專利名稱：一種利用scar標記進行大白菜品種鑒定和種子純度檢驗方法
技術領域：
本發明屬于農業的蔬菜品種鑒定與良種領域，涉及白菜的品種鑒定和種子純度檢驗方法，特別是一種利用SCAR標記進行“冠春”大白菜的品種鑒定和種子純度檢驗方法。
背景技術：
對雜種種子遺傳學純度的檢驗，越來越引起種子生產單位的特別重視。雖然田間形態學鑒定結果可靠，實施簡單，但檢測周期長，耗時費工，難以滿足當年收獲，當年用種的要求。同功酶和蛋白質電泳技術已經在一些十字花科蔬菜作物品種及雜種純度檢驗中得到了應用，但是由于其存在組織特異性，在不同器官、不同生長時期帶型差異不穩定等因素，及其多態性不豐富，譜帶較少，差異有限等缺陷，難以滿足越來越多的品種檢測要求。
分子標記是近年來研究的熱門領域，它以DNA為研究對象，具有以下優越性(1)直接以DNA的形式表現，在植物體的各個組織、各發育時期均可檢測到，不受季節、環境限制，不存在表達與否的問題；(2)數量極多，遍及整個基因組，可檢測到的基因座位幾乎是無限的；(3)多態性高，自然界存在著許多等位變異，不需專門創造特殊的遺傳材料；(4)表現為“中性”，不影響目標性狀的表達，與不良性狀無必然的連鎖；(5)有許多分子標記表現為共顯性(codominance)，能夠鑒別出純合基因型與雜合基因型，提供完整的遺傳信息，因而現已形成許多分子標記系統。
PCR技術是近年來發展起來的DNA分子標記之一，與RFLP相比，RAPD標記具有以下特點(1)RAPD的引物具有通用性，同一套引物可適用于不同生物基因組的分析。相反RFLP標記具有種族特異性，只在一定的種屬范圍內可相互使用；(2)RAPD技術簡單成熟，可程序化作業，特別適于大批量檢測；(3)由于引物的隨機性，RAPD標記幾乎可覆蓋整個基因組；(4)RAPD標記一般表現為顯性遺傳，不能區分雜合型和純合型；(5)RAPD標記一般可以同時檢測多個位點，很適于快速構建遺傳圖譜和不同材料多態性篩選；(6)RAPD分析不使用同位素，因而比較安全，也不受特殊地區規定限制；(7)RAPD技術DNA用量少，不受植株生長條件、時期的限制。所以，RAPD分析非常適于大規模樣品的植物育種、種群遺傳學和生物多樣性等眾多研究領域。
SCAR標記，即序列特異擴增帶，是基于RAPD發展起來的一類標記，在對多態性RAPD產物測序的基礎上，設計一對新的引物，特異地擴增一個在遺傳上定義為一個位點的DNA區段。在對多態性RAPD產物測序的基礎上，設計一對新的引物，特異地擴增一個在特定位點的DNA片段，一般在原RAPD引物的3’與5’端延長14個堿基，利用兩端各24個堿基的引物進行特異擴增，因此，該方法與RAPD相比具有如下優點由于使用較長的引物和高退火溫度，因此具有重復性和穩定性好，帶型簡單等優點，因此，SCAR標記成為分子育種、品種鑒定和種子純度檢驗的首選標記。
發明內容
本發明的目的是提供一種利用SCAR標記進行大白菜品種鑒定和種子純度檢驗方法。
為了實現上述目的，本發明采用的技術方案是，一種利用SCAR標記進行大白菜品種鑒定和種子純度檢驗方法，該方法以“冠春”父母本及F1代種子為研究材料，首先進行PCR反應體系優化，篩選特異性引物，進一步對特異片段克隆測序，轉化為SCAR標記，應用于“冠春”大白菜品種鑒定和種子純度檢驗，其特征在于，具體包括以下步驟1)材料的準備
以春大白菜新品種“冠春”及其親本種子催芽育苗后移栽至大田，在幼苗期單株編號，隨機選取100-200株，于苗期取幼嫩葉片提取DNA備用，成株期根據品種特性鑒定生物學性狀；2)DNA提取采用CTAB法，其過程為，取0.2g幼嫩葉片，液氮下研磨成粉末；加入750μL CTAB提取液后轉入至1.5mL離心管中；然后65℃水浴30min，其間振蕩混勻；分別用等體積的Tris-飽和酚、氯仿、異戊醇混合溶液和等體積的氯仿、異戊醇混合溶液各抽提一次，于常溫下在12000r/min條件下離心2次，每次10min；取上清液加入2倍體積預冷的無水乙醇沉淀DNA，于4℃條件下離心15min；離心轉速為12000r/min，離心后用70％乙醇清洗沉淀2～3次；加入DNA貯存液，經DNA純度檢測證實純化度，存于-20℃冰箱中備用；3)SCAR引物設計母本特異性引物SC134-1200fS134MTGCTGCAGGTGAAGGCTGGTTCrS134MTGCTGCAGGTTATCCTTTTTGGTTG雜種特異性引物SC266-260fS266FAGGCCCGATGGAGTTTGTGTAAGfS266FAGGCCCGATGATGATAAATCATTG4)SCAR-PCR擴增采用25μL的PCR反應體系，其中包括1×緩沖液，2.0mmol/L MgCl2，2.5mmol/L dNTPs，0.3μmol/L引物，1U TaqDNA聚合酶，30～50ng模板DNA；反應程序SCAR擴增程序為，94℃預變性4min，94℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸90s，循環30次，最后72℃延伸10min；擴增產物在含5μg/mLEB的1.5％瓊脂糖膠，120V下電泳1.0h，電泳后在紫外燈下觀察并照相；
5)SCAR標記的特征A、SC134-1200標記用SC134-1200的SCAR引物對“冠春”群體鑒定，在母本和雜交種中可以擴增出S134-1200的特異條帶，而父本及其自交苗中不能擴出S134-1200的特異條帶，因此利用該比較可以正確的鑒定“冠春”反交種子；鑒定群體中有擴增帶單株的比率就是反交種子的雜交率；B、SC266-260標記用SC266-260的SCAR引物對“冠春”群體鑒定，母本、父本均沒有擴增帶，只有真雜種有擴增帶，沒有擴增帶的可能是假雜種；利用該比較可以正確的鑒定“冠春”正交、反交單收以及混收種子；鑒定群體中有擴增帶單株的比率就是反交種子的雜交率。
本發明的方法通過134個冠春隨機群體的鑒定，鑒定結果與田間鑒定相一致。
圖1是引物S47對“冠春”及其親本的擴增結果，其中，M.DL2000Marker；1、母本，2、父本，3～15、雜交種；圖2是引物S134對“冠春”雜交種及其親本的擴增結果，其中，M.DL2000Marker；1、母本，2、父本，3～18、雜交種；圖3是引物S4對“冠春”雜交種及其親本的擴增結果，其中，M.DL2000Marker；1、母本，2、父本，3～18、雜交種；圖4是引物S73對“冠春”雜交種及其親本的擴增圖譜，其中，M.DL2000Marker；1.母本；2.父本；3～18.雜交種；圖5是引物S494對“冠春”雜交種及其親本的擴增圖譜，其中，M.DL2000Marker；1.母本；2.父本；3～19.雜交種圖6是引物S266對“冠春”雜交種及其親本的擴增圖譜，其中，M.DL2000Marker；1.母本；2.父本；3～19.雜交種；圖7SCl34-1200引物對“冠春”群體擴增的結果，其中，M.DL2000Marker；1.母本；2.父本；3～17.雜交種；圖8SC266-260引物對“冠春”群體擴增的結果，其中，M.DL2000Marker；1～2.母本；3～4.父本；5～20.雜交種；以下結合附圖和發明人進行“冠春”大白菜的品種鑒定和種子純度檢驗對本發明作進一步的詳細說明。
具體實施例方式
本發明的具體實施按以下步驟進行1、材料的準備以春大白菜新品種“冠春”及其親本種子催芽育苗后移栽至大田，在幼苗期單株編號，隨機選取100-200株，于苗期取幼嫩葉片提取DNA備用。成株期根據品種特性鑒定生物學性狀。
2、DNA提取采用CTAB法，過程為，取0.2g幼嫩真葉，液氮研磨成粉末；加入750μLCTAB提取液后轉入至1.5mL離心管中；然后65℃水浴30min，其間振蕩混勻幾次；分別用等體積的(Tris-飽和酚∶氯仿∶異戊醇＝25∶24∶1)和等體積的(氯仿∶異戊醇＝24∶1)各抽提一次于12000r/min離心10min(2次，常溫)。取上清液加入2倍體積預冷的無水乙醇沉淀DNA，于12000r/min離心15min(4℃)。用70％乙醇清洗沉淀2～3次；加入DNA貯存液(70％體積分數的乙醇，其中加入0.3moL/L NaAc溶液)后，經DNA純度檢測，證實純化較好。存于-20℃冰箱中備用。
3、RAPD擴增PCR采用25μL的反應體系，其中包括1×緩沖液，2.0mmol/L MgCl2，2.5mmol/L dNTPs，0.3μmol/L引物，1U TaqDNA聚合酶，30～50ng模板DNA。反應條件預變性94℃/4min、94℃/60s、36℃/60s、72℃/90s，45個循環，72℃延伸10min。最后RAPD擴增產物在含5μg/mLEB的1.5％瓊脂糖膠，120V下電泳1.0h，電泳后在紫外燈下觀察并照相。
4、特異性引物的篩選隨機抽取父本、母本及雜交種各10株，分別建立混合池，進行RAPD引物篩選。在320條引物中有208條引物可擴增出穩定而清晰的條帶，不同引物擴增的RAPD條帶數目為0～11不等，RAPD片段大小在0.4kb～3.0kb之間，其中在親本和雜交種中表現擴增多態性的引物有96個，占總引物的30％。經4次以上重復篩選，有6個引物能穩定擴增出特異條帶，分別是S4、S47、S73、S134、S266、S494。
5、特異性引物對冠春群體的鑒定1)S47及S134對“冠春”群體的鑒定用引物S47對134個“冠春”雜交種單株DNA進行RAPD擴增，在母本及132個單株中都擴出S47-700的特征帶，其中2個單株“13”(附圖1)和“56”(未顯示)及父本沒有擴增出S47-700特征帶，且其擴增譜帶與父本帶型相似，可以認為單株“13”和“56”可能是父本自交苗，檢測雜交率為98.5％。
用引物S134進行相同的擴增時，表現一致的結果。母本及132個單株都擴出S134-1200的特征帶，其中2個單株“17”(附圖2，與附圖1的“13”為同一單株)和“56”(未顯示)未擴出S134-1200的特征帶，而且單株“17”和“56”與父本的擴增帶型相似，再次驗證了這2個單株可能是父本自交苗，檢測雜交率也為98.5％。
由此看出，利用引物S47及S134擴增出的母本特征譜帶，均可以將混雜的父本種子檢出，但無法區分母本與雜交種，因此對于鑒定反交種子是有效的。
2)引物S4對“冠春”群體的鑒定用引物S4對134個“冠春”雜交種單株DNA進行RAPD擴增，結果表明，父本及130個單株都擴出S4-370特征帶，其中4個單株“17”(附圖3)、“20”、“66”和“78”(未顯示)均未擴出此特征帶，擴增出的帶型與母本帶型相似，說明這4株可能是母本自交苗，在用S47、S134時沒有被發現。而前面發現的父本自交株“13”(附圖1)沒有表現出特異性，表明引物S4是父本特異性擴增引物，可以將母本與雜交種區分，其檢測雜交率為97％。但無法將父本與雜交種區分，因此對于正交種子的鑒定是有效的，如果與母本特異性擴增引物聯合使用，則可以同時鑒定出父本自交株和母本自交株。
3)引物S73及S494對“冠春”群體的鑒定對134個冠春雜交種單株DNA用引物S73進行擴增，有128個單株同時擴增出與父本和母本條帶，即父本的特征帶S73-730和母本的特征帶S73-660(附圖4，部分圖片)，有4株(附圖4的“17”和“20”、“66”和“78”(未顯示))擴增帶型與母本帶型相似；有2株(即附圖1的“13”，“56”)擴增帶型與父本帶型相似，再次驗證了在所選的134個單株中，可能有4株母本自交苗，2株父本自交苗(未顯示)，其檢測雜交率為95.5％。
在附圖4中，單株“17”(即附圖1中的“13”，附圖2中的“17”)的擴增帶型都與父本帶型相似，沒有擴出母本特征帶S73-660，與引物S47及S134檢驗結果一致，再次提供了該單株可能為父本自交苗的證據；用引物S73對附圖3中的單株“17”進行擴增，結果母本帶型相似，再次驗證該單株可能為母本自交苗(圖片未顯示)。
4)引物S266對“冠春”群體的鑒定對134個冠春雜交種單株DNA用引物S266進行擴增，有128個單株擴增出不同于父本和母本條帶，即特征帶S266-260(附圖6，部分圖片)，有4株(附圖4的“17”和“20”、“66”和“78”(未顯示))擴增帶型與母本帶型相似；有2株(即附圖1的“13”，“56”)擴增帶型與父本帶型相似，再次驗證了在所選的134個單株中，可能有4株母本自交苗，2株父本自交苗(未顯示)，其中附圖6中的單株“14、15”為人為混雜的其它白菜種子，其檢測雜交率為95.5％。
6、特異條帶的測序及SCAR引物設計將所需條帶在紫外燈下挖出，放入1.5mL管中，用瓊脂糖回收試劑盒回收片段，參照《分子克隆實驗指南》中的方法進行重組質粒的轉化與篩選。用PCR進行檢測。目的片斷委托博雅公司測序并提供結果。根據序列結果設計了8對SCAR引物并合成。結果如下1)隨機引物S4GGACTGGAGT測序時標記名稱S4-414F，實測長度383bpGGACTGGAGTGCTAGTTTGAGAACAAAAACTTGGTTTAGTGCTATTTTGGTCTTTTTCTCTTATTTAAACTCAAGCTTGTACTCTTCATTCTTCTATGGCAAAGATTATATTTTCAAACTGAATTTTTTATATACATAGCCAAAAAAAATATGTTTAATAGTCCGTCCGTAGAGATTCAGATTAATCCATATACCTAATCTGCATTGTTCTAAGCTCATGAGATATCTCAAGCACCAACCCTTGCATAATATTTTCAACTACATCAGAGACTACACCTTCAGATTCTCCACCACAATCCAACCAAAGACATGGCTTCATCAGATCAACCTCGACGACCTGATCCAATGTCCTTGGAGAGTCACAGCAGAGTAAACTCCAGTCCSCAR引物fS4FGGACTGGAGTGCTAGTTTGAGAACrS4FGGACTGGAGTTTACTCTGCTGTG2)隨機引物S47TTGGCACGGG測序時標記名稱S47-700M，實測長度666bpTTGGCACGGGATGTTGAGGTTGGTAAGCATCTATACCTAGCTCAGCCATTAGAGTTAGAGTCCATTCACGGCTAACTTACCACCAACGAAGAATTCCTCGCATAAAATGATTCTTACATTCTATAGATACTGTAAAAGCCAACTCATGTTTCTGCGAAAATAAATAAGAAAGCTCATTTTTTTCTTTTATTATGCTAGCCTTTCTAAATATCCTTCTCTTGTTGATGAAGCGCCCCCTTATGGAGTTGAGCCTGACTTGGGCAGCCGCTTTCATTGTTGTGCCATTATATTCTTTTTTCATGTCTTTTATGGATGGCTGTTCTCA
TTCCGTCGGAGGCGATGGAAGCGGTGCCAGCTCTTCGAAGCGACCGCGTCTCGACCTGCCCAGAACAACAGGAATAGTTTAATCTAAAAAAAAAATATGAAGAAGTAAGAAAGATCAAAATGGAGTTAGCCGAACTGATTGGCTCCCTAATTGACCAAGCGAAAGAGGGGCTGCAATTTTCCGCCCATAAGGGGAGTGCCTTCGCCACCGGTAATGTGTGGAAGAGCTAATAAACCGAATTGGGAACAATGAGAAGGCCAGACCAGAAGGGAAAACGACCCCAATGGGGAGATTACCGATTTTATAAATAAAAAGAAGTTCTTAAAGCGGGCCCGTGCCAASCAR引物fs47-700mTTGGCACGGGATGTTGAGGTTGrs47-700mTTGGCACGGGCCCGCTTTAAGAAC3)隨機引物S134TGCTGCAGGT測序時標記名稱S134-1200M，實測長度1091bpTGCTGCAGGTGAAGGCTGGTTCAATATTTGACAATATATTGATCAGTGATGACCCGGAATATGCAAGGAGCATGGTGGATGACTATTTTGCTCAGCACAGAGAGGTAGGCTTCTCCATGCCTTTGGGATACCTTCTTTTTGCTTCTTTTTAGACAAAGTTAAATGAGTTTCTGCATGATTTTATTATAGAAAATGTCTTATTAGTAATCTGATGTGCTTATATATACTCTTCTGACCAGTCTGAGAAGGAGTTATTTGCGGAAGCTGAGAAAGAAAAAAAAGCTAGAGAAGATGAGGTTTGTAGTTTTCAAAACAAGTCCTTACTTGCTTTTAAAATCTTCTCTGTTTATCTTAATCATGATCTCATACAATTTGACGATTGCAGGAAGCTAGGATAGCAAGAGAAGAAGGGGAACGTAGACGAAAAGAGAGGGGTGACCGGTATGGACACAGGGACAGGAGGCATCGTTACAAACGGGTACATACTCAATGAGACCAACTCAGTTCTACAGTTTTCTTTCTCCTTCTCAACACTGTTAGTTCTGGAATATAAGTGAGTGACTAAGTATAAACGTTTTGTTTTGCAGCACCACCGACGTGGTTACATGGACGATTACCATGTAAGTAAACTAAGTGGTTTTCTATTCAACCACTTTTAAATGCTTTATGCGTTTTAGTACTGAATCATCTTAACCGTTTTCGTGTAGGATGAGCTATAAGGCGCAGTGGTGGCCTGGTGGGGGATTTGGCAATGACAACCAATAAAAGCAAGTATTCATTAAAGTCATCATACCTAG
AGAGCTGGAAACTATATGGTTGGTTTTTGTAGTTTGTATGATTGTAATATGTATCATATCACTTCTTTTTTTTTTTTGTCATCTGAAGTTTCATATATCACAAAGGTTAACATTGCAAACACCTCCTTTACACGGAZCCAACACAAAAAGCAATTCTAAACCAAGGACAAACTAACACTCCAAAGTCTTTAGTGTACCAAAAAATTTTCGAAGGAGACAACTTCAAGTCAAAGAGAGGCCAAACGTTTCTCATTTTCAAAGACGTCCTGCAACCAAAAAGGATAACCTGCAGCASCAR引物TGCTGCAGGTfS134MTGCTGCAGGTGAAGGCTGGTTCrS134MTGCTGCAGGTTATCCTTTTTGGTTG4)隨機引物S73AAGCCTCGTC測序時標記名稱S73-671M，實測長度660bpAAGCCTCGTCTGTGGTAAGAAATTAACCATCATGTTATCTTTGTCCTTGTGTTTTGGTCTCTGGGTCCTAAGATTTACTCAATCATGTCTGACGTTCTCAGGATCTTAGCAAGAAGCAGTTTAAGAAGTCTATGACCAAGAAATCACATTCATGGTGGTGGGACAGTCACAATTGTCCCAAGAACTCGAAGTGGCTTGCTCAGAATCTGGAGAGTATGTTGCCTCACTTATCATTGAGATACCTATCTCCACTTAAATGTAGATCTTGAACTTGTTCTTATTATGGCTTCTCAGAGATGGATGACCGTGTGAAACACATGTTAAAGTTGATTGAAGAAGACGCAGACTCTTTTGCCAAGAAAGCTCAGATGTATTACCAGAAGCGTCCCGAGTTAATCCACCTTGTGGAGGAGTTTTACCGCATGTATCGCGCTTTGGCTGAGCGTTATGATCAAGCTAGTGGTGAACTTCAGAAAATTCATCTCTCTGGGATACAGTCACAGGGCTCTCTTGAGAAATCATCTCCTACTAATTCCCAAGAGAAATCGAGTCACCCTCATAAGGAAGAGGAAGACTCATCATCTCTGTCTGATTCTGATTCTGACTCTAAATCGGTTCCTGATCATTCCTCTGTTAATGATGAAGATGGTGACGAGGCTTSCAR引物fs73FAAGCCTCGTCTGTGGTAAGrs73FAAGCCTCGTCACCATCTTC
5)隨機引物S73AAGCCTCGTC測序時標記名稱S73-750F，實測長度728bpAAGCCTCGTCTGATGTAAAACACACCGCTTGTGCTGTTTTTTGAAAGAAGCAGTGTCCATTTTCTTCCTTTCTCGTTGACTAGATCTATCTCACAGGGCTTGTTGTGCTCATTAAACGACACAACCGTAAAGTCTTTAGAAAGATCCTGGAAAAAAAACAAAGAAATAATACATCACTCACAGTATCATACACTTGACTACTTACAAAAGGTAAACGAGGAGTGTAGTAATTAGTTACCAAACGATCTTTGATGGGGCTATAAGGTGTGACACGTGCTCTGAGGATACAAGAGAAACCTGCTTTTGTGCTCTTGTTCACCAAAATGTTCCCTGAATCACAACAATCTTCATTTACATTTTACTACCAAACCAAAAACTCAAAACATATACCACTTATGTCGTTTCAAGAAACGAAAACACCTTACCTGCGTCATCCTCTCCTCCATCGTCATCATCATCATATTCGTCTTCTCCATCCTCAGATTCAGAATAGTCATCATCAGTCTCAACATCGTCAGTATCAACCAAGCTAGGAGACGCGTGGTGACTTATGTCACAAGAATCCGACCGAGGGGACACAGATACATGAAAGATCTCGTCTCCATCGTGTCTGAAAACCAAGAGGTCTCCGTCTCTGAAACTATGAGCTTTGGCGAACTCTTCCCAGCCGCCGCCGGCGAGCCTGCTTCCCTCTAGTTTCACTTTCCAAATCTTGTCCGACGAGGCTTSCAR引物fS73-750FAAGCCTCGTCTGATGTAAAACACrS73-750FAAGCCTCGTCGGACAAGATTTG6)隨機引物S494GGACGCTTCA測序時標記名稱S494-399M，實測長度376bpGGACGCTTCAATAATATTGAAATATATTTTTTAAAAAAATATAATAATTGGAATATTGCGTAATTAAGTTTACGTTTTTGGGAATTTCACATATTAAATAATTAATTACATATTTTGAGGTAAATATTCAAGAGACTGTGATTTTCATTAATCAATCATTAGAAGAGAATAAAAGCATTAAAAAAATCTTCAGTTTATTTTAAAAGAAACAGTTGTGACAAATGTTTTTATCAGACAAGACAACAACAAATAATTAAAAAGACAGTGTCCACCGCCAAAAGAAACTCAACTCTAAAGCTTAAATATGAAGAGAATCAAGTCAAAGCCGGAGTCTCTGCAAACATATTGGAACACTTTGTCTGAACCTGAAGCGTCC
SCAR引物fS494MGGACGCTTCAATAATATTGrS494MGGACGCTTCAGGTTCAGAC7)隨機引物S494GGACGCTTCA測序時標記名稱S494-1770F，實測長度1771bpS494-1775F(-47)GGACGCTTCAGAAATATTTAATAAAATAAAAAAAAGACCACTAAAATCTTAAAGACTAAATAGTAAAAAGATAAAGATACAAACGTGTGAAGCAAAACCCAAGCCGACACGTTCAATTCCATCGTTTTGATCCGGTTCCGGCAGGCACGAGCTTTAGGCCGGTTGGTTAAAACACGCGCTTTGGACCATTTAGGAAACACAGTCAGGTTCTCGTGATTTCTTGCTTATAATGGGCCCCTCCCACCCATATGGTCAGCTAAACGAGTGAAATTCTAGGGCACACCTTTGATTATTTTTTTTAAATAATCAAAAAATTATTATTAGAAACCGAAAATTATTATTTATTCCAAAGACATGAATTCCTACAAGTCCACAACTGTTGTTTATGGTCAAATCATAAAGCAAAACTAATGTTTTCCAAATAGTTAATGGAAAAAAAGAAAAACAAAAGCAAATGCATCTTGCGTTGTTGGAATGCAAAAAGAGAGAAAACGATACGTACCTAATGTTAATTCTAATTAGTTAGTTATAGAATGAGGAGGTACATTAAAAAGGAAAATTAGTATTAGTACTCAGTTAAGTATGCACGTGTGTGGGAAGTATGGTGGCGAAACTATACAACCAACCCCTAGTAGATGGCTAGTTGTACATGTCTCGTGACGTATACATCATATATATAATAAATACGAACATAGAAATTAATAGGACTTAGTTGTTGCGAATATACGTAAAATCAAATAAAACCAACCATTCAATGTTCTTGGTAAGTAACGAAATAAAACGGAAGCAAGAAGGAGAACCACATAAAAGGGAGCTAACTCCTGTACACGTTGTGCTTCATCTGCCCGTCCGTCAAACTACCACACTCCCTTCTCTTTTCCCCTTTGTCATCTTGTATAATAATATCTCACTCTCCCATGCTTTCTAACATS494-1775F(-48)GGACGCTTCACGGAAGGGCGAAGGCCAAGGAGCTTGGTGAGCTGGTAGTCAGCACCAGGCATGTCAACTCCAGAGGTGGTGCAGAAGACAACGTGTGTGACCTTGGACTTAGGCTGACCCCACTCCTTGATGGCCTTCACTGCTGCATCTTTGCCTAGCTTAGGGACTTCAACCACCACGAGGTCTTGTCTAGCG
TCGAGAGAAGGAGCCATGTAGGCGCACATGTTAGGGTTCTCTTTCAAGAACTCCTCGGTCAAGTGCATGTGGCGTTTTCTTATGGTCGACTTATCGCCTATTAGAGTCATAATCAAGTTAACTATGTGAACATACTAATAAGTACAGTTTAAGGTAGAAGACTATTAAATTTTCGGTTTTATCTATTTAATACATTTTTTTTTGTTAGTTAATGAACTAAAAGATACGGATAAAACTGGTGAATTATTTAAATGTATTTTGAAAATGTACAACAAATTTTAAAAACTAAAAATGATAAACGGATGAATTATATGCCAAAATTCTAAATGGAAAAATACAAAGTAGGGTTTGTTAAGACATACACATGCGCTTGAACTTCTCCTTAAGGTCGGTCTTGTGTTCACTGTTGGTGATGCGGAAGTAGTAGTCTGGATACTCAGCTTGGAGCACATGGTTCGCAGGGTTGGCCGTACCTATCGCTAAGATGCCTGCAGGACCGTCTGCTCTCTGTGCCTTTCTGATCTCATCCAACGAAGAACGCCCCATCACCATATTAAACCAACTACGTTTTAACTAAGTGTGATCGATGTGTTACTTTGCGTAATAAGCAAGTTATGTATGTATGTTTAGAAAGCATGCAGAGTASCAR引物fS494FGGACGCTTCAGAAATATTTAATArS494FGGACGCTTCACGGAAGGGCGAAG8)隨機引物S266AGGCCCGATG測序時標記名稱S266-260F，實測長度294bpAGGCCCGATGGAGTTTGTGTAAGAAAATGGGTTTCGGCCGTTTTTAAAATAAAACATTGACGACAAAAAAAAAAAAATAATTTGGCATCTCCCTCCATCTAAATCATGCATGACAAATGAATAAAAAGCTTTTATTATCATATGACGTCTATACAATGCGTATAATATGTTTCCTTTACTTTATTTACTTGTCGTCTTTATCTTATTATATTATATGCTACATTATAGTCATTGTTAAAGTCAGAGACTACAGGTATCATAAGGTTGCAACAATGATTTATCATCATCGGGCCTSCAR引物fS266260FAGGCCCGATGGAGTTTGTGTAAGfS266260FAGGCCCGATGATGATAAATCATTG7、SCAR擴增與SCAR標記的驗證SCAR-PCR擴增
采用25μL的PCR反應體系，其中包括1×緩沖液，2.0mmol/L MgCl2，2.5mmol/L dNTPs，0.3μmol/L引物，1U TaqDNA聚合酶，30ng～50ng模板DNA。反應程序SCAR擴增程序為94℃預變性4min，94℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸90s，循環30次，最后72℃延伸10min。擴增產物在含5μg/mLEB的1.5％瓊脂糖膠，120V下電泳1.0h，電泳后在紫外燈下觀察并照相。
將SCAR引物用于兩親本和F1的擴增，如果與RAPD擴增的目的片段大小位置相同則說明SCAR標記轉化成功。在8對SCAR引物中，SC4-370、SC47-700、SC73-730和SC73-660、SC494-400和SC494-1770的引物在“冠春”雜交種群體及其親本擴增時未表現出多態性，只有SC134-1200與SC266-260標記的2對引物對群體擴增的結果與RAPD的結果完全相符，說明SCAR標記轉化成功。其引物如下母本特異性引物SC134-1200fS134MTGCTGCAGGTGAAGGCTGGTTCrS134MTGCTGCAGGTTATCCTTTTTGGTTG雜種特異性引物SC266-260fS266FAGGCCCGATGGAGTTTGTGTAAGfS266FAGGCCCGATGATGATAAATCATTGSCAR標記的特征A、SC134-1200標記用SC134-1200的SCAR引物對“冠春”群體鑒定，從附圖7可以看出，在母本和雜交種中可以擴增出S134-1200的特異條帶，而父本及其自交苗中不能擴出S134-1200的特異條帶，因此利用該比較可以正確的鑒定“冠春”反交種子。鑒定群體中有擴增帶單株的比率就是反交種子的雜交率。
B、SC266-260標記用SC266-260的SCAR引物對“冠春”群體鑒定，在附圖8中，可看出母本、父本均沒有擴增帶，只有真雜種有擴增帶，沒有擴增帶的“10”和“15”等可能是假雜種。對134個“冠春”群體進行鑒定，發現有6株假雜種，與田間鑒定相一致。利用該比較可以正確的鑒定“冠春”正交、反交單收以及混收種子。鑒定群體中有擴增帶單株的比率就是反交種子的雜交率。8、SCAR標記對“冠春”群體的驗證用SCAR引物SC134-1200對“冠春”群體鑒定，其中父本未擴出S134-1200的特異條帶，同樣在雜交種中的“11”和“14”未擴出S134-1200的特異條帶，而這2株也正是用RAPD引物鑒定出的兩個父本自交苗，與RAPD擴增結果吻合。
用SCAR引物SC266-260對“冠春”群體鑒定，在母本、父本和雜種“10”和“15”均未擴出S266-260的特異條帶，將此結果與RAPD擴增結果比較發現，“10”為母本自交苗，“15”為父本自交苗。
用SCAR引物S266-260和S134-1200對整個“冠春”群體進行鑒定與RAPD鑒定結果一致，與田間性狀觀察結果相吻合，即在對134個“冠春”群體進行鑒定，發現有2株父本自交苗，4株母本自交苗。
特異RAPD片斷核酸序列及SCAR引物序列1)隨機引物S4GGACTGGAGT測序時標記名稱S4-414F，實測長度383bp；GGACTGGAGTGCTAGTTTGAGAACAAAAACTTGGTTTAGTGCTATTTTGGTCTTTTTCTCTTATTTAAACTCAAGCTTGTACTCTTCATTCTTCTATGGCAAAGATTATATTTTCAAACTGAATTTTTTATATACATAGCCAAAAAAAATATGTTTAATAGTCCGTCCGTAGAGATTCAGATTAATCCATATACCTAATCTGCATTGTTCTAAGCTCATGAGATATCTCAAGCACCAACCCTTGCATAATATTTTCAACTACATCAGAGACTACACCTTCAGATTCTCCACCACAATCCAACCAAAGACATGGCTTCATCAGATCAACCTCGACGACCTGATCCAATGTCCTTGGAGAGTCACAGCAGAGTAAACTCCAGTCCSCAR引物fS4FGGACTGGAGTGCTAGTTTGAGAACrS4FGGACTGGAGTTTACTCTGCTGTG2)隨機引物S47TTGGCACGGG測序時標記名稱S47-700M，實測長度666bp；TTGGCACGGGATGTTGAGGTTGGTAAGCATCTATACCTAGCTCAGCCATTAGAGTTAGAGTCCATTCACGGCTAACTTACCACCAACGAAGAATTCCTCGCATAAAATGATTCTTACATTCTATAGATACTGTAAAAGCCAACTCATGTTTCTGCGAAAATAAATAAGAAAGCTCATTTTTTTCTTTTATTATGCTAGCCTTTCTAAATATCCTTCTCTTGTTGATGAAGCGCCCCCTTATGGAGTTGAGCCTGACTTGGGCAGCCGCTTTCATTGTTGTGCCATTATATTCTTTTTTCATGTCTTTTATGGATGGCTGTTCTCATTCCGTCGGAGGCGATGGAAGCGGTGCCAGCTCTTCGAAGCGACCGCGTCTCGACCTGCCCAGAACAACAGGAATAGTTTAATCTAAAAAAAAAATATGAAGAAGTAAGAAAGATCAAAATGGAGTTAGCCGAACTGATTGGCTCCCTAATTGACCAAGCGAAAGAGGGGCTGCAATTTTCCGCCCATAAGGGGAGTGCCTTCGCCACCGGTAATGTGTGGAAGAGCTAATAAACCGAATTGGGAACAATGAGAAGGCCAGACCAGAAGGGAAAACGACCCCAATGGGGAGATTACCGATTTTATAAATAAAAAGAAGTTCTTAA
AGCGGGCCCGTGCCAASCAR引物fs47-700mTTGGCACGGGATGTTGAGGTTGrs47-700mTTGGCACGGGCCCGCTTTAAGAAC3)隨機引物S134TGCTGCAGGT測序時標記名稱S134-1200M，實測長度1091bp；TGCTGCAGGTGAAGGCTGGTTCAATATTTGACAATATATTGATCAGTGATGACCCGGAATATGCAAGGAGCATGGTGGATGACTATTTTGCTCAGCACAGAGAGGTAGGCTTCTCCATGCCTTTGGGATACCTTCTTTTTGCTTCTTTTTAGACAAAGTTAAATGAGTTTCTGCATGATTTTATTATAGAAAATGTCTTATTAGTAATCTGATGTGCTTATATATACTCTTCTGACCAGTCTGAGAAGGAGTTATTTGCGGAAGCTGAGAAAGAAAAAAAAGCTAGAGAAGATGAGGTTTGTAGTTTTCAAAACAAGTCCTTACTTGCTTTTAAAATCTTCTCTGTTTATCTTAATCATGATCTCATACAATTTGACGATTGCAGGAAGCTAGGATAGCAAGAGAAGAAGGGGAACGTAGACGAAAAGAGAGGGGTGACCGGTATGGACACAGGGACAGGAGGCATCGTTACAAACGGGTACATACTCAATGAGACCAACTCAGTTCTACAGTTTTCTTTCTCCTTCTCAACACTGTTAGTTCTGGAATATAAGTGAGTGACTAAGTATAAACGTTTTGTTTTGCAGCACCACCGACGTGGTTACATGGACGATTACCATGTAAGTAAACTAAGTGGTTTTCTATTCAACCACTTTTAAATGCTTTATGCGTTTTAGTACTGAATCATCTTAACCGTTTTCGTGTAGGATGAGCTATAAGGCGCAGTGGTGGCCTGGTGGGGGATTTGGCAATGACAACCAATAAAAGCAAGTATTCATTAAAGTCATCATACCTAGAGAGCTGGAAACTATATGGTTGGTTTTTGTAGTTTGTATGATTGTAATATGTATCATATCACTTCTTTTTTTTTTTTGTCATCTGAAGTTTCATATATCACAAAGGTTAACATTGCAAACACCTCCTTTACACGGATCCAACACAAAAAGCAATTCTAAACCAAGGACAAACTAACACTCCAAAGTCTTTAGTGTACCAAAAAATTTTCGAAGGAGACAACTTCAAGTCAAAGAGAGGCCAAACGTTTCTCATTTTCAAAGACGTCCTGCAACCAAAAAGGATAACCTGCAGCASCAR引物TGCTGCAGGTfS134MTGCTGCAGGTGAAGGCTGGTTC
rS134MTGCTGCAGGTTATCCTTTTTGGTTG4)隨機引物S73AAGCCTCGTC測序時標記名稱S73-671M，實測長度660bp；AAGCCTCGTCTGTGGTAAGAAATTAACCATCATGTTATCTTTGTCCTTGTGTTTTGGTCTCTGGGTCCTAAGATTTACTCAATCATGTCTGACGTTCTCAGGATCTTAGCAAGAAGCAGTTTAAGAAGTCTATGACCAAGAAATCACATTCATGGTGGTGGGACAGTCACAATTGTCCCAAGAACTCGAAGTGGCTTGCTCAGAATCTGGAGAGTATGTTGCCTCACTTATCATTGAGATACCTATCTCCACTTAAATGTAGATCTTGAACTTGTTCTTATTATGGCTTCTCAGAGATGGATGACCGTGTGAAACACATGTTAAAGTTGATTGAAGAAGACGCAGACTCTTTTGCCAAGAAAGCTCAGATGTATTACCAGAAGCGTCCCGAGTTAATCCACCTTGTGGAGGAGTTTTACCGCATGTATCGCGCTTTGGCTGAGCGTTATGATCAAGCTAGTGGTGAACTTCAGAAAATTCATCTCTCTGGGATACAGTCACAGGGCTCTCTTGAGAAATCATCTCCTACTAATTCCCAAGAGAAATCGAGTCACCCTCATAAGGAAGAGGAAGACTCATCATCTCTGTCTGATTCTGATTCTGACTCTAAATCGGTTCCTGATCATTCCTCTGTTAATGATGAAGATGGTGACGAGGCTTSCAR引物fs73FAAGCCTCGTCTGTGGTAAGrs73FAAGCCTCGTCACCATCTTC5)隨機引物S73AAGCCTCGTC測序時標記名稱S73-750F，實測長度728bp；AAGCCTCGTCTGATGTAAAACACACCGCTTGTGCTGTTTTTTGAAAGAAGCAGTGTCCATTTTCTTCCTTTCTCGTTGACTAGATCTATCTCACAGGGCTTGTTGTGCTCATTAAACGACACAACCGTAAAGTCTTTAGAAAGATCCTGGAAAAAAAACAAAGAAATAATACATCACTCACAGTATCATACACTTGACTACTTACAAAAGGTAAACGAGGAGTGTAGTAATTAGTTACCAAACGATCTTTGATGGGGCTATAAGGTGTGACACGTGCTCTGAGGATACAAGAGAAACCTGCTTTTGTGCTCTTGTTCACCAAAATGTTCCCTGAATCACAACAATCTTCATTTACATTTTACTACCAAACCAAAAACTCAAAACATATAC
CACTTATGTCGTTTCAAGAAACGAAAACACCTTACCTGCGTCATCCTCTCCTCCATCGTCATCATCATCATATTCGTCTTCTCCATCCTCAGATTCAGAATAGTCATCATCAGTCTCAACATCGTCAGTATCAACCAAGCTAGGAGACGCGTGGTGACTTATGTCACAAGAATCCGACCGAGGGGACACAGATACATGAAAGATCTCGTCTCCATCGTGTCTGAAAACCAAGAGGTCTCCGTCTCTGAAACTATGAGCTTTGGCGAACTCTTCCCAGCCGCCGCCGGCGAGCCTGCTTCCCTCTAGTTTCACTTTCCAAATCTTGTCCGACGAGGCTTSCAR引物fS73FAAGCCTCGTCTGATGTAAAACACrS73FAAGCCTCGTCGGACAAGATTTG6)隨機引物S494GGACGCTTCA測序時標記名稱S494-399M，實測長度376bp；GGACGCTTCAATAATATTGAAATATATTTTTTAAAAAAATATAATAATTGGAATATTGCGTAATTAAGTTTACGTTTTTGGGAATTTCACATATTAAATAATTAATTACATATTTTGAGGTAAATATTCAAGAGACTGTGATTTTCATTAATCAATCATTAGAAGAGAATAAAAGCATTAAAAAAATCTTCAGTTTATTTTAAAAGAAACAGTTGTGACAAATGTTTTTATCAGACAAGACAACAACAAATAATTAAAAAGACAGTGTCCACCGCCAAAAGAAACTCAACTCTAAAGCTTAAATATGAAGAGAATCAAGTCAAAGCCGGAGTCTCTGCAAACATATTGGAACACTTTGTCTGAACCTGAAGCGTCCSCAR引物fS494MGGACGCTTCAATAATATTGrS494MGGACGCTTCAGGTTCAGAC7)隨機引物S494GGACGCTTCA測序時標記名稱S494-1770F，實測長度1771bp；S494-1775F(-47)GGACGCTTCAGAAATATTTAATAAAATAAAAAAAAGACCACTAAAATCTTAAAGACTAAATAGTAAAAAGATAAAGATACAAACGTGTGAAGCAAAACCCAAGCCGACACGTTCAATTCCATCGTTTTGA
TCCGGTTCCGGCAGGCACGAGCTTTAGGCCGGTTGGTTAAAACACGCGCTTTGGACCATTTAGGAAACACAGTCAGGTTCTCGTGATTTCTTGCTTATAATGGGCCCCTCCCACCCATATGGTCAGCTAAACGAGTGAAATTCTAGGGCACACCTTTGATTATTTTTTTTAAATAATCAAAAAATTATTATTAGAAACCGAAAATTATTATTTATTCCAAAGACATGAATTCCTACAAGTCCACAACTGTTGTTTATGGTCAAATCATAAAGCAAAACTAATGTTTTCCAAATAGTTAATGGAAAAAAAGAAAAACAAAAGCAAATGCATCTTGCGTTGTTGGAATGCAAAAAGAGAGAAAACGATACGTACCTAATGTTAATTCTAATTAGTTAGTTATAGAATGAGGAGGTACATTAAAAAGGAAAATTAGTATTAGTACTCAGTTAAGTATGCACGTGTGTGGGAAGTATGGTGGCGAAACTATACAACCAACCCCTAGTAGATGGCTAGTTGTACATGTCTCGTGACGTATACATCATATATATAATAAATACGAACATAGAAATTAATAGGACTTAGTTGTTGCGAATATACGTAAAATCAAATAAAACCAACCATTCAATGTTCTTGGTAAGTAACGAAATAAAACGGAAGCAAGAAGGAGAACCACATAAAAGGGAGCTAACTCCTGTACACGTTGTGCTTCATCTGCCCGTCCGTCAAACTACCACACTCCCTTCTCTTTTCCCCTTTGTCATCTTGTATAATAATATCTCACTCTCCCATGCTTTCTAACATS494-1775F(-48)GGACGCTTCACGGAAGGGCGAAGGCCAAGGAGCTTGGTGAGCTGGTAGTCAGCACCAGGCATGTCAACTCCAGAGGTGGTGCAGAAGACAACGTGTGTGACCTTGGACTTAGGCTGACCCCACTCCTTGATGGCCTTCACTGCTGCATCTTTGCCTAGCTTAGGGACTTCAACCACCACGAGGTCTTGTCTAGCGTCGAGAGAAGGAGCCATGTAGGCGCACATGTTAGGGTTCTCTTTCAAGAACTCCTCGGTCAAGTGCATGTGGCGTTTTCTTATGGTCGACTTATCGCCTATTAGAGTCATAATCAAGTTAACTATGTGAACATACTAATAAGTACAGTTTAAGGTAGAAGACTATTAAATTTTCGGTTTTATCTATTTAATACATTTTTTTTTGTTAGTTAATGAACTAAAAGATACGGATAAAACTGGTGAATTATTTAAATGTATTTTGAAAATGTACAACAAATTTTAAAAACTAAAAATGATAAACGGATGAATTATATGCCAAAATTCTAAATGGAAAAATACAAAGTAGGGTTTGTTAAGACATACACATGCGCTTGAACTTCTCCTTAAGGTCGGTCTTGTGTTCACTGTTGGTGATGCGGAAGTAGTAGTCTGGATACTCAGCTTGGAGCACATGGTTCGCAGGGTTGGCCGTACCTATCGCTAAGATGCCTGCAGGACCGTCTGCTCTCTGTGCCTTTCTG
ATCTCATCCAACGAAGAACGCCCCATCACCATATTAAACCAACTACGTTTTAACTAAGTGTGATCGATGTGTTACTTTGCGTAATAAGCAAGTTATGTATGTATGTTTAGAAAGCATGCAGAGTASCAR引物fS494FGGACGCTTCAGAAATATTTAATArS494FGGACGCTTCACGGAAGGGCGAAG8)隨機引物S266AGGCCCGATG測序時標記名稱S266-260F，實測長度294bp；AGGCCCGATGGAGTTTGTGTAAGAAAATGGGTTTCGGCCGTTTTTAAAATAAAACATTGACGACAAAAAAAAAAAAATAATTTGGCATCTCCCTCCATCTAAATCATGCATGACAAATGAATAAAAAGCTTTTATTATCATATGACGTCTATACAATGCGTATAATATGTTTCCTTTACTTTATTTACTTGTCGTCTTTATCTTATTATATTATATGCTACATTATAGTCATTGTTAAAGTCAGAGACTACAGGTATCATAAGGTTGCAACAATGATTTATCATCATCGGGCCTSCAR引物fS266FAGGCCCGATGGAGTTTGTGTAAGfS266FAGGCCCGATGATGATAAATCATTG。
權利要求
1.一種利用SCAR標記進行大白菜品種鑒定和種子純度檢驗方法，其特征在于，該方法以“冠春”父母本及F1代種子為研究材料進行PCR反應體系優化，篩選特異性引物，進一步對特異片段克隆測序，轉化為SCAR標記，并將該SCAR標記用于“冠春”大白菜品種鑒定和種子純度檢驗，具體包括以下步驟1)材料的準備以春大白菜新品種“冠春”及其親本種子催芽育苗后移栽至大田，在幼苗期單株編號，隨機選取100-200株，于苗期取幼嫩葉片提取DNA備用，成株期根據品種特性鑒定生物學性狀；2)DNA提取采用CTAB法，其過程為，取0.2g幼嫩葉片，液氮下研磨成粉末；加入750μL CTAB提取液后轉入至1.5mL離心管中；然后65℃水浴30min，其間振蕩混勻；分別用等體積的Tris-飽和酚、氯仿、異戊醇混合溶液和等體積的氯仿、異戊醇混合溶液各抽提一次，于常溫下在12000r/min條件下離心2次，每次10min；取上清液加入2倍體積預冷的無水乙醇沉淀DNA，于4℃條件下離心15min；離心轉速為12000r/min，離心后用70％乙醇清洗沉淀2～3次；加入DNA貯存液，經DNA純度檢測證實純化度，存于-20℃冰箱中備用；3)SCAR引物設計母本特異性引物SC134-1200fS134MTGCTGCAGGTGAAGGCTGGTTCrS134MTGCTGCAGGTTATCCTTTTTGGTTG雜種特異性引物SC266-260fS266-260FAGGCCCGATGGAGTTTGTGTAAGfS266-260FAGGCCCGATGATGATAAATCATTG4)SCAR-PCR擴增采用25μL的PCR反應體系，其中包括1×緩沖液，2.0mmol/L MgCl2，2.5mmol/L dNTPs，0.3μmol/L引物，1U TaqDNA聚合酶，30～50ng模板DNA；反應程序SCAR擴增程序為，94℃預變性4min，94℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸90s，循環30次，最后72℃延伸10min；擴增產物在含5μg/mLEB的1.5％瓊脂糖膠，120V下電泳1.0h，電泳后在紫外燈下觀察并照相；5)SCAR標記的特征A、SC134-1200標記用SC134-1200的SCAR引物對“冠春”群體鑒定，在母本和雜交種中可以擴增出S134-1200的特異條帶，而父本及其自交苗中不能擴出S134-1200的特異條帶，因此利用該比較可以正確的鑒定“冠春”反交種子；鑒定群體中有擴增帶單株的比率就是反交種子的雜交率；B、SC266-260標記用SC266-260的SCAR引物對“冠春”群體鑒定，母本、父本均沒有擴增帶，只有真雜種有擴增帶，沒有擴增帶的可能是假雜種；利用該比較可以正確的鑒定“冠春”正交、反交單收以及混收種子；鑒定群體中有擴增帶單株的比率就是反交種子的雜交率。
2.如權利要求1所述的利用SCAR標記進行大白菜品種鑒定和種子純度檢驗方法，其特征在于，所述的Tris-飽和酚、氯仿、異戊醇混合溶液的體積比為Tris-飽和酚∶氯仿∶異戊醇＝25∶24∶1；所述的氯仿、異戊醇混合溶液的體積比為氯仿∶異戊醇＝24∶1。
3.如權利要求1所述的利用SCAR標記進行大白菜品種鑒定和種子純度檢驗方法，其特征在于，所述的DNA貯存液的組成為70％體積分數的乙醇，其中加入0.3moL/L NaAc溶液。
4.如權利要求1所述的利用SCAR標記進行大白菜品種鑒定和種子純度檢驗方法，其特征在于，所述的SC134-1200標記的特異片斷全長1091bp，其核酸序列為TGCTGCAGGTGAAGGCTGGTTCAATATTTGACAATATATTGATCAGTGATGACCCGGAATATGCAAGGAGCATGGTGGATGACTATTTTGCTCAGCACAGAGAGGTAGGCTTCTCCATGCCTTTGGGATACCTTCTTTTTGCTTCTTTTTAGACAAAGTTAAATGAGTTTCTGCATGATTTTATTATAGAAAATGTCTTATTAGTAATCTGATGTGCTTATATATACTCTTCTGACCAGTCTGAGAAGGAGTTATTTGCGGAAGCTGAGAAAGAAAAAAAAGCTAGAGAAGATGAGGTTTGTAGTTTTCAAAACAAGTCCTTACTTGCTTTTAAAATCTTCTCTGTTTATCTTAATCATGATCTCATACAATTTGACGATTGCAGGAAGCTAGGATAGCAAGAGAAGAAGGGGAACGTAGACGAAAAGAGAGGGGTGACCGGTATGGACACAGGGACAGGAGGCATCGTTACAAACGGGTACATACTCAATGAGACCAACTCAGTTCTACAGTTTTCTTTCTCCTTCTCAACACTGTTAGTTCTGGAATATAAGTGAGTGACTAAGTATAAACGTTTTGTTTTGCAGCACCACCGACGTGGTTACATGGACGATTACCATGTAAGTAAACTAAGTGGTTTTCTATTCAACCACTTTTAAATGCTTTATGCGTTTTAGTACTGAATCATCTTAACCGTTTTCGTGTAGGATGAGCTATAAGGCGCAGTGGTGGCCTGGTGGGGGATTTGGCAATGACAACCAATAAAAGCAAGTATTCATTAAAGTCATCATACCTAGAGAGCTGGAAACTATATGGTTGGTTTTTGTAGTTTGTATGATTGTAATATGTATCATATCACTTCTTTTTTTTTTTTGTCATCTGAAGTTTCATATATCACAAAGGTTAACATTGCAAACACCTCCTTTACACGGATCCAACACAAAAAGCAATTCTAAACCAAGGACAAACTAACACTCCAAAGTCTTTAGTGTACCAAAAAATTTTCGAAGGAGACAACTTCAAGTCAAAGAGAGGCCAAACGTTTCTCATTTTCAAAGACGTCCTGCAACCAAAAAGGATAACCTGCAGCA。
5.如權利要求1所述的利用SCAR標記進行大白菜品種鑒定和種子純度檢驗方法，其特征在于，所述的SC266-260標記的特異片斷全長294bp，其核酸序列為AGGCCCCGATGGAGTTTGTGTAAGAAAATGGGTTTCGGCCGTTTTTAAAATAAAACATTGACGACAAAAAAAAAAAAATAATTTGGCATCTCCCTCCATCTAAATCATGCATGACAAATGAATAAAAAGCTTTTATTATCATATGACGTCTATACAATGCGTATAATATGTTTCCTTTACTTTATTTACTTGTCGTCTTTATCTTATTATATTATATGCTACATTATAGTCATTGTTAAAGTCAGAGACTACAGGTATCATAAGGTTGCAACAATGATTTATCATCATCGGGCCT。
全文摘要
本發明公開了一種利用SCAR標記進行大白菜品種鑒定和種子純度檢驗方法，該方法以春大白菜新品種“冠春”及其親本的基因組DNA為模板，通過RAPD分析，建立了雜交種“冠春”雜交種及其親本的RAPD特異指紋圖譜，成功地獲得了一個母本特異性SCAR標記和一個雜種特異性SCAR標記，應用這2個SCAR標記，根據品種指紋圖譜和特異標記可以進行“冠春”雜交種的品種鑒定和種子純度檢驗。通過134個冠春隨機群體的鑒定，鑒定結果與田間鑒定相一致。
文檔編號C12N15/11GK1944677SQ20061010474
公開日2007年4月11日 申請日期2006年10月17日 優先權日2006年10月17日
發明者張魯剛, 王綺, 張明科, 惠麥俠, 張戰風 申請人:西北農林科技大學