專利名稱：人G209A突變型α－synuclein轉基因SH－SY5Y細胞的制作方法
技術領域：
本發明涉及我國抗帕金森氏病(Parkinson’s Disease)藥物篩選及評價平臺的建立。該平臺以基因克隆技術和轉基因技術為支持，在體外模擬病變巴胺能神經元，可用于篩選抗帕金森氏病藥物候選化合物和先導化合物，并可對藥物進行藥理學評價及深入的機制研究。
背景技術：
帕金森氏病又稱震顫麻痹(paralysis agitants)，是一種選擇性中腦黑質多巴胺能神經元喪失和紋狀體多巴胺含量顯著減少的神經系統退行性疾病，是中老年人最常見的中樞神經系統變性疾病之一，其發生是遺傳易感性與環境有害因子協同作用的結果。由于對其發病機理尚未明了，至今為止對本病均系對癥治療，尚無根治方法可以使神經細胞變性恢復。
目前已發現若干與PD有關的基因，其中α-synuclein基因及其蛋白在PD中起關鍵作用。α-synuclein基因第209位核苷酸G被A取代(G209A)，導致所編碼的氨基酸序列中第53位丙氨酸被蘇氨酸取代(A53T)，這種突變發生于家族遺傳性PD患者中。研究證明突變蛋白相對于正常蛋白更易于聚集，而α-synuclein的積聚增加與多巴胺神經元的丟失密切相關，許多科學家運用轉基因的方法對α-synuclein在PD發病機制中的作用進行了較深入的研究。2000年Masliah研究小組將人的野生型α-synuclein基因轉入小鼠的胚胎干細胞，發現所產生的轉基因小鼠的腦皮質、海馬和中腦黑質神經元中存在含α-synuclein蛋白的包涵體。同時，Feany和Bender在將人野生型和突變型α-synuclein基因轉入果蠅后，發現這些果蠅不但出現運動行為障礙，而且有多巴胺神經元選擇性變性和死亡，同時部分神經元中出現類似于露易小體的包涵體。這些結果證實α-synuclein蛋白在神經變性死亡中起關鍵作用。我國楊慧等運用基因轉染的方法觀察了農藥魚藤酮對高表達的α-synuclein的神經細胞的影響。
SH-SY5Y細胞是人骨髓神經母細胞瘤，在體外可以模擬多巴胺能神經元，用于神經退行性疾病機理等研究。人G209A突變型α-synuclein轉基因SH-SY5Y細胞模型，是在細胞水平上模擬PD患者的多巴胺能神經元，在病理表現上可有形態變化、突變α-synuclein蛋白過表達以及相關生理功能改變等。應用此細胞模型可以從多層次多角度進行PD致病機理的研究，為研制和篩選防治PD的新藥提供可靠、可行的平臺。
發明內容
本發明的目的之一在于從人源神經細胞株中擴增α-synuclein目的基因，避免了常規使用人腦提取帶來的倫理問題。
本發明的目的之二是將正常的目的基因進行定點突變，導入細胞后，篩選得到穩定過表達的細胞模型。
本發明的目的之三是利用新建的細胞模型進行抗帕金森氏病藥物的篩選評價，及深入的機制研究。
本發明旨在構建一種體外摸擬病變多巴胺神經元的細胞模型，用于進行PD致病機理研究及研制和篩選防治PD的新藥提供可靠、可行的平臺。
圖1總RNA提取圖2野生型α-synuclein cDNA瓊脂糖凝膠電泳；1DL2000 DNAmarker；2α-synuclein cDNA。
圖3菌落PCR篩選陽性轉化子；MDL2000 DNA marker；1、2、4、5、6陽性轉化子；3、7、8陰性轉化子。
圖4SOE法α-synuclein定點突變瓊脂糖凝膠電泳；1DL2000 DNAmarker；2209bp product；3337 product；4mutant α-synuclein。
圖5重組質粒3.1-hmα-syn雙酶切瓊脂糖凝膠電泳；1DL2000 DNAmarker；2、33.1-hmα-syn；4DL15000 DNA marker。
圖6真核表達質粒DNA測序結果(為cDNA反向序列，紅色為突變點)。
圖7Western Blot證明所得五個單克隆中，克隆3有較高的外源基因表達。
具體實施例方式
本模型是在構建人G209A突變型α-synuclein基因真核表達質粒基礎之上建立起來的。具體方法如下1.選擇SH-SY5Y細胞，提取總RNA，采用RT-PCR法擴增人野生型α-synuclein基因(圖1、圖2)。
2.將α-synuclein與pMD18-Tsimple載體進行T-A克隆，轉化感受態細胞后，進行陽性克隆篩選、菌落PCR及測序鑒定，證明插入基因確為α-synuclein(圖3)。
與GeneBan比對后，證明擴增所得序列正確無誤。比對序列如下GAGGGACTCAGTGTGGTGTAAAGGAATTCATTAGCCATGGATGTATTCATGAAAGGACTTTCAAAGGCCAAGGAGGGAGTTGTGGCTGCTGCTGAGAAAACCAAACAGGGTGTGGCAGAAGCAGCAGGAAAGACAAAAGAGGGTGTTCTCTATGTAGGCTCCAAAACCAAGGAGGGAGTGGTGCATGGTGTGGCAACAGTGGCTGAGAAGACCAAAGAGCAAGTGACAAATGTTGGAGGAGCAGTGGTGACGGGTGTGACAGCAGTAGCCCAGAAGACAGTGGAGGGAGCAGGGAGCATTGCAGCAGCCACTGGCTTTGTCAAAAAGGACCAGTTGGGCAAGAATGAAGAAGGAGCC
CCACAGGAAGGAATTCTGGAAGATATGCCTGTGGATCCTGACAATGAGGCTTATGAAATGCCTTCTGAGGAAGGGTATCAAGACTACGAACCTGAAGCCTAAGAAATATCTTTGCTCCCCGTTTCTTGAGATCTGCTGACAGATGTTCCAT3.進行質粒小量制備，運用SOE法進行定點突變，得到G209A突變型α-synuclein基因(圖4)。再次進行轉化、篩選和鑒定。
4.進行質粒小量制備，分別將已插入突變基因的質粒和pcDNA3.1+質粒進行雙酶切，將G209A突變型α-synuclein基因插入pcDNA3.1+載體中。之后進行轉化，篩選、測序及雙酶切鑒定(圖5、圖6)。
5.應用磷酸鈣轉染法將人G209A突變型α-synuclein基因真核表達質粒導入SH-SY5Y細胞中。同時進行G418篩選濃度和維持濃度的選擇。
6.用實驗得到的G418篩選濃度進行篩選后，換維持濃度，并將得到的陽性克隆擴大培養，應用有限稀釋法進行單克隆篩選，并將選擇的五個單克隆擴大培養。
7.采用Western Blot方法在蛋白質水平證明細胞內過表達外源α-synuclein突變蛋白(圖7)。
通過以上步驟完成了人G209A突變型α-synuclein轉基因SH-SY5Y細胞模型建立。
權利要求
1.人G209A突變型α-synuclein轉基因SH-SY5Y細胞的制備方法，其特征在于，包括如下步驟A)從人源神經母細胞SH-SY5Y中提取總RNA，并用特定引物進行人野生型α-synuclein基因擴增；B)應用特定引物的SOE法對人野生型α-synuclein基因進行定點突變；C)將pcDNA3.1+載體與突變型α-synuclein基因相連，成功構建了真核表達質粒；D)將真核表達質粒導入細胞中，經過篩選及鑒定得到穩定過表達的細胞模型。
2.人G209A突變型α-synuclein轉基因SH-SY5Y細胞在篩選藥物中的應用。
3.根據權利要求2的應用，其特征在于，所述的藥物是抗帕金森氏病藥物。
全文摘要
本發明公開了我國抗帕金森氏病(Parkinson’s Disease)藥物篩選及評價平臺的建立，具體講，該平臺以基因克隆技術和轉基因技術為支持，在體外模擬病變巴胺能神經元，可用于篩選抗帕金森氏病藥物候選化合物和先導化合物，并可對藥物進行藥理學評價及深入的機制研究。
文檔編號C12Q1/68GK101074429SQ20061008089
公開日2007年11月21日 申請日期2006年5月19日 優先權日2006年5月19日
發明者朱海波, 趙大龍, 王曉良 申請人:中國醫學科學院藥物研究所