593bp、229bp、181bp的片段；E+/E+得到593bp、181bp的片段(圖1左面)。
上述RFLP體系為10U/μL限制性內切酶MspI 1μL；10U/μL限制性內切酶MspA1I1μL；dd H2O 6μL；Buffer 2μL；0.1％BSA 2μL；PCR產物8μL。
5.DNA序列分析用高保真DNA聚合酶擴增產物，產物用SmaI酶切后與同時用SmaI酶切的pUC18載體連接，藍白斑篩選出重組子，取陽性克隆送上海生工測序。分別檢測4頭中國荷斯坦黑白花牛、中國荷斯坦紅白花牛、魯西黃牛、渤海黑牛MC1R基因序列。
6.測序結果所得序列比對分析發現MC1R基因存在2個突變位點，ED基因存在T296C的置換突變，導致99位亮氨酸到脯氨酸的突變，在表型上主要表現黑色毛色。隱性的e基因在310處缺失一個堿基G，造成移碼突變，在468處提前終止翻譯，翻譯出一個縮短了的失去功能的MC1R蛋白表現或強或弱的紅色毛色。
值得一提的是MC1R編碼區725位置在所測序牛中都為C，而GenBank上發表序列為A(如圖2)。
權利要求
1.一種中國荷斯坦牛紅毛基因的檢測方法，包括牛血樣品采集，提取基因組DNA，設計特異性引物，PCR擴增，限制性內切酶消化，凝膠電泳之步驟；其特征在于所述特異性引物序列是15’-CATCCCTGACGGGCTCTTTCTC-3’，25’-AGCACCTCTTGGAGCGTCTTCC-3’；所述PCR擴增的反應體系為15μL，其中含有基因組DNA 100ng，引物0.2mM，dNTPs 0.2mM，MgCl21.5mM，Taq酶1U；所述PCR擴增的條件為95℃預變性5min，然后94℃變性30s，62℃復性30s，72℃延伸30s，35個循環，最后72℃延伸7min；所述限制性內切酶消化用等量的限制性內切酶MspI和限制性內切酶MspAlI。
2.一種中國荷斯坦牛紅毛基因快速檢測試劑盒，其特征在于包括PCR試劑盒、RFLP試劑盒兩部分，其中PCR試劑盒包括10×buffer，由100mM Tris-HCl，500mM KCl組成；2.0mM dNTPs；10mM上下游引物；15mM Mg2+；dd H2O；5U/μL Taq酶；保存溫度-20℃；上述PCR體系為10×buffer 1.5μL；dNTPs 1.5μL；上下游引物MC1R2-F5’-CATCCCTGACGGGCTCTTTCTC-3’，MC1R2-R5’-AGCACCTCTTGGAGCGTCTTCC-3’各0.3μL；Mg2+1.5μL；dd H2O 8.4μL，Taq酶1U，DNA 100ng；RFLP試劑盒包括10U/μL限制性內切酶MspI；10U/μL限制性內切酶MspAlI；dd H2O；Buffer，由330mM Tris-Ac pH7.9，100mM Mg-Ac，5mM Dithiothreitol，660mMK-Ac組成；0.1％BSA；保存溫度-20℃；上述RFLP體系為10U/μL限制性內切酶MspI 1μL；10U/μL限制性內切酶MspAlI1μL；dd H2O 6μL；Buffer 2μL；0.1％BSA 2μL；PCR產物8μL。
全文摘要
本發明公開了一種中國荷斯坦牛紅毛基因的檢測方法，包括牛血樣品采集，提取基因組DNA，設計特異性引物，PCR擴增，限制性內切酶消化，凝膠電泳之步驟；其中所述引物是15’－CATCCCTGACGGGCTCTTTCTC－3’，25’－AGCACCTCTTGGAGCGTCTTCC－3’；所述PCR擴增的條件為95℃預變性5min，然后94℃變性30s，62℃復性30s，72℃延伸30s，35個循環，最后72℃延伸7min；所述限制性內切酶消化用等量的限制性內切酶MspI和限制性內切酶MspAlI。本發明還同時公開了紅毛基因快速檢測試劑盒，包括PCR試劑盒、RFLP試劑盒兩部分。本發明方法簡便、快速，而且結果準確、可靠，為優質種公牛純度鑒別及奶牛育種提供了有力的手段，對優化我國奶牛育種技術體系，保證牛群種質，保持奶業的可持續發展，具有重要意義。
文檔編號C12Q1/68GK101016563SQ200610070569
公開日2007年8月15日 申請日期2006年12月4日 優先權日2006年12月4日
發明者李秋玲, 李建斌, 王洪梅 申請人:山東奧克斯生物技術有限公司