調節生物膜生長的方法和組合物的制作方法

專利名稱：：調節生物膜生長的方法和組合物的制作方法調節生物膜生長的方法和組合物發明領域本發明涉及用于在微生物中調節細胞程序性死亡的方法和組合物，并且還涉及用于促進或抑制微生物由生物膜分散的方法和組合物。發明背景生物膜是三維的微生物生長形式，其包括細菌群落以及細菌群落產生的細胞外基質。生物膜普遍存在于環境中并且可以形成在存在水的固體表面上，或者可以形成于混懸液中，例如是絮狀物或顆粒形式。生物膜造成嚴重的工業損害，例如在的流體處理中造成污垢或腐蝕并且會促使管線和容器中的油變酸，所述流體處理例如配水和水處理系統、紙漿造紙系統、熱交換系統和冷卻塔。從公共衛生的角度來看，生物膜還是水系統中重要的病原體來源，所述水系統例如飲水系統、|&水池以及管道。生物膜還與人類中的許多慢性感染相關，例如中耳炎(在耳表面的生物膜)、細菌性心內膜炎(心臟和心臟瓣膜表面上的生物膜)、嚢性纖維化(肺表面上的生物膜)以及腎結石，并且易于在諸如可植入醫療用具等醫療器械上形成生物膜。然而，雖然生物膜在許多情況下具有顯著的有害作用，但是生物膜還可以是有益的。例如，在廢水處理系統中，懸浮絮狀物生物膜或者在膜表面上與表面締合的生物膜據說促進諸如脫氮作用中的營養物去除。因此，明顯亟需能夠清除有害生物膜的有效策略和能夠提高有益生物膜活性的有效策略。生物膜基本上是多細胞微生物群落，其形成和生長取決于成員生物體的不同的多細胞性狀，例如細胞-細胞信號傳導。當信號分子達到足夠的濃度時，胞外信號系統，例如群體感應，被細菌用于評價細胞密度并引起基因表達和表型的變化。這與導致誘導例如毒力因子和/或防御機制的差異基因表達相關，并且還與細胞分化相關，因而與生物膜結合的細胞和自由生活(浮游的)細胞有高度區別。當細胞膜中的細胞分化并且細胞膜成熟時，降低的代謝速率、防御機制的細胞表達以及抗微生物劑滲透細胞膜的能力降低導致提高的抗微生物抗性并且使生物膜尤其難以根除。當前的生物膜控制策略通常瞄準生物膜生長的早期階段并且涉及使用有毒的抗微生物劑。然而，由于其向環境中釋放，所以這樣的有毒試劑其自身具有下游問題。亟需用于生物膜控制的改進的策略。最近發現，生物膜中的銅綠色々支單胞菌CRsewi/o附ow(Maen/g/"osa)細胞在生物膜生命周期的正常過程中經歷細胞程序性死亡和溶解(WebbWa/，2003,Celldeathin尸sewcomow(xsam/g/wosabiofilmdevelopment(銅綠色假單胞菌生物膜生長中的細胞死亡)，5a".，185:4585-4592)。據認為銅綠色假單胞菌生物膜中的細胞程序性死亡是原噬菌體介導的，并且在促進存活細胞的亞群從生物膜分化和分散中起作用。本發明是基于發明人的如下發現，生物膜中細胞程序性死亡的現象與生物膜的生物中的活性氧和活性氮(RONS)的積累相關，并且能夠使用一氧化氮產生劑誘導細胞程序性死亡的過程以及細胞由生物膜向浮游細胞的分散。增加體內一氧化氮濃度的能力使得能夠通過促進細胞程序性死亡來調節并控制生物膜的生長過程，并且增加細胞對抗微生物劑的敏感性，從而提供用于抑制和/或逆轉生物膜生長的途徑。發明概述本發明涉及用于促進微生物由生物膜分散的方法，所述方法包括將所述生物膜暴露于有效量的一氧化氮或有效量的至少一種產生或釋力丈一氧化氮的試劑。本發明還涉及用于促進微生物由生物膜分散的方法，所述方法包括誘導一種或多種活性氧和活性氮在微生物中的積累。本發明還涉及用于抑制生物膜形成和/或生長的方法，所述方法包括使用有效量的一氧化氮或有效量的至少一種產生或釋放一氧化氮的試劑處理易于形成生物膜的表面或其它介質。因此，根據本發明的第一方面，提供用于促進微生物生物膜的分散或防止微生物生物膜形成的方法，所述方法包括將所述生物膜暴露于有效量的一氧化氮或有效量的至少一種產生或釋放一氧化氮的試劑；使用有效量的一氧化氮或有效量的至少一種產生或釋放一氧化氮的試劑處理易于形成生物膜的表面或介質；將有效量的一氧化氮或有效量的至少一種產生或釋放一氧化氮的試劑結合易于形成生物膜的表面或介質；或者在所述生物膜的微生物中或者在能夠形成生物膜的微生物中誘導一種或多種活性氧或氮的積累。所述至少一種產生或釋放一氧化氮的試劑可以包括一種或多種一氧化氮供體。所述一種或多種一氧化氮供體可以選自硝普鈉、S-亞硝基-L-谷胱甘肽、S-亞硝基-N-乙酰青霉胺或其組合。通常，以無毒的濃度提供一氧化氮供體。例如，所述濃度可以在納摩爾、微摩爾或毫摩爾范圍，例如從約1nM至約10mM、或者從約10nM至約5/aM。生物膜可以是與表面締合的或懸浮的。懸浮的生物膜可以是絮狀物或顆粒形式。存在于生物膜中的微生物或者能夠形成生物膜的微生物可以是單一物種或者是多個物種。所述生物膜中的微生物或者能夠形成生物膜的微生物可以包括細菌或真菌或者可以包括上述二者，并且可以包括下列物種中的一種或多種,例如念J朱菌屬(Qm^ias/7/.)、//ormocomi印;.、，￡單胞菌屬(尸5^wdo附o"os交替"f艮單月包菌屬(i^ewc/ofl/^ro附o"as>S/>/7.)、葡萄3求菌屬(&a;/zy/0C0CCW515/7/7.)、鏈3求菌屬(5Vr印tococciws//.)、志賀4干菌屬(SA/ge〃G卿.)、分枝桿菌屬(AfycoZ^"m.謂卿.)、腸球菌屬(五wfmcoccM、埃希桿菌屬C&c/im'c/^、沙門菌屬(iSa/mowe〃a、軍團菌屬(丄eg/owe〃as/t/.)、？耆血4干菌屬(i/ag附o//n7w51s//.)、芽月包桿菌屬(5acz'〃t/51、脫石克瓜菌屬(Z)&SM(/bW6n'os//.)、希瓦氏菌屬(fSAe麗we〃as//,)、地桿菌屬(Geo6a"erW;.)、克雷白桿菌屬(《/eZ^W/a;s;7;7.)、變形桿菌屬(iVoto^^;.)、氣單胞菌屬(v4m附o"as5^.)、節桿菌屬(Jr"n6fl"er印P.)、微球菌屬(Mfcrococ面卿.)、沙雷菌屬卿.)、叫、啉單胞菌屬(Po^/z^ro附o"cw)、梭形軒菌屬(Fi^o6flc,en'w附)以及弧菌屬(^力n'o這些物種中有代表性的實例是白色念珠菌(CawAWaa/6z'ca""、銅綠色假單胞菌CP.aen/g/"osa)、表皮葡萄球菌(5Yfl/7/^/ococci/51e;zV/^7w/cfo)、大腸i矣希才干菌(E^cAen'c//aco//)、蘚才羊芽月包^干菌(丑ac///1^//cAew(/bnw^)、津占質沙、雷菌(iSenYZ"a附arc&scews)、#亥并立斗炎形4干菌CFwso6a"en'Mmw"c/ea^m)k乂及霍舌L瓜菌(F/力n'oCA0/en2e)。所述方法還可以包括將至少一種抗微生物劑結合所述表面或介質，或者將所述生物膜中的微生物或能夠形成生物膜的微生物暴露于至少一種抗微生物劑中來處理所述表面或介質。例如，抗生素可以是氨基葡糖苷，例如妥布霉素，表面活性劑可以是十二烷基硫酸鈉，并且氧化應激誘導劑可以是過氧化氫、次氯酸、氯或氯胺。在通過本發明的方法處理的生物膜微生物或者能夠形成生物膜的微生物中累積的活性氧和活性氮可以包括過亞硝酸根、一氧化氮、過氧化氫和超氧化物自由基。在一實施方案中，所述活性氧和活性氮是過亞硝酸根。可以通過將生物膜暴露于有效量的一氧化氮或有效量的至少一種產生或釋放一氧化氮的試劑來實現活性氧和活性氮的積累。本發明的用于促進生物膜分散或防止生物膜形成的方法可以包括在所述生物膜中的微生物中誘導導致分散的分化事件，或者所述方法可以包括防止在微生物中誘導導致生物膜形成的分化事件。本發明的方法或者可以或還可以包括提高微生物對抗微生物劑的敏感性。本發明還涉及用于處理和/或防止與生物膜生長相關的狀態的方法，其包括對對象給予有效量的一氧化氮或有效量的至少一種產生或釋放一氧化氮的試劑。因此，本發明的用于促進生物膜分散或防止生物膜形成的方法可以包括對對象給予有效量的一氧化氮或有效量的至少一種產生或釋放一氧化氮的試劑，以處理或防止所述對象中與生物膜相關的狀態，任選地同時給予至少一種抗微生物劑。可以將所述試劑和/或所述抗微生物劑涂覆到或者浸入或結合到合適的醫療裝置的表面，所述醫療裝置例如是導管、支架、假體或其它外科或可植入的裝置。本發明還涉及用于促進微生物從生物膜的分散或用于抑制生物膜形成合和/或生長的組合物。因此，根據本發明的另一方面，提供用于促進微生物生物膜的分散或防止微生物生物膜形成的組合物，所述組合物包含一氧化氮、至少一種產生或釋放一氧化氮的試劑、或者一氧化氮和至少一種產生或釋放一氧化氮的試劑，以及合適的載體。所述至少一種產生或釋放一氧化氮的試劑可以包括一種或多種一氧化氮供體。所述一種或多種一氧化氮供體可以選自硝普鈉、s-亞硝基-L-谷胱甘肽、S-亞硝基-N-乙酰青霉胺或其組合。在一實施方案中，所述一氧化氮供體是硝普鈉。在具體實施方案中，所述組合物可以是防污組合物、醫療裝置或其組件、用于醫療裝置的涂層或藥物組合物。所述組合物還可以包含至少一種抗孩(生物劑。所述抗纟效生物劑可以是任何抗微生物劑，例如抗生素、表面活性劑或氧化應激誘導劑。例如，抗生素可以是氨基葡糖苷，例如妥布霉素，表面活性劑可以是十二烷基硫酸鈉，并且氧化應激誘導劑可以是過氧化氫、次氯酸、氯或氯胺。本發明的用于促進微生物生物膜分散或防止微生物生物膜形成的組合物可以在所述生物膜中的微生物中誘導導致分散的分化事件，或者防止在微生物中誘導導致生物膜形成的分化事件；提高所述微生物對抗微生物劑的敏感性；或者可以提供這些效果的組合。本發明還涉及用于處理和/或防止與生物膜生長相關的狀態的組合物。因此，本發明的用于促進微生物生物膜分散或防止微生物生物膜形成的組合物可以適于處理或防止對象的與生物膜相關的狀態，并且可以任選地包含至少一種抗樣t生物劑。本發明還涉及用于維持和/或增強生物膜功能的方法，其包括將所述生物膜暴露于至少一種一氧化氮清除劑和/或至少一種抗氧化劑。因此，根據本發明的另一方面，提供用于維持和/或增強生物膜功能的方法，所述方法包括將所述生物膜暴露于至少一種一氧化氮清除劑、至少一種抗氧化劑、或者至少一種一氧化氮清除劑和至少一種抗氧化劑。在一實施方案中，所述一氧化氮清除劑為2-苯基-4，4，5，5-四曱基-咪唑啉-l-氧基-3-氧化物。抗氧化劑可以選自硫氧還蛋白、過氧化物歧化酶、谷胱甘肽和抗壞血酸。所述方法可以包括在所述生物膜中的微生物中抑制導致分散的分化事件。根據本發明的另一方面，提供用于維持或提高、或者維持并提高生物膜功能的組合物，所述組合物包含至少一種一氧化氮清除劑和/或至少一種抗氧化劑，以及合適的載體。所述組合物可以在所述生物膜中的微生物中抑制導致分散的分化事件。定義本文使用的術語"生物膜，，指任何三維的、基質包圍的、顯示多細胞特性的微生物群落。因此，本文使用的術語生物膜包括與表面締合的生物膜以及混懸液中的生物膜，例如絮狀物或顆粒。生物膜可以包括單一的微生物物種或者可以是混合的物種綜合體，并且可以包括細菌、真菌、藻類、原生動物或其它微生物。本文使用的術語"表面"既包括生物表面也包括非生物表面。生物表面通常既包括生物體的內表面(例如組織和膜)也包括外表面(例如皮膚、種子、植物葉子)，包括細菌的膜和細胞壁。生物表面還包括其它天然表面，例如木材或纖維。非生物表面可以是任何組成的任何人造表面，其支持生物膜的建立和生長。這樣的表面可以存在于工廠和工業設備中。此外，為了本發明的目的，表面可以多孔的(例如膜)或非多孔、剛性的或撓性的。本文使用的術語"分散"由于其涉及生物膜，所以指細胞從包括其它細胞在內的(例如，4皮此，生物膜)表面脫離的過程以及回歸這些細胞的浮游表型或行為。本文使用的術語"細胞程序性死亡"指生物膜中在特定階段發生的生長事件，且其引起自溶、細胞分化和具有特定表型的細胞亞群的生長。本文使用的術語"暴露"指給予或導致接觸。微生物或生物膜可以直接或間接暴露于活性劑。通常，直接暴露是指將試劑給予待處理的微生物或生物膜或使所述微生物或生物膜自身與所述試劑接觸。通常，間接暴露是指對微生物給予活性劑的前體、或給予能夠單獨產生使微生物或生物膜與其接觸。類似地，本文使用的術語"處理(treat)"或"處理(treating)"及其變體指給予或導致接觸。本文使用的術語"有效量，，其意思包括無毒的但足以提供期望效果的試劑的量或濃度。所需的準確量/濃度將取決于下列因素而變化，例如待處理的微生物的種類，待處理的生物膜的范圍、嚴重性和/或年齡，所述膜是否是表面締合的或懸浮的，給予的具體試劑以及給予的方式等等。因此，不可能具體給出準確的"有效量"。然而，對于任何給定的情況，本領域普通技術人員僅僅通過進行常規實驗就可以確定合適的"有效量"。本文使用的術語"無毒的"由于其涉及物質的濃度或量，因而，指物質對細胞沒有直接毒性效應的濃度或量，該濃度或量不會殺死單個的自由生活細胞，但是可以作為引發誘導生物膜中分化過程的信號，所述分化過程涉及細胞程序性死亡響應，因此可以導致細胞亞群的死亡、分散細胞的產生以及生物膜的分散。例如，關于一氧化氮供體，無毒濃度或無毒量可以包含100mM的一氧化氮供體或更少。本文使用的術語"功能"由于其涉及生物膜，因而可以通過任意一個或過多個下列參數進行評價生物膜中微生物的活力、生物膜中微生物的活性、生物膜中微生物的密度、生物膜的壽命以及生物膜執行特定功能的效率，例如在廢水系統中的生物膜的情況下，該功能為營養物的去除。因此，在本發明的上下文中，"維持"生物膜功能指防止或至少充分減少細胞程序性死亡和分散的進展過程，從而微生物活力、微生物活性、生物膜壽命和/或生物膜功能不會顯著降低、"提高"生物膜功能指與不使用本發明處理的生物膜相比，提高或改善任意一個或多個上述參數。本文使用的術語"抑制"由于其涉及生物膜，因而，指完全或部分抑制生物膜的形成和/或生長，并且其范圍還包括與生物膜形成和/或生長相關的生物膜生長或進展的逆轉。此外，抑制可以是永久的或暫時的。在暫時抑制方面，可以在足以產生期望效果的時間內抑制生物膜形成和/或生長。在本說明書的上下文中，術語"包括(comprising)"指"主要包括，但不必須只包括"，此外，詞語"包括(comprising)"的變體，例如"包括(comprise)"和"包括(comprises)"具有相應變化的意思。附圖簡要說明現在僅僅通過示例性的方式，通過參考以下附圖描述本發明。圖1.銅綠色假單胞菌生物膜中細胞死亡和分散事件與小集落結構中活性氧和活性氮的積累關聯。(A)共聚焦顯微照片顯示使用5acLightLIVE/DEAD染料染色的第7天的生物膜(在單獨的小圖中還分別顯示了活細胞和死亡細胞的顯微照片)。白色箭頭指出生物膜中的中空結構。黑色箭頭指出生物膜中的死亡細胞。標尺，50/xm。(B)第7天的生物膜中小集落的共聚焦顯微照片。使用檢測特定RONS的焚光染料對生物膜染色。左側一列是相差圖像，右側一列是熒光圖像，其顯示了在XY(俯視)視圖和XZ(側視)視圖中RONS的積累。標尺，50/mi。圖像是至少三個獨立實驗的代表。圖2.在生物膜上給予SNP的影響以及銅綠色假單胞菌的浮游生長。在存在硝普鈉(SNP)的96孔板中，PAOl細胞生長24小時。通過熒光測量定量浮游生長并且通過結晶紫染色定量生物膜形成。對照，不添加SNP。圖3.產生或釋放一氧化氮的試劑對銅綠色假單胞菌由生物膜向浮游生長轉變的影響。在存在一氧化氮供體、硝普鈉(SNP)、S-亞硝基-L-谷胱甘肽(GSNO)、或S-亞硝基-N-乙酰青霉胺(SNAP)、或SNP和一氧化氮清除劑2-苯基-4,4，5，5-四曱基-咪唑啉-l-氧基-3-氧化物(PTI0)下，PAOl細胞在含有載玻片的培養皿中生長24小時。通過測量上清液的光密度(OD,nm)將浮游生長定量(淺色柱)并且使用染色后載玻片的數字顯微照片的圖像分析，通過測量表面覆蓋度定量生物膜生長(黑色柱)。圖4.SNP處理對銅綠色假單胞菌對抗微生物劑敏感性的影響。在存在或不存在500nMSNP下，PAOl細胞在含有載玻片的培養皿中生長24小時。使用抗微生物溶液處理載玻片上的生物膜30分鐘，使用LIVE/DEAD染料染色以便進行光學顯微鏡分析，并使用數字圖像分析定量(表面覆蓋度百分比)。(A)在存在SNP(淺灰色柱)或不存在SNP(深灰色柱)的情況下，載玻片上的生物膜對抗微生物劑妥布霉素(Tb)、過氧化氫(11202)、十二烷基硫酸鈉(SDS)和次氯酸(HOCl)的敏感性。(B)處理后，相同載玻片的共聚焦熒光顯微照片。圖5.SNP處理對預建立的銅綠色假單胞菌生物膜對抗微生物劑敏感性的影響。在添加500nMSNP之前，銅綠色假單胞菌PAOl在含有載玻片的培養皿中生長24小時。生物膜再生長24小時，然后使用抗微生物溶液處理30分鐘，使用LIVE/DEAD染料染色以便進行光學顯微鏡分析，并使用數字圖像分析定量(表面覆蓋度百分比)。(A)在存在SNP(淺灰色柱)或不存在SNP(深灰色柱)的情況下，載玻片上的生物膜對妥布霉素(Tb)、過氧化氫(H202)和紫外光(UV)的敏感性。(B)處理后，相同載玻片的共聚焦熒光顯微照片。圖6.使用SNP和抗微生物劑組合處理浮游銅綠色假單胞菌細胞。使用抗微生物劑妥布霉素(Tb)或過氧化氫(H202)處理浮游細胞2小時。進行菌落形成單位的平板計數(logCFU/mL)以便評價細菌的活力。圖7.SNP暴露對來自廢水處理污泥反應器的絮狀生物膜分散的影響。未使用10nMSNP處理(A)或使用10nMSNP處理(B)的第13天混合物種絮狀生物膜的共聚焦熒光顯微照片。圖8.使用粘質沙雷菌穿刺的飲用水生物膜-在暴露于O、100nM或500nMSNP18小時后，SNP對生物膜的影響(A)在寡營養瓊脂上活力計數(R2A，重復三次)；(B)富營養瓊脂上活力計數(LBK)，重復三次)；(C)使用顯微鏡分析的表面覆蓋度百分比(5flcLight,重復兩次)。圖9.循環配水系統的串連AR中，在uPVC取樣管中生長3個月的使用粘質沙雷菌穿刺的生物膜。在使用不同濃度的游離氯處理10分鐘前將生物膜暴露于O、100nM或500nMSNP18小時的影響(A)富營養瓊脂上活力計數(LBn),重復三次)；(B)使用顯微鏡分析的表面覆蓋度百分比(5acLight，重復兩次)。圖10.SNP對粘質沙雷菌生物膜分散的影響。圖11.SNAP對粘質沙雷菌生物膜分散的影響。圖12.SNP對霍亂弧菌生物膜分散的影響。圖13.SNAP對霍亂弧菌生物膜分散的影響。圖14.SNP處理增強四環素(6/Ag/mL)對霍亂弧菌生物膜的抗微生物活性。圖15.GSN0對霍亂弧菌生物膜分散的影響。圖16.SNP對大腸埃希桿菌生物膜分散的影響。圖17.SNP對蘚樣芽胞桿菌生物膜分散的影響。圖18.SNP對白色念珠菌生物膜分散的影響。圖19.SNP處理對表皮葡萄球菌生物膜形成的抑制。圖20.SNP處理對核粒梭形桿菌對玻璃表面黏附的抑制。發明的詳細描述銅綠色假單胞菌是普遍存在的、土壤和水傳播的、易于形成單一物種和多物種生物膜的機會致病菌。銅綠色假單胞菌還成為了用于研究生物膜形成和生長的模式微生物。最近關于銅綠色假單胞菌生物膜的研究已經鑒別了來自小集落內部的分散細胞，以及能夠導致分離和脫落事件的細胞的細胞程序性死亡(Sauerda/.,2002,P"i^omowasaen^gzTzosadisplaysmultiplephenotypesduringdevelopmentasabiofilm(銅綠色假單胞菌在作為生物膜生長過程中顯示多種表型),5arf，184:1140-1154;Webb&a/.，2003,Celldeathini^et^omo加saen^g7'"osabiofilmdevelopment(銅綠色假單胞菌生物膜生長中的細胞死亡)，乂185:4585-4592)。隨后，在形成生物膜的其它模式細菌中(Mai-ProchnowWa/.，2004,Biofilmdevelopmentandcelldeathinthemarinebacteriumi^ew^/oatero附o"txsf讓'c她(海洋細菌被嚢交替假單胞菌中的生物膜生長和細胞死亡)，￡Vm>o".M/cro^o/.,70:3232-3238)、在混合物種口腔生物膜中(Hope"a/.，2002，Determiningthespatialdistributionofviableandnonviablebacteriainhydratedmicrocosmdentalplaquesbyviabilityprofiling(通過描繪活力來確定含水樣么觀牙菌斑中的存活和非存活細菌的空間分布)，《/.々少/.M/craZ)/o/.,1993:448-455)、以及在廢水處理過程中混合物種顆粒生物膜中(Meyer&a/.,2003，Microscalestructureandfunctionofanaerobic-aerobicgranulescontainingglycogenaccumulatingorganisms(含有積累糖原微生物的厭氧-好氧顆粒的顯孩i結構和功能)，M/cm&o/.￡co/.，45:253-261)也報道了細胞程序性死亡，從而暗示細胞程序性死亡是細菌生物膜生長的普遍特征。通過增強或抑制的方式，利用引發生物膜細胞的細胞死亡和脫落的機理將會帶來用于在醫療、工業以及生物處理等廣泛的范圍內控制生物膜的新技術。使用用于檢測并分析生物膜中活性氧和活性氮(RONS)的基于熒光染料的體系，本發明發現在銅綠色假單胞菌生物膜中積累RONS過亞硝酸根(ONOCT)。過亞硝酸根是具有較寬生物效應的有效的氧化劑。其能夠與大量其它生物分子反應并引起細胞損傷。過亞硝酸根的直接前體是一氧化氮，一氧化氮是生物體系中廣泛分布的細胞間和細胞內信號分子。一氧化氮迅速與包括氧衍生的基團在內的大量化合物反應。在一種這樣的反應中，一氧化氮迅速與超氧化物反應以生成過亞硝酸根NO+02—ONOO國。發明人發現，使用低無毒濃度的一氧化氮供體化合物處理生物膜誘導細胞程序性死亡和細胞從生物膜分散，這造成浮游細胞與生物膜細胞之比的升高以及生物膜的表面覆蓋度的降低。因此，本文首次公開了這樣的證據，能夠使用低無毒濃度的一氧化氮來控制生物膜細胞的行為過程。相反地，毒性濃度的一氧化氮不會實現細胞由生物膜的分散，反而會促進生物膜的生長。因此，本發明一方面涉及用于促進微生物由生物膜分散的方法，所述方法包括將所述生物膜暴露于有效量的一氧化氮或有效量的至少一種產生或釋放一氧化氮的試劑。本發明還涉及在微生物中誘導細胞程序性死亡的方法，其中將所述生物膜暴露于有效量的一氧化氮或有效量的至少一種產生或釋放一氧化氮的試劑，并且還涉及抑制生物膜形成和/或生長的方法，其中使用有效量的一氧化氮或有效量的至少一種產生或釋放一氧化氮的試劑處理易于形成生物膜的表面。本發明人還發現，使用一氧化氮供體進行的處理提高了生物膜和浮游細胞對多種抗微生物劑的敏感性。因此，本發明還提供用于提高微生物對抗微生物劑敏感性的方法和組合物。本領域技術人員應當理解，可以直接使用一氧化氮以實現期望的效果，或者可以使用任何能夠產生或釋放一氧化氮的試劑。所述試劑可以在待處理微生物的外部產生或釋放一氧化氮，或者更通常地在體內產生或釋放一氧化氮。本文使用諸如硝普鈉等一氧化氮供體舉例說明本發明的方法，但是本領域技術人員可以理解本發明并不限于此。適于本發明使用的一氧化氮供體的實例包括，但不限于硝普鈉SNP)、S-亞硝基-L-谷胱甘肽(GSNO)、GSNO單乙基酯、S-亞硝基-N-乙酰青霉胺(SNAP)、葡萄糖-SNAP、L-精氨酸、^,,-二亞硝基-^,,-二曱基苯二胺(B麗3)、AA,AT-二亞硝基苯二胺-A/;Ar-二乙酸(BNN5)、BNN5-Na、BNN5曱酯、2-水楊酸-3-硝基氧甲苯基酯(B-NOD)、dephostatin、3，4畫dephostatin、二乙胺NONOate、二乙胺NONOate/AM、S,S，-二亞硝基二硫酚、S-亞硝基卡托普利、NG-羥基-L-精氨酸單乙酸鹽、Angeli鹽、l-羥基-2-氧-3-(3-氨丙基)-3-異丙基-l-三氮烯(NOC-5)、1-羥基-2-氧-3-(N-3-曱基-氨丙基)-3-曱基-1-三氮烯(NOC-7)、6-(2-羥基-l-曱基-2-亞硝基肼基)-N-曱基-l-hyxanamine(NOC-9)、l-羥基-2-氧-3-(^乙基-2-氨乙基)-3-乙基-1-三氮烯^0(:-12)、2,2，-(羥基亞硝基亞肼基)雙-乙胺(NOC-18)、(土)-(E)-曱基-2-[(E)-肟基]-5-硝基-6-曱氧基陽3-己烯酰胺(NOR-1)、(±)-(E)-4-乙基-2-[(E)-將基-5-硝基-3-己烯酰胺(NOR-3)、(士)-N-[(E)-4-乙基-2-[(Z)-肟基]-5-硝基-3-己烯-l-基]-3-吡啶酰胺(NOR-4)、4-苯基-3-N-氧化噪二唑腈、PROLI/NO(L-脯氨酸的曱醇鈉的曱醇溶液)、3-morphorlinosydnonimine(SIN-1)、S-亞硝基-N-戊酰青霉胺(SNVP)、精胺NONOate、亞硝酸乙酯和鏈脲霉素。通常，可以在Feelisch,M.和Stamler,J.S.編輯的"一氧化氮研究中的方法(MethodsinNitricOxideResearch)"，JohnWiley&Sons,NewYork,1996，71-115頁中找到用于本發明目的的包括S-亞硝基、O-亞硝基、C-亞硝基和N-亞硝基化合物及其硝基衍生物以及金屬NO復合體在內，但并不排除其它產生NO的化合物的一氧化氮供體，以參考的方式將上述公開的內容并入本文。本領域技術人員已知多種其它一氧化氮供體，并且本發明并不受到所使用的具體供體的限制。事實上，可以根據個案選擇用于本發明具體應用的合適供體。通常使用低無毒濃度的產生或釋放一氧化氮的試劑。所述濃度可以是納摩爾、微摩爾或毫摩爾級的。在具體實施方案中，濃度可以是約1nM至約100mM、約10nM至約50mM、約25nM至約50mM、約50nM至約25mM、約100nM至約10mM、約200nM至約1mM、約1nM至約10mM、約10nM至50jwM、約10nM至25jiiM、約10nM至10jiiM、約10nM至5ptM、約10nM至1/xM、或約10nM至500nM。實現期望效果的最適合的濃度將取決于眾多因素并且本領域技術人員可以使用常規實驗加以確定。這樣的因素包括，但不限于所使用的具體試劑，給予試劑的方法或途徑，生物膜的性質、結構和年齡，待處理微生物的種類等等。本發明還提供用于促進微生物從生物膜分散、用于誘導微生物中細胞程序性死亡、用于抑制生物膜形成和/或生長、以及用于提高微生物對抗微生物劑敏感性的組合物。通常，所述組合物為進行本發明方法提供手段。上述的本發明方法和組合物能夠應用在^f艮多環境和情況中。下面是這些方法和組合物在某些常見領域中應用的簡要討論。然而，本領域技術人員容易理解，這些方法和組合物將潛在地適用于在生物膜生長是問題的任何環境或情況下，或者在期望抑制微生物生長的任何環境或情況下。應用本發明方法和組合物的一領域是在海洋、咸水和淡水防污涂料或涂層中，例如在處理艦船外殼、水產養殖設備、漁網或其它水中結構中。所述方法和組合物還用于多種工業和家庭應用，其包括但不限于供水貯水池和給水管、排水管(家庭或工業范圍)、處理設備，例如冷卻塔、水處理廠、乳制品加工廠、食品加工廠、化學品制造工廠、藥物或生物藥物制造工廠、油管和煉油設備、以及紙漿造紙廠。還可以將本發明的組合物用于涂覆包括可植入醫療裝置在內的醫療裝置，其包括但不限于靜脈導管，泌尿導管，支架，諸如人工關節、心臟、心瓣膜或其它器官等假體、起搏器、外科板和釘、以及隱形眼鏡。還可以涂覆其它醫療設備，例如導管和透析設備。本發明的方法和組合物還用于傳染病的處理。例如，可以使用本發明的方法和組合物處理與生物膜形成相關的多種細菌感染，例如嚢性纖維化、中耳炎、細菌性心內膜炎、腎結石、軍團病、尿路感染、肺部感染、牙菌斑、齲齒以及與外科手術或燒傷相關的感染。因此，本發明的組合物可以凈皮組方為藥物組合物或成為例如外科敷料、漱口劑、牙膏或鹽水的組分。可以在將物體/物品用于或暴露于含有形成生物膜的微生物的環境之前很久，就將本發明組合物應用于或涂覆到或結合感興趣的物體/物品的表面，或者可以在即將將物體/物品用于或暴露于含有形成生物膜的微生物的環境時，將本發明組合物應用于或涂覆到或結合感興趣的物體/物品的表面。本發明的組合物可以是任何合適的形式。例如，可以將本發明的組合物配制為涂料、蠟、其它涂層、乳液、溶液、凝膠、混懸液、珠、粉末、顆粒、片劑、薄片或噴霧劑。技術人員將認識到，合適的制劑將取決于具體的應用和計劃的輸送途徑。通常，本發明的組合物還包括載體、稀釋劑或賦形劑。本領域技術人員已知合適的載體、稀釋劑或賦形劑。稀釋劑、佐劑和賦形劑必須是以和組合物中其它成分相容的方式"可接受的"，并且在藥物組合物的情況下，對其受體是無害的。載體可以是液體或固體。在液體載體的情況下，液體可以是水溶劑或非水溶劑。通常，在防污和其它工業應用中，諸如涂料或其它表面涂層形式的組合物使用能夠在時間和/或空間上控釋活性劑的載體。本領域技術人員已知多種實現控釋生物活性劑的方法并且所述方法可以包括例如將活性劑封裝在合適的聚合物或基于聚合物的產品中。聚合物可以是無機聚合物或有機聚合物，例如聚烯烴、聚醚、聚酯、聚酰胺、聚脲或多肽。本領域技術人員已知用于提供控釋的合適的聚合物，例如美國專利第6,610,282號公開的內容，以參考的方式將其公開內容并入本文。通常，聚合物自身的性質以及環境因素(例如pH、溫度等)決定了物質的釋放速率。控釋系統能夠緩慢并連續高達數年地輸送物質。本領域技術人應當理解，大量的控釋系統能夠用于輸送本發明的試劑。僅僅作為實例，釋放可以是擴散控制的、化學控制的或溶劑活化的。在擴散控制系統中，對于整體釋放速率來說，包在聚合物基質中的試劑的擴散是確定速率的因素。一種類型的擴散控制系統使用貯存裝置，其中所述試劑形成被惰性擴散障礙物圍繞的核。這些系統包括膜、膠嚢、微嚢、脂質體以及中空纖維。或者，所述裝置可以是整體裝置，其中所述活性劑分散或溶解在惰性聚合物中。經由聚合物基質的擴散是限速步驟，并且聚合物的選擇及其對待釋放試劑的擴散和分配系數的影響部分地決定釋放速率。在通常的化學控制系統中，聚合物隨著時間的流逝而降解并釋放與逐漸腐蝕成比例的量的試劑。使用可生物消蝕的或懸垂的鏈能夠實現化學控制。在可生物消蝕的系統中，所述試劑理想地以與整體擴散系統相同的方式在聚合物中均勻分布。當圍繞所述試劑的聚合物消蝕時，所述試劑脫逸。在懸垂鏈系統中，通過允許通過本領域已知的任何期望并可實施的物理或化學方法進行釋放的化學作用，所述試劑可以與聚合物共價結合，例如通過由于水或酶導致的鍵斷裂。在通常的溶劑活化控制系統中，將活性劑(其可以是一氧化氮、產生或釋放一氧化氮的試劑、或一氧化氮清除劑或抗氧化劑)溶于或分散在聚合物基質中，并且所述活性劑不能擴散通過該基質。將滲透壓用作釋放所述試劑的驅動力。在一種類型的溶劑控制系統中，當環境流體(例如水)滲透基質時，聚合物(例如水凝膠)膨脹并且其玻璃轉化溫度低于環境(宿主)溫度。因此，膨脹的聚合物處于橡膠態并且使含在其中的活性劑擴散通過密封劑。能夠以基于本領域技術人員公知的不同合成方法以若干一般途徑實現生物活性劑與聚合物的化學鍵合，所述合成方法包括在預先形成的聚合物上進行反應；在天然存在的聚合物上進行反應；含有活性成分的乙烯基單體的聚合；以及逐步增長聚合。當生物活性劑與聚合物化學鍵合時，不得不通過化學反應-通常是酶、水解、熱或光化學反應來使所述鍵斷裂。多種化學和物理變量能夠影響^t斷裂的速率以及隨后的化學附著材料由聚合物的釋放，所述變量包括不穩定鍵的性質、間隔基團的長度、分子量、親水性、相鄰基團效應、環境因素以及物理形式和尺寸。在防污應用中，本領域已知自拋光防污涂層。這樣的涂層通常基于異丁烯酸三丁基錫、異丁烯酸甲酯，以及軟化膜單體，例如丙烯酸-2-乙基己酯。有機錫聚合物通常起涂料粘合劑的作用。這樣的涂料還可以包含有毒的添加劑，例如氧化亞銅或三有機錫化合物。此外，還可以存在諸如顏料、觸變劑等通常的涂料添加劑。在通常的堿性海水中，聚合有機錫粘合劑逐漸被水解，并且三丁基錫以活性防污劑的形式被釋放。所形成的水解的聚合物是水溶性的或者是水膨脹的，并且被移動的海水容易地從表面腐蝕掉,暴露涂料的新鮮表面。對于藥物應用，本領已知大量合適的控釋系統。例如，可以使用貯器或基質裝置形式的聚合膠粒或微嚢(微粒、微球或納米顆粒)，或者含有親水和/或可瀝濾添加劑的聚合物可以含有所述試劑，所述聚合物例如第二聚合物、表面活性劑或增塑劑等，以便得到多孔裝置，或者釋放藥物的裝置可以是滲透壓"控制，，的(貯器或基質裝置)。還可以使用大的籠狀分子，例如C60富勒烯('巴基球，)或超支化(星形爆發)樹枝聚合物。本領域技術人員容易理解，上述輸送系統和方法僅僅是可以用于本發明的合適的方法和系統的實例。可以使用任何其它合適載體和輸送系統以便實現本發明實施方案中期望的試劑應用方法。藥物可接受的稀釋劑的實例是除鹽水或蒸餾水；鹽水；基于植物的油，例如花生油、紅花油、橄欖油、棉子油、玉米油、芝麻油、例如花生油、紅花油、橄欖油、棉子油、玉米油、芝麻油、落花生油或椰子油；硅酮油，包括聚硅氧烷、例如聚曱基硅氧烷、聚苯基硅氧烷以及聚曱苯基硅氧烷；揮發性硅酮；礦物油，例如液體石蠟、軟石蠟或角鯊烷；纖維素衍生物。例如曱基纖維素、乙基纖維素、羧曱基纖維素、羧曱基纖維素鈉或羥丙基曱基纖維素；低級烷醇，例如乙醇或異丙醇；低級芳醇；低級聚烯基二醇或低級烯基二醇，例如聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇、丙二醇、1,3-丁二醇或甘油；脂肪酸酯，例如棕櫚酸異丙酯、十四酸異丙酯或油酸乙酯；聚乙烯吡咯烷酮；瓊脂；角叉菜膠；西黃蓍膠或阿拉伯膠以及礦脂。通常，所述載體將占組合物的1%至99.9%重量比。對于藥物應用，可以將組合物組方用于任何途徑的輸送，例如口服、局部、腔內、膀胱內、肌內、動脈、靜脈、鼻內、肺內或皮下。由于本發明人發現一氧化氮和產生或釋放一氧化氮的試劑導致微生物對抗微生物劑敏感性的增加，所以可以將本發明的方法與至少一種抗微生物劑組合使用。可以使用任何合適的抗微生物劑，例如抗生素、去污劑、表面活性劑、誘導氧化應激的試劑、細菌素和抗微生物酶、肽以及噬菌體。所述抗微生物劑可以是天然的或合成的。事實上，可以根據個案為本發明的具體應用選擇使用的抗微生物劑，并且本領域技術人員應當理解，本發明的范圍不受具體抗微生物劑的性質和特性的限制。僅僅是示例，合適的抗生素包括，但不限于/5-內酰胺、單青霉烯類、羧基青霉烯類、氨基糖苷類、喹諾酮類、大環內酯類、林可酰胺類、四環素類、鏈陽性菌素、#唐肽類、哌，秦利福霉素類、磺胺類、氯霉素、萘啶酸、含吡咯的化合物以及肽類抗生素。抗微生物酶包括。但不限于脂肪酶、鏈霉蛋白酶、裂合酶(例如海藻酸裂合酶)以及多種其它的蛋白水解酶和核酸酶。本領域技術人員應當理解，根據本發明的方法，可以同時、或以任意順序依次地或在不同時間給予組合的每一組分，以便提供期望的效果。或者，將組分一起組方在單一計量單位中作為組合產品。因此，本發明的組合物，除了一氧化氮和/或產生或釋放一氧化氮的試劑以外，還可以包含至少一種抗孩￡生物劑。如本文所述，本發明人還發現，使用一氧化氮清除劑逆轉了所觀察到的使用一氧化氮供體SNP對生物膜以及浮游生長的影響，從而為在有益情況下抑制細胞程序性死亡和抑制細胞由生物膜分散以及維持和/或提高生物膜的活性提供途徑。因此，本發明涉及維持和/或增強生物膜功能的方法，其中將所述生物膜暴露于至少一種一氧化氮清除劑和/或至少一種抗氧化劑。本發明還涉及抑制微生物中細胞程序性死亡的方法，其中將所述生物膜暴露于至少一種一氧化氮清除劑和/或至少一種抗氧化劑。本發明還提供用于實現上述方法的組合物。因此，本發明的方法和組合物使得能夠通過使用一氧化氮清除分子和RONS淬滅分子控制生物膜的壽命、活力、密度、活性和/或效力。適于維持和/或增強生物膜功能或抑制細胞程序性死亡的試劑包括一氧化氮清除劑，例如2-苯基-4，4,5,5-四曱基-咪唑啉-l-氧基-3-氧化物(PTIO)、羧基-PTIO、N-(二硫代羧基)肌氨酸(DTCS)、N-曱基-D-葡糖胺二硫代氨基曱酸酯(MGD)、(+)-蕓香苷水合物和血紅蛋白，并且還包括抗氧化劑，例如硫氧還蛋白、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽和抗壞血酸。本領域技術人員容易理解，本領域大量已知的其它一氧化氮清除劑和抗氧化劑同等地適用于本發明，并且本發明并不受到所使用的具體試劑的限制。事實上，可以根據個案選擇用于本發明具體應用的合適試劑。可以如上所述配制含有這樣試劑的組合物。本領域技術人員應當理解，涉及生物膜調節的本發明的方法和組合物適用于單一物種或混合物種的生物膜。本發明涉及的細菌物種可以是能夠形成生物膜或有助于生物膜的任何物種。目標微生物物種可以包括真菌以及革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌，所述真菌包括酵母和絲狀真菌。本發明感興趣的生物膜包括選自但不限于以下的微生物念珠菌屬(CawAWa(包4舌白色念珠菌(C.a/6/ca打s))，Hormoco;ii's(包#舌i/.ms/"ae)，々支單月包菌屬(尸5^i/f/omo"fls例如銅纟錄色寸艮單胞菌(尸.^"Mg7'WOSfl)，交替假單胞菌屬CPsgM^/ofl/化rO膨"fl5151/7/7.),例如被嚢交替假單胞菌(尸.^m'ca^),葡萄球菌屬(&flp/^/ococc^印p.)，例如金黃色葡萄球菌(S.m/MM力(包括耐曱氧西林和耐萬古霉素金黃色葡萄球菌)和表皮葡萄球菌，鏈球菌屬(S&e/7tococcM印;.)，例如變異鏈王求菌OS./m^z"W)、萆毛鏈球菌(義soZ^"m",志賀桿菌屬0SA/ge〃a例如弗氏志賀菌(S.y/exen')、志賀痢疾桿菌(S.分枝桿菌屬(M少co^7"m'M附卿.)，例如結核分歧桿菌(M.m6erCM/057i)，腸；求菌屬(5V2&rOCOCCMS>S/7/7.),<列^!口糞腸J求菌(￡.,埃希桿菌屬Cfoc/^nWn'a^/7.)，例如大腸埃希桿菌(五.co"),沙門菌屬(Sfl/mowe〃a印;.)，例如鼠傷寒沙門菌^/7/n'mMn^m)、傷寒沙門菌/y//n〕和腸炎沙門菌e"&n-"cfa)，軍團菌屬(丄eg/o"e〃a)，例如嗜肺軍團菌(丄p"ewmo;/n7fl),嗜血4干菌屬(//ae附op^7"51印j!7.),例如流感嗜血桿菌(//.Z"y7Me"zae)、芽胞桿菌屬CBfl"7/w印;.)，例如蘚樣芽胞桿菌(5.//c/^m/onrni)，硫酸鹽還原和鐵還原細菌(例如脫硫弧菌屬(Z)^w(/bW6n'o包括尋常脫硫弧菌(Z).vw/gan's)和脫硫脫硫弧菌(D.^"http://"rz'cfl""，希瓦氏菌屬(幼e麗"e〃a卿.)，包括腐敗希瓦氏菌(S./M&e/ac/ew)，地桿菌屬(Geo6acter包括金屬還原地桿菌(G.mem肌Mf/Mce";s)，克雷白桿菌屬(《/efe&〃a印p.),例如肺炎克雷白桿菌(；7wo/附om'ae),變形桿菌屬(尸ratei^w少.)，例如奇異變形桿菌(尸.m^fl6z7^)，氣單月包菌屬(v4eromow(M57/.)，節4干菌屬(v4^/^o6ac化r57p.)，《鼓5求菌屬(M/cracoccws;;7.),沙雷菌屬(Serra"as;/7.)，例如粘質沙雷菌(乂m『c&sce似)，口卜啉單胞菌屬CPoA7A,omowos5/p.)，例如逸艮p卜啉單月包菌(尸.g/wgzV(2fc)，才炎形#干菌屬(Fwso6flC&n'wm印p.)，例如核4立梭形桿菌(尸.WMc/eWMm)以及弧菌屬(Fz力n》)，例如霍亂弧菌(KC/io/erae)。微生物物種可以好氧的、厭氧的、兼性的、耐氧的、恐氧的或微需氧的。或者，本領域技術人員應當理解，在本發明的某些應用中，待處并非是關鍵的。通過參考以下具體實施例，將更加詳細地描述本發明，不應以任何方式將這些實施例理解為是對本發明范圍的限制。實施例對于實施例1至3中描述的生物膜研究，使用由MarieAllesen-Holm慷慨捐贈的銅綠色假單胞菌菌抹PA01和含有插入染色體中的綠色熒光蛋白(GFP)的銅綠色假單胞菌菌抹PA01-GFP。在37°C下，在LuriaBertani(LB)培養基中進行常規過夜振蕩培養。在如其它文獻(Webbetal"2003，Celldeathin尸5"ew^/o附oww"erwg/wayobiofilmdevelopment(銅綠色假單胞菌生物膜生長中的細胞死亡)，《/.5a"enW.,185:4585-4592)所述的改進的M9基本培養基中，進行生物膜和浮游實驗，含有5mM葡萄糖的改進的M9基本培養基用于連續培養實驗而含有20mM葡萄糖的改進的M9基本培養基用于間歇實驗。實施例1.生物膜中細胞死亡和分散與成熟小集落中過亞硝酸根積累相關如前所述(Molleretal"1998，Insitugeneexpressioninmixed-culturebiofilms:evidenceofmetabolicinteractionsbetweencommunitymembers(混合培養生物膜中的原位基因表達群落成員之間代謝相互作用的證據)，五nvz'ra".M/cra^o/.,64:721-732),在室溫下于連續培養器(通道尺寸，1x4x40mm)中培養銅綠色假單胞菌PAOl用于生物膜產生。使用0.5mL過夜細胞培養物接種通道并且在室溫下無流動地孵育1小時。然后以0.2mm.s"的流動細胞平均流速開始流動，該流動對應于雷i若^t為0.02的層流。為了研究生物膜生長期間的細胞死亡，使用LIVE/DEAD5acLight細菌活力試劑盒(MolecularProbes)對生物膜染色，其中使用SYT09對活細胞進行特異性染色，并且使用碘丙錠對死細胞進行特異性染色。將染料的儲液在改進的M9培養基中稀釋為3^L.mL"并將其注射入液流通路中。使用帶有異硫氰酸熒光素和若丹明異氰酸四甲酯濾光器的共聚焦激光掃描顯微鏡(01ympus)，分別將SYTO9染色的活細胞和碘丙錠染色的死亡細胞顯像。觀察到，在7天后，銅綠色假單胞菌生物膜經歷可高度重現模式的細胞死亡和分散，以及這些事件導致在生物膜中形成中空菌落(圖1A-白色箭頭指向中空結構；黑色箭頭指向死亡細胞)。為了研究特定活性氧和活性氮(RONS)的作用以及檢測在死亡和分散期間在生物膜結構中積累的特定RONS，在液流通路中注射一系列活性熒光染料，每一活性熒光染料靶向不同的RONS,并且在進行共聚焦激光掃描顯微鏡觀察之前在黑暗中孵育該一系列活性熒光染料30分鐘。所研究的RONS是一氧化氮(NO)、過亞硝酸根(ONOCT)、過氧化氫(11202)和超氧化物自由基(O一)。使用100/AM的DAFFM-DA(MolecularProbes),儲液為5mM的DMSO溶液，來4全測一氧化氮(KojimaWa/"1999,Fluorescentindicatorsforimagingnitricoxideproduction(用于成像一氧化氮產生的熒光指示劑)，C&m./"L五J.38:3209-3212),使用15/*M的二氫若丹明123(DHR)(Sigma),儲液為2.5mg'mL"的乙醇溶液，來檢測過亞硝酸根(Crow,1997,Dichlorodihydrofluoresceinanddihydrorhodamine123aresensitiveindicatorsofperoxynitriteinvitro:implicationsforintracellularmeasurementofreactivenitrogenandoxygenspecies(二氯二氬焚光素和二氫若丹明123是體內過亞硝酸根的敏感指示劑用于活性氮和活性氧的細胞內測量的暗示)，MYn'cOaVfe,1:145-157)，使用100的羧基-H2DCF-DA(MolecularProbes),儲液為10mM的DMSO溶液，來檢測過氧化氫，以及使用10/iM的二氫溴化乙啶(HEt)(Sigma),儲液為lmg.ml/1的l%DMSO的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)溶液，來纟企測超氧化物自由基(Bindokas"1996,Superoxideproductioninrathippocampalneurons:selectiveimagingwithhydroethidine(在大鼠的海馬神經原中超氧化物的產生使用二氬溴化乙啶的選擇性成像)，A^i/ms"'.16:1324-1336)。使儲液保持冷凍并進行遮蔽避光。使用前在改進的M9培養基中新鮮制備最終溶液。如圖IB所示，對照圖像揭示，生物膜中的細菌顯示低水平的自身熒光。使用兩種RONS特異性染料檢測到陽性熒光HEt檢測超氧化物自由基O一，以及DHR以明顯更高的熒光水平檢測到過亞硝酸根ONOO-。光場像(左側圖)顯示熒光發生在成熟的、經歷如圖1A所示的死亡和分散事件的小集落中。使用用于檢測過氧化氫的H2DCF得到的陰性結果與在銅綠色假單胞菌生物膜中之前報道的過氧化氫酶的過表達相關聯(Stewartefa/"2000，Effectofcatalaseonhydrogenperoxidepenetrationinto尸sei/fifo附owowaen/g/wosflbiofilms(過氧化氫酶對過氧化氬穿透進入銅綠色假單胞菌生物膜的影響)，五"Wra".M/cra^o/.66:836-838)。DHR對過亞硝酸根是特異性的并且不能被其它RONS單獨氧化(Crowaa/.，1999)。因為過亞硝酸根是超氧化物和一氧化氮的直接產物，所以令人吃驚的是使用DAFFM沒能檢測到一氧化氮。然而，一氧化氮極度活潑，并且已知一氧化氮和超氧化物之間的反應以擴散限制方式瞬間進行(KelmWfl/.，1997,Thenitricoxide/superoxideassay.InsightsintothebiologicalchemistryoftheNO/02-interaction(—氧化氮/過氧化物測定。對NO/(V相互作用的生物化學的領悟),丄歷o/.CAem.272:9922-9932)，這可以阻止使用DAFFM檢測到一氧化氮。上述結果表明RONS過亞硝酸根在高細胞密度的生物膜細胞中積累并引發成熟生物膜中小集落中的細胞死亡。實施例2.—氧化氮調節銅綠色假單胞菌的生物膜生長相對浮游生長一氧化氮是生物系統中廣泛分布的細胞間和細胞內信號分子。它還是過亞硝酸根的重要前體，過亞硝酸根是具有眾多生物學作用的有效氧化劑。一氧化氮易于與超氧化物反應以生成過亞硝酸根<formula>formulaseeoriginaldocumentpage28</formula>因此，發明人研究了一氧化氮供體硝普鈉(SNP)對銅綠色假單胞菌的浮游和生物膜生長的影響。SNP在體內釋力文一氧化氮(SmithWa/.,2001，Mechanismsofnitricoxidereleasefromnitrovasodilatorsinaqueoussolution:reactionofthenitropmssideion([Fe(CN)5NO]2-)withL-ascorbicacid(由硝酸血管舒張劑的水溶液釋》丈一氧化氮的機理硝普鹽離子([Fe(CN)sNO]O與L-抗壞血酸的反應)，《//"org歷oc/^m,87:165-173)。將96孔板中的生物膜用于這些實驗。將100/iL在改進的M9培養基中1/1000稀釋的過夜培養物接種在96孔板(Sarstedt)中并于37。C下以120rpm振蕩培養24小時。向培養物中加入濃度為25nM至100mM的SNP。每個處理重復4組。生長過夜后，將上清液轉移至新板的孔中。使用PBS洗滌孔2次并使用120^L的結晶紫染色20分鐘。然后再使用PBS洗滌3次并在120pL的無水乙醇中稀釋。通過測量OD49。皿定量生物膜形成，并使用熒光測量定量浮游生長。如圖2所示，在高濃度時(毫摩爾范圍內)，與未處理的生物膜對比，觀察到生物膜形成的增加和浮游生長的降4氐(25mM-100mMSNP)。在這些濃度下，SNP對多種細菌物種是有毒的；SNP釋放高、有毒;農度的一氧4b氮(JoannouWa/.，1998，CharacterizationofthebactericidaleffectsofsodiumnitropmssideandotherpentacyanonitrosylcomplexesonthefoodspoilagebacteriumC/oWnVZ/wms;orogewas(石肖普納和其它戊氰基亞硝酰基配合物對食物腐敗細菌產芽胞梭狀芽胞桿菌殺菌效應的表征)，徹/￡謂.謂M/cto編，64:3195-3201;Kelley"a/"1998,Induciblenitricoxidesynthaseexpressionisreducedincysticfibrosismurineandhumanairwayepithelialcells(嚢'I"生纟千纟ll4b鼠類和人類氣管上皮細胞中可誘導一氧化氮合酶表達的降低)，《/(^"7^^,102:1200-1207)。在較低濃度時，即在微摩爾和納摩爾范圍內，觀察到生物膜形成的降低和浮游生長的增加。使用500nMSNP重復觀察到了最大的效應并且將該濃度用于此實施例和實施例3中所述的后續實驗。為了證實在所觀察到的事件中一氧化氮的作用，使用兩種不同的一氧化氮供體，S-亞硝基-L-谷胱甘肽(GSNO)和S-亞硝基-N-乙酰青霉胺(SNAP)來代替SNP，每一濃度為1jLtM。如圖3所示，類似于SNP，這兩種一氧化氮供體也均造成生物膜形成的降低和浮游生長的增加，雖然其程度低于使用SNP觀察到的。這些結果表明，在低濃度時，一氧化氮發出由生物膜向浮游表型轉變的信號。圖3還顯示一氧化氮清除劑2-苯基-4，4,5,5-四曱基-咪唑啉-l-氧基曙3畫氧化物(PTIO)的影響。除500nM的SNP外，還向生長中的生物膜加入濃度為lmM的PTIO。PTIO的加入在浮游和生物膜表型中均使SNP影響的降低了40%或更多。實施例3.暴露于低水平的一氧化氮增加了銅綠色假單胞菌細胞對抗微生物劑的敏感性已知浮游細胞比生物膜細胞對抗生素的敏感性高多達1000倍(Brooun^a/"2000,Adose-responsestudyofantibioticresistanceini^d/i/omowwaen/gz'wosabiofilms(銅綠色々I單胞菌生物膜中抗生素耐藥性的劑量國響應研究),Jw"mz'cro6C/emoAer，44:640-646;Davies，2003，Understandingbiofilmresistancetoantibacterialagents(理解生物膜對抗微生物劑的抗性)，及evZfecov,2:114-122)。與成熟生物膜斗爭的主要困難之一是這種對抗微生物劑降低的敏感性。實施例2中的上述結果表明，一氧化氮促進浮游模式的生長超過抗性更強的生物膜表型。因此，發明人研究了一氧化氮暴露是否還可以恢復對生物膜細胞的抗微生物敏感性。檢測了多種抗微生物劑對暴露于低水平一氧化氮的銅綠色假單胞菌生物膜和浮游細胞的影響。為了測試細胞的敏感性，檢測了大范圍的抗微生物化合物抗生素妥布霉素(Sigma)，其不可逆地抑制細菌蛋白的合成，使用的終濃度為100/xM;使用0.1。/。的表面活性劑十二烷基硫酸鈉(SDS);以及氧化應激誘導劑過氧化氫(11202;濃度為10mM)和次氯酸(HOCl;濃度為8mM)。在含有顯微鏡載玻片(76x26mm,Superfrost,MenzelGlaser)的培養皿中培養生物膜。為了避免污染，將載玻片高壓滅菌并將培養皿暴露于紫外線下30分鐘滅菌。將25mL的在改進的M9培養基中1/1000稀釋的PAOl-GFP過夜培養物接種到板中并在37°C下以50rpm振蕩培養24小時，使得在載玻片上形成生物膜。測定上清液的OD6o。nm讀數。然后在無菌PBS中沖洗載玻片。對于抗微生物敏感性測定，在加濕艙(humidchamber)中，單獨使用改進的M9培養基孵育載玻片(陰性對照)30分鐘，或者使用500jtiL稀釋在改進的M9培養基中的抗微生物劑孵育載玻片30分鐘，然后再次在PBS中沖洗。在加濕艙中使用250piL如上所述的LIVE/DEAD染料對載玻片上的生物膜染色20分鐘。對于每一載玻片隨機拍攝7張共聚焦照片并使用成像分析將表面覆蓋度百分比進行定量。聯合處理(SNP和抗微生物劑)后可重現性地觀察到生物膜細胞數目高達95%的顯著下降(圖4A和4B)。使用妥布霉素-常用于治療嚢性纖維化患者的抗生素，得到了最高效果。如圖5所示，還研究了SNP提高預建立的銅綠色假單胞菌生物膜敏感性的能力。除了生長的起始24小時不存在SNP以外，如上所述生長生物膜。24小時后，更換培養基并使用含有500mMSNP的培養基代替(在處理生物膜中，對照中不含SNP)。在加入100/iMTb或10mMH202處理30分鐘之前或暴露于紫外光(19W,254nm,30分鐘，距離燈30cm)之前，使生物膜再生長24小時。如上述關于圖4所述測定敏感性。如圖5所示，在聯合處理預建立的生物膜之后，觀察到生物膜表面覆蓋度和生物膜細胞數目的顯著下降。為了研究SNP和抗微生物劑聯合處理對浮游細胞的影響，將PAOl-GFP過夜培養物在含有20mM葡萄糖或不含500nMSNP的改進的M9基本培養基中1/1000稀釋。24小時后，在抗微生物溶液中將細胞1/10稀釋并在室溫下孵育2小時。進行CFU板計數以便評價細菌的活力。當與未處理的銅綠色假單胞菌對比時，對浮游細胞的SNP預處理導致在11202和妥布霉素暴露后進一步的2個對數減少(圖6)。有趣的是，與未處理的對照相比，雖然使用500nMSNP處理引起浮游培養物的光密度增加(圖3)，使用SNP預處理，暴露于妥布霉素或過氧化氫后并沒有觀察到CFU計數(活力)的等量增加。并不希望被理論束縛，發明人提出，上述結果表明一氧化氮誘導銅綠色假單胞菌生物膜中的浮游"分散"生理，并且因此提高了其對抗微生物劑的敏感性。實施例4.一氧化氮誘導絮狀生物膜中細胞的分散根據實施例2所述的表面締合生物膜的結果，研究了一氧化氮誘導從非表面締合混合物種生物膜的分散。在供給乙酸鹽的脫氮條件(缺氧)下，以間歇供給模式(l次傾析和供給循環/天)運行4個平行的生物反應器(30mL燒瓶)13天。這些試驗的目標是為了證實，外部補充由SNP產生的NO能夠影響活性污泥絮狀物(生物膜)系統中的污泥絮凝、細胞死亡和分散。使用于2004年11月18日從StMarysSewageTreatmentPlant(STP)(Sydney,NSW，Australia)收集的活性污泥4妄種生物反應器。在室溫、缺氧條件下運行生物反應器。除了加入1mLSNP/水來實現期望的濃度以外，通過在供給3mL乙酸鹽培養基和12mL亞硝酸鹽培養基的混合物后向污泥中沖洗/鼓入N2氣來維持缺氧條件。以24小時的循環來運行生物反應器，該循環由23.5小時的缺氧反應以及隨后的10分鐘沉降和傾析15mL上清液組成。生物反應器的培養基由兩種組分構成碳培養基基礎和氮培養基基礎。對于每一循環，培養基由1體積的碳培養基基礎和4體積的氮培養基基礎組成。碳培養基基礎包括(每升)6.587gCH3COONa、0.042gCaCl2'2H20、0.090gMgS04'7H20、0,160gMgCl2,6H20、0.011gKH2P04、0.026gNa2HP04.12H20、0.122gBacto蛋白胨、(DifcoLaboratories,USA)、0.020gBacto酵母提取物(DifcoLaboratories)、0.025gNH4C1和0.3ml的前述營養液(Bond&a/.,1999,Identificationofsomeofthemajorgroupsofbacteriainefficientandnonefficientbiologicalphosphorusremovalactivatedsludgesystems(在有效的和無效的生物除磷活性污泥系統中鑒別某些主要細菌群)，EwWrawMz'craWo/,65:4077-84)。使用Milli-Q水配制培養基并高壓滅菌。氮培養基基礎包括(每升)8.972gN02Na并且由反滲透去離子水配制。組合培養基中乙酸鹽:N(V-N之比維持在2.73:1。為了研究特定的活性氧和活性氮(RONS)的作用并且為了檢測在死亡和分散過程中在生物膜結構中積累的特定的RONS，將一系列活性熒光染料，每一靶向不同的RONS(以實施例1中描繪的濃度)，與由StMarysSTP得到的500mL活性污泥混合并在進行共聚焦激光掃描顯微鏡法之前在黑暗中孵育30分鐘。研究的RONS是過氧化氫(H202)、一氧化氮(NO)、過亞硝酸根(ONOO-)以及超氧化物(O一)和羥基(OH)基團。使用對照樣品(不存在熒光RONS染料)建立用于隨后熒光探針的CLSM圖像收集水平。如表1所示，使用兩種RONS特異性染料檢測到了陽性熒光細胞內過氧化氫H202-，以及DHR123以更高水平的熒光檢測到了過亞硝酸根ONOCT。表1.存在于StMarysSTP(種)污泥中的RONS的評價<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>為了研究并觀察生物膜生長過程中的污泥絮狀物和浮游細胞，使用LIVE/DEAD5acLight細菌活力試劑盒(MolecularProbes)對生物膜染色。在含有取自每一生物反應器的500mL活性污泥的微量離心管中，將染料的儲液稀釋為1pLmL-1。將樣品(20]tiL)安放在載玻片上，其中使用共聚焦激光掃描顯微鏡(Olympus)觀察細胞。在第13天觀察每一生物反應器對絮狀物和浮游細胞計數。如圖7所示，與未處理的生物膜(圖7A，表2)相比，使用SNP處理13天后，觀察到細胞從處理的絮狀生物膜基本分散(圖7B)。表2.在缺氧條件下孵育13天后，SNP對不同污泥參數的影響。(+少量浮游細胞，<5個細胞/視野；+++豐富的分散細胞，未計數的，〉500個細胞/視野)。_[SNP]浮游細胞0(對照)+1岸++100]LtM++10mM+++使用濃度為10mM的SNP觀察最高水平的分散和絮狀物瓦解。然而，由于絮狀物的大尺寸(許多情況下〉200jwn),出現在細胞內部的NO的實際濃度可能要低很多。此外，由NO供體釋放NO取決于復雜的化學反應，并且釋放的NO的有效濃度能夠比使用的SNP濃度最多低1至2個對數(SmithandDasgupta,2001,Mechanismsofnitricoxidereleasefromnitrovasodilatorsinaqueoussolution:reactionofthenitroprussideion([Fe(CN)5NO]2-)withL-ascorbicacid(由硝酸血管舒張劑的水溶液釋放一氧化氮的機理硝普鹽離子([Fe(CN)5NO]0與L-抗壞血酸的反應)，丄所ocAem.87:165-173)。實施例5.—氧化氮誘導混合物種生物膜中細胞的M5.1材料與方法5.1.1模型分布系統在本研究中使用Storey和Ashbolt(StoreyM.V.andAshboltN丄(2001)，"Persistenceoftwomodelentericviruses(B40-8andMS-2bacteriophages)inwaterdistributionpipebiofilms，，(兩種才莫式腸道病毒(B40-8和MS-2噬菌體)在配水管生物膜中存留)，『a&rSc/rec/mo/.43(12):133-8)所述的生物膜取樣點(BSS)。在兩個恒流環狀反應器(型號920，BioSurfacesTechnologies,Bozeman，Montana)中，于BSS處培育沖莫型飲用水系統和循環水系統生物膜。環狀反應器(AR)由旋轉的聚碳酸酯內部圓柱體和靜止的玻璃外部圓柱體組成，它們由填充有水的環狀腔分離。在AR的內部旋轉圓柱體的暴露面放置60個不銹鋼(SS)和未塑化的聚氯乙稀(uPVC)試樣塊(15mmx40mm的可獲得表面積)，其分別以30L.hi的速率接收飲用水和循環水，使得水力保留時間為2.2分鐘。設定環轉速以提供類似于配水管平均水力需要的線性速率(0.32L-s")。在放置于每一實驗裝置之前，在1g.L"次氯酸鈉中將生物膜試樣塊滅菌2小時并使用無菌Milli-Q水洗滌。使生物膜在試樣塊表面生長90天。此后，停止輸入流并將最終濃度約為107CFU.mL"的抗四環素和氨卡青霉素的粘質沙雷菌添加到AR。使粘質沙雷菌細胞在生物膜中SS上和uPVC試樣塊表面上穩定2周。通過再次連接飲用水和循環水輸入流l周，從系統中除去未定居的細胞。在30°C下孵育24小時后，已經從選擇性LB瓊脂平板(補充有50Mg.mL"四環素和100pg-rnl/1氨節青霉素)收集了粘質沙雷菌并在磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中洗滌了三次。5.1.2實驗設計使用無菌鑷子從每一生物膜裝置中小心地移去試樣塊。從每一實驗裝置中移去SS試樣塊(^:用水)和uPVC試樣塊(循環水)并轉移至實驗室中的生物反應器中用于NO暴露。生物反應器由具有底部入口和頂部出口的、覆蓋有鋁箔并且含有PP載玻片架(Kartell,Italy)的1L聚丙烯(PP)燒杯組成，所述PP載玻片架被改進以適合所述試樣塊。將所述架放置于PP臺底部上方2cm處，并且^f吏用》茲攪拌產生環流以it擬管壁上的水力切應力。使用1g七"次氯酸鈉對生物反應器滅菌2小時并在接收包含生物膜的試樣塊之前使用無菌Milli-Q水洗滌。對于由飲用水系統和循環水系統建立的每一類型的生物膜，在3個獨立的生物反應器中隨機放入試樣塊，其中將其暴露于高壓滅菌的(無菌且脫氯)，pH7.8,含有0、100nM或500nMNO供體硝普鈉(SNP)，流速為50mL七-1的々大用水的恒流中18小時。然后小心地將測試塊轉移至含有20mL常^見氯處理的25mL玻璃瓶中。通過在1/4強度Ringers溶液中稀釋2.4M次氯酸鹽溶液新鮮制備一定范圍的氯處理，并使用PocketColorimeterII(HACH,Loveland,CO)校準。平緩振動(75rpm)10分鐘后，通過加入終濃度為100/xM的硫代硫酸鈉終止反應。對于每一NO/氯組合處理，使用三個試樣塊進行活力計數并使用兩個試樣塊進行顯微鏡分析。5.1.3分析方法處理試樣塊以用于活力計數和顯微鏡分析。使用LIVE/DEAD5acLigh細菌活力試劑盒(MolecularProbes,Oregon,USA)染色生物膜中的細胞。在1/4強度的Ringers溶液中分別將兩種染料儲液(SYTO9和碘丙錠)稀釋至3/ilvmL"的濃度，并使用150/zL的染色混合物將試樣塊染色并使用薄蓋玻片(10.5x35mm,ProSciTech,Kirwan,Australia)覆蓋。使用落射熒光顯微鏡(Leica型號DMR)觀察試樣塊，并且使用圖像分析系統(ImageJ，NIH)計算生物膜細胞。對于活力計數，將試樣塊放置于含有有100mM硫代疏酸鈉的25mL1/4強度Ringers溶液的無菌胃袋(IOIx152mm)(Seward,UK)中。將袋熱封并進行手搓以引發附著的生物膜的分散。將試樣塊在400W(Branson2210Sonicator)下聲處理.60秒，然后在胃袋中放置60秒(SewardStomacher80，Seward,UK)以除去并使剩余生物膜均勻化。然后將勻漿從胃袋中無菌地移出。使用注皿技術在寡營養R2A瓊脂(Oxoid,England)和富營養LuriaBertani(LB)瓊脂板上進行異養平板計數(HPC)。在30°C下孵育平板并在7天后計數。根據形態鑒別粘質沙雷菌菌落并通過在補充有50Mg.mL"四環素和100/Ag.mL-1氨芐青霉素的選擇性LB瓊脂上平板接種菌落進行證實。之前通過HPC的恢復檢驗聲處理和胃袋技術對生物膜除去的功效。使用顯著性水平為95%的變量分析(ANOVA)試驗來對比低劑量NO和氯殺菌劑的不同組合對生物膜生長的影響。5.2結果5.2.1粘質沙雷菌穿刺的飲用水生物膜如圖8A至8C所示的數據表明，SNP處理以劑量依賴方式有效除去建立在模型飲用水配水系統中的混合物種生物膜以及粘質沙雷菌。從活力測定和顯微鏡分析(圖8)中得到一致的結果。SNP處理并不影響板上不同菌落形態的相對比例，這表明該處理對于混合群落中特定物種沒有選擇性。最有效的處理濃度為500nMSNP,這與之前使用銅綠色假單胞菌和其它單一物種細菌生物膜觀察到的結果相關聯。在此實驗中，使用2ppm的游離氯處理并且在暴露于常規氯中的所有試樣塊上均觀察到了生物膜的完全除去。5.2.2粘質沙雷菌穿刺的循環水生物膜一旦暴露于納摩爾濃度的NO供體SNP，就以劑量依賴方式降低了由模型循環水配水系統建立的并含有粘質沙雷菌的混合物種生物膜的總計數和粘質沙雷菌的計數。從活力測定和顯微鏡分析(圖9)中得到一致的結果。暴露于500nMSNP的生物膜還顯示對游離氯處理的增加的敏感性，例如由活力計數測定的，與對照生物膜相比，lppm游離氯除去SNP處理的生物膜的有效性高達前者的20倍(圖9)。實施例6.低水平一氣化氮謙導粘質沙雷菌、霍亂弧菌、大腸埃希軒菌和蘚樣芽胞桿菌生物膜的分散在含有玻璃(Superfrost,MenzelGlaser)或聚碳酸酯顯微鏡載玻片(76x26mm)的培養皿(90mm直徑)中培養細菌生物膜。為了防止污染，將載玻片高溫滅菌(玻璃)或在1%漂白劑溶液中滅菌30分鐘，并將培養皿暴露于紫外光30分鐘來滅菌。將細菌的過夜培養物1/1000稀釋在25ml新鮮培養基中并在30。C或37。C下，以50rpm振蕩培養24小時，使得在載玻片上形成生物膜。24小時后，使用含有不同濃度的SNP、SNAP或GSNO(除了對照不含NO產生劑以夕卜)的新鮮培養基代替所述培養基，并將細胞在合適的溫度下，使用50rpm的攪拌再孵育24小時。然后在無菌PBS中洗滌載玻片以除去未附著或松散附著的細胞。還如上所述測試了SNP增加霍亂弧菌生物膜對抗微生物劑處理的敏感性的能力，不同的是，在生物膜生長的起始24小時后，與抗微生物處理組合加入NO供體。對照包括未處理的對照和單獨的抗微生物處理，并且在合適的溫度下使用50rpm的攪拌再孵育細胞24小時。然后在無菌PBS中洗滌載玻片以除去未附著或松散附著的細胞。所有處理均進行三個重復。通過4吏用5acLightLive-DeadStainingi式劑(MolecularProbesInc，USA)對細胞進行染色并隨后進行共聚焦顯微鏡法來進行對生物膜形成的評價。將每個載玻片中高達15個隨機選擇的視野在x-y平面成像以用于隨后的圖像分析。使用分析包ImageJ(http:〃rsb.info.nih.gov/ij)進行圖像分析以確定總表面覆蓋度。結果以每視野中可獲得的總表面的覆蓋百分比來表示。圖10顯示了SNP濃度為0至500nM時，粘質沙雷菌生物膜的濃度依賴分散，在SNP濃度為25nM時生物膜覆蓋度降低了超過60%。圖ll顯示了SNAP(100nM)也對粘質沙雷菌生物膜的分散有效。圖12和13顯示了SNP和SNAP對霍亂弧菌生物膜分散影響的類似結果。圖14顯示了SNP增強了四環素(6/xg/mL)對霍亂弧菌生物膜的抗微生物活性。所使用的四環素濃度低于該生物的MIC。圖15顯示了GSNO對霍亂弧菌生物膜穩定性具有顯著的影響，并且圖16顯示了500nMSNP對大腸埃希桿菌生物膜的穩定性具有顯著的影響。圖17顯示了SNP對蘚樣芽胞桿菌生物膜穩定性的強烈影響，100nMSNP使得生物膜表面覆蓋度降低了90%。實施例7.低水平一氧化氮誘導白色念珠菌生物膜的分散在24孔聚苯乙烯微量滴定板(Sarstedt)中，在酵母蛋白胨葡萄糖培養基(YPD)中，于30。C下，以100rpm的振蕩培養細胞。簡而言之，將白色念珠菌的過夜培養物1:100稀釋在新鮮培養基中并加入1ml到孔中。使生物膜形成24小時，隨后使用新鮮的培養基代替所述培養基，并力口入;農度為0nM、25nM、100nM、500nM、1牙口5jtiM的SNP。再將細胞孵育24小時，此時使用PBS洗滌孔以除去+^散的和未附著的細胞，并使用1%結晶紫染色。使用PBS充分洗滌孔并使用Wallac-Victor2酶標儀(Perkin-Elmer)在540nm處測量吸收入生物膜中的結晶紫的量。以相對未處理對照的百分比表示結果(圖18)，并且結果顯示在SNP濃度低于1/iM時，SNP使白色念珠菌生物膜不穩定，在25nMSNP處理中白色念珠菌生物膜的減少高于60%。實施例8.低水平一氧化氮抑制表皮葡萄球菌生物膜的形成測試NO對表皮葡萄球菌的生物膜形成和生長的影響的方法和材料類似于上述用于粘質沙雷菌、霍亂弧菌、大腸埃希桿菌和蘚樣芽胞桿菌的那些，使用培養i中的載玻片培養生物膜。然而，向細胞中連續加入NO供體SNP，而不是在生物膜生長起初的24小時后。結果表明，SNP的加入能夠以濃度依賴方式阻止表皮葡萄球菌生物膜的形成(圖19)。實施例9.低水平一氧化氮誘導核粒梭形桿菌生物膜的分散為了確定NO對厭氧口腔細菌的潛在影響，選擇核粒梭形桿菌作為口腔聚生體的模式和關鍵生物。簡而言之，使用過夜培養物接種新鮮的培養基(1:100)。將細胞培養至0.1的光密度(600nm),此時向細胞中加入濃度為0nM、100nM、500nM、1/iM和10juM的SNP。還向細胞管中加入載玻片，并且使細菌附著4小時。在孵育階段的終點時，移除載玻片，通過浸入無菌PBS洗滌兩次以便除去松散結合的細胞，并使用結晶紫染色。通過數字成像俘獲和隨后的圖像分析對附著細胞進行顯微計數。以附著細胞與不暴露于SNP的對照培養物相比的百分比表示結果(圖20)，并且結果顯示NO產生劑的加入抑制核粒梭形桿菌對表面的附著。應當理解，雖然為了說明的目的本文描述了本發明的具體實施方案，但是在不偏離由所附權利要求限定的本發明精神和范圍的情況下，可以進行多種修改。權利要求1.用于促進微生物生物膜的分散或防止微生物生物膜形成的方法，所述方法包括將所述生物膜暴露于有效量的一氧化氮或有效量的至少一種產生或釋放一氧化氮的試劑；使用有效量的一氧化氮或有效量的至少一種產生或釋放一氧化氮的試劑處理易于形成生物膜的表面或介質；將有效量的一氧化氮或有效量的至少一種產生或釋放一氧化氮的試劑結合易于形成生物膜的表面或介質；或者誘導一種或多種活性氧或氮在所述生物膜的微生物中或者在能夠形成生物膜的微生物中積累。2.如權利要求l所述的方法，其中所述至少一種產生或釋放一氧化氮的試劑包括一種或多種一氧化氮供體。3.如權利要求2所述的方法，其中所述至少一種一氧化氮供體是硝普鈉、S-亞硝基-L-谷胱甘肽、S-亞硝基-N-乙酰青霉胺或其組合。4.如權利要求l所述的方法，其中存在于所述生物膜中的所述微生物或者能夠形成生物膜的所述微生物是單一物種的。5.如權利要求l所述的方法，其中存在于所述生物膜中的所述微生物或者能夠形成生物膜的所述微生物是多物種的。6.如權利要求l所述的方法，其中存在于所述生物膜中的所述微生物或者能夠形成生物膜的所述微生物包括細菌或真菌。7.如權利要求l所述的方法，其中存在于所述生物膜中的微生物或者能夠形成生物膜的微生物包括一個或多個選自下列的物種念珠菌屬(Ca"i//^>sp/.)、//ormoco"^s/t/.、假單胞菌屬CPso^/o附o"flss/p.)、交替，支單月包菌屬CPsei/doa/^romowfl^s//.)、葡萄J求菌屬(iSto//^/ococcw515//7.)、鏈J求菌屬(5Vre/7tococcM51s//.)、志賀斥干菌屬(SA/ge〃a)、分斗支桿菌屬(AfycoZ)""m',s//.)、腸球菌屬(五",erococcws埃希軒菌屬(五scAm'cAz.as//.)、沙門菌屬(Sa/mowe〃a51/7/7.)、軍團菌屬(丄eg/owe〃a■y//.)、嗜血桿菌屬(//aemo;^"M51577/7.)、芽胞桿菌屬CSac/〃i^ss;/7.)、脫硫弧菌屬(Z)esi/^/bw力n'o577/7.)、希瓦氏菌屬(幼e麗"e〃"印;.)、地桿菌屬(Geo6(3"er、克雷白桿菌屬CST/efez'e〃a5/7/.)、變形桿菌屬CfVo&ws"WO、氣單胞菌屬C4ero附o"flws/7/7.)、節軒菌屬(^4Wro6a"ers//7.)、微J求菌屬(Micrococci^印/.)、沙雷菌屬OSwra"a印;.)、吟啉單月包菌屬(Por;AjTomo"as才炎形4干菌屬CFwso6fl"en'm附s//.)以及弧菌屬8.如權利要求l所述的方法，其中存在于所述生物膜中的微生物或者能夠形成生物膜的微生物包括一個或多個選自下列的物種銅綠色假單胞菌(尸.aen/gz'"o;ya)、表皮葡萄球菌(&a//少/e/nWe/7w,cfa)、大腸埃希斥干菌(五scAen'c&aco/z')、蘚才羊芽月包^干菌(5flc〃/ws"cAew(/brm^)、津占質5少雷菌(5^/ra"aman:^scews)、沖亥4立才炎形斥干菌(FwsoZ)a"en'wmwi/c/ea^m)、霍舌L^瓜菌(W6n'oCAo/erae)以及白色念珠菌9.如權利要求l所述的方法，其還包括使用至少一種抗微生物劑處理所述表面或介質、將至少一種抗微生物劑結合所述表面或介質、或者將所述生物膜中的微生物或能夠形成生物膜的微生物暴露于至少一種抗微生物劑。10.如權利要求9所述的方法，其中所述抗微生物劑選自抗生素、表面活性劑、氧化應激誘導劑或其組合。11.如權利要求1所述的方法，其中所述一種或多種活性氧或氮選自過亞硝酸根、一氧化氮、過氧化氫和超氧化物自由基，或其組合。12.如權利要求1所述的方法，其中所述方法包括在所述生物膜中的微生物中誘導導致分散的分化事件，或者其中所述方法包括防止微生物中導致生物膜形成的分化事件的誘導。13.如權利要求1所述的方法，其包括提高微生物對一種或多種抗微生物劑的敏感性。14.如權利要求1所述的方法，其中所述有效量包括一氧化氮或至少一種產生或釋》史一氧化氮的試劑的約inM至約10mM的濃度。15.如權利要求1所述的方法，其中所述有效量包括一氧化氮或至少一種產生或釋放一氧化氮的試劑的約10nM至約5/xM的濃度。16.用于促進微生物生物膜的分散或防止微生物生物膜形成的組合物，所述組合物包含一氧化氮、至少一種產生或釋放一氧化氮的試劑、或者一氧化氮和至少一種產生或釋放一氧化氮的試劑，以及合適的載體。17.如權利要求16所述的組合物，其中所述至少一種產生或釋放一氧化氮的試劑包括一種或多種一氧化氮供體。18.如權利要求17所述的組合物，其中所述至少一種一氧化氮供體選自硝普鈉、S-亞硝基-L-谷胱甘肽、S-亞硝基-N-乙酰青霉胺或其組合。19.如權利要求16所述的組合物，其還包含至少一種抗微生物劑。20.如權利要求19所述的組合物，其中所述至少一種抗微生物劑是抗生素、表面活性劑、氧化應激誘導劑或其組合。21.如權利要求16所述的組合物，其為防污組合物、醫療裝置或其組件、用于醫療裝置的涂層或藥物組合物。22.如權利要求16所述的組合物，其中所述組合物誘導所述生物膜中的微生物中導致分散的分化事件，或者所述組合物防止微生物中導致生物膜形成的分化事件的誘導。23.用于維持或增強生物膜功能的方法，所述方法包括將所述生物膜暴露于至少一種一氧化氮清除劑、至少一種抗氧化劑、或至少一種一氧化氮清除劑和至少一種抗氧化劑。24.如權利要求23所述的方法，其中所述一氧化氮清除劑為2-苯基-4，4，5,5-四曱基-咪唑啉-l-氧基-3-氧化物。25.如權利要求23所述的方法，其中所述抗氧化劑選自硫氧還蛋白、過氧化物歧化酶、谷胱甘肽和抗壞血酸。26.如權利要求23所述的方法，其包括在所述生物膜中的微生物中抑制導致分散的分化事件。27.維持或提高、或維持并提高生物膜功能的組合物，所述組合物包含至少一種一氧化氮清除劑和/或至少一種抗氧化劑，以及合適的載體。28.如權利要求27所述的組合物，其在所述生物膜中的微生物中抑制導致分散的分化事件。29.如權利要求27所述的組合物，其中所述一氧化氮清除劑為2-苯基-4，4，5,5-四曱基-咪唑啉-l-氧基-3-氧化物。30.如權利要求27所述的組合物，其中所述抗氧化劑選自硫氧還蛋白、過氧化物歧化酶、谷胱甘肽和抗壞血酸。31.如權利要求1所述的方法，其包括向對象給予有效量的一氧化氮或有效量的至少一種產生或釋放一氧化氮的試劑，用于處理或防止所述對象中與生物膜相關的狀態。32.如權利要求31所述的方法，其還包括對所述對象給予至少一種抗微生物劑。33.如權利要求1所述的方法，其中所述易于形成生物膜的表面包括醫療裝置的表面。34.如權利要求33所述的方法，其中所述醫療裝置是導管、支架、假體或其它外科或可植入的裝置。35.如權利要求16所述的用于處理或防止對象的與生物膜相關的狀態的組合物。36.如權利要求35所述的組合物，其還包含至少一種抗微生物劑。全文摘要本發明涉及用于促進微生物生物膜的分散或防止微生物生物膜形成的方法，其包括將生物膜暴露于有效量的一氧化氮或有效量的至少一種產生或釋放一氧化氮的試劑；使用有效量的一氧化氮或有效量的至少一種產生或釋放一氧化氮的試劑處理易于形成生物膜的表面或介質；將有效量的一氧化氮或有效量的至少一種產生或釋放一氧化氮的試劑結合易于形成生物膜的表面或介質；或者誘導一種或多種活性氧或氮在所述生物膜的微生物中或者在能夠形成生物膜的微生物中積累。本發明還涉及用于維持、或增強、或維持并增強生物膜功能的方法，其包括將生物膜暴露于至少一種一氧化氮清除劑、至少一種抗氧化劑、或至少一種一氧化氮清除劑和至少一種抗氧化劑。本發明還涉及用于促進微生物生物膜的分散或防止微生物生物膜形成，維持或提高、或維持并提高生物膜功能的組合物。文檔編號C12N1/00GK101213292SQ200680023920公開日2008年7月2日申請日期2006年5月24日優先權日2005年5月24日發明者尼古拉斯·巴羅,斯塔帆·謝勒貝格,斯科特·A·賴斯,杰雷米·S·韋布申請人:環境生物科技Crc有限公司