葡糖淀粉酶變體的制作方法

專利名稱：：葡糖淀粉酶變體的制作方法
技術領域：
：本發明涉及具有改進性質的葡糖淀粉酶變體和使用所述葡糖淀粉酶變體的方法。背景葡糖淀粉酶(1，4-a-D-葡聚糖葡糖水解酶(1,4-alpha-D-glucanglucohydrolase):EC3.2.1.3)是催化D-葡萄糖從淀粉或相關的寡糖和多糖分子的非還原端釋放的酶。葡糖淀粉酶由幾種絲狀真菌和酵母產生。商業上，使用葡糖淀粉酶將已經用a-淀粉酶部分水解的玉米淀粉轉化為葡萄糖。在高果糖玉米糖漿(HFCS)生產中，通過葡萄糖異構酶進一步將葡萄糖轉化為由幾乎相等的葡萄糖和果糖組成的混合物。這種混合物是普遍使用的高杲糖玉米糖漿，其商業化遍布全球。對于高果糖玉米糖漿使用最多的是和黑曲霉(^^erg說^m'gw)的葡糖淀粉酶。在商業上用于高果糖玉米糖漿生產的高固體濃度下，葡糖淀粉酶由通過縮合產生的葡萄糖合成二糖、三糖和四糖。這種情況的發生是由于淀粉中a-G—6)-D-糖苷鍵的緩慢水解和由D-葡萄糖形成多種積累的縮合產物，主要是異麥芽糖。因此，轉化方法中的葡萄糖產率不超過理論產率的95%。全世界通過這種方法產生的HFCS量非常大，而在每噸淀粉的葡萄糖產率上即使非常小的增加在商業上也是重要的。本發明的目的是減少特定葡糖淀粉酶的縮合產物的形成，所述葡糖淀粉酶可以從真菌生物，特另ll是踝節菌屬(T^/a7"7"c&ygenus)和曲霉屬(v4，rg/腸genus)的菌抹獲得，并且已經基于它們的合適性質，例如淀粉轉化中的性質，對所述葡糖淀粉酶本身進行了選擇。發明簡述申請人們目前發現通過在親本葡糖淀粉酶的氨基酸序列的特殊區域中的特殊位置引入一些變化，來降低形成a-(l-6)鍵的速率，和/或減少異麥芽糖的形成。葡糖淀粉酶切割并因而形成a-(l-6)鍵的速率相對于其切割a-(l-4)鍵的速率的降低具有實際意義。葡糖淀粉酶能夠在副產品量顯著減少的情況下產生葡萄糖，這將有重要的商業意義，例如，從淀粉生產甜味劑時。本發明的發明人提供了親本葡糖淀粉酶的許多變體，所述變體顯示減少的縮合。通過在糖化方法中使用本發明的葡糖淀粉酶變體，能夠產生具有非常高葡萄糖百分比的糖漿。通過突變，例如通過在親本葡糖淀粉酶中取代和/或缺失和/或插入選4奪的位置來獲得減少的縮合。這將在下文中詳細描述。因此，在第一個方面，本發明涉及親本葡糖淀粉酶的變體，當與親本葡糖淀粉酶比較時，所述變體葡糖淀粉酶的縮合產物產量減少。因此，在第二個方面，本發明涉及親本葡糖淀粉酶的變體，其在以下區域之一中包含變化區域248-255，例如在位置248、249、250、251、252、253、254和/或255的一個或多個中，區域309-318,例如在位置309、310、311、312、313、314、315、316、317和/或318的一個或多個中，和/或區域409-415,例如在位置409、410、411、412、413、414和/或415的一個或多個中，其中(a)所述變化獨立地是(i)在占據該位置的氨基酸的下游插入氨基酸，(ii)缺失占據該位置的氨基酸，或(iii)用不同的氨基酸取代占據該位置的氨基酸，(b)所述變體具有葡糖淀粉酶活性，并且(c)各位置相應于親本葡糖淀粉酶的氨基g復序列的區域或位置，所述親本葡糖淀粉酶具有SEQIDNO:2的氨基酸序列，和/或相應于同源葡糖淀粉酶中的區域或位置，所述同源葡糖淀粉酶與SEQIDNO:2中所示氨基Sll序列顯示至少50%同源性。在第三個方面，本發明涉及DNA構建體，其包含編碼根據第一個方面的葡糖淀粉酶變體的DNA序列。在第四個方面，本發明涉及重組表達載體，其攜帶根據第二個方面的DNA構建體。在第五個方面，本發明涉及細胞，將所述細胞用根據第二個方面的DNA構建體或根據第三個方面的載體轉化。在第六個方面，本發明涉及根據第四個方面的細胞，所述細胞是微生物，尤其是細菌或真菌。在第七個方面，本發明涉及用于將淀粉或部分水解的淀粉轉化為含有葡萄糖(dextrose)的糖漿的方法，所述方法包括在根據第一個方面的葡糖淀粉酶變體存在下糖化淀粉水解物。在另外的方面，本發明涉及第一或第二方面中任一的葡糖淀粉酶在淀粉轉化方法中，優選在連續淀粉轉化方法中的用途；在用于產生寡糖、麥芽糊^f青或葡萄糖糖漿的方法中的用途；在用于產生高果糖玉米糖漿的方法中的用途；在用于產生酒精飲料(alcoholicbeverage)、燃料或飲用乙醇的方法中的用途；和/或在用于產生有機化合物的發酵方法中的用途。發明詳述使用的定義命名法在本說明書和權利要求書中，對于氨基酸殘基使用常規的一字母和三字母密碼子。為了易于參考，通過以下命名法的使用來描述本發明的葡糖淀粉酶變體原始氨基酸:位置:取代氨基酸。根據這種命名法，例如在位置30用天冬酰胺取代丙氨酸表示為A30N,在相同位置中缺失丙氨酸表示為A30*,而插入額外的氨基酸殘基例如賴氨酸顯示為A30AK。缺失相鄰的氨基酸殘基段，例如氨基酸殘基30-33,表示為A(A30-N33)。當特定葡糖淀粉酶與其它葡糖淀粉酶相比含有"缺失"并且在此位置進行插入時，將在位置36中插入天冬氨酸的情況表示為*36D。通過加號分隔多個突變A30N+E34S分別代表在位置30和34用天冬酰胺和絲氨酸取代丙氨酸和谷氨酸的突變。也可如下分隔多個突變，意思與加號相同，即A30N/E34S當在給定位置可以插入一種或多種可選氨基酸殘基時，表示為A30N或A30E。此外，當本文鑒定了適合于修飾的位置未建議任何具體的修飾時，應理解為任何氨基酸殘基可取代該位置存在的氨基酸殘基。因此，例如，當提到在位置30的丙氨酸的修飾但是未指定時，應理解為可將所述丙氨酸缺失或由任何其它氨基酸取代，即R、N、D、A、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、V中的任一。才艮才居V/.R.TaylorinTheClassificationofAminoAcidConservation,J.Theor.Biol,119(1986)205-218中的定義，將術語"極性"(C、T、S、D、N、Y、W、H、K、E、R、Q)、"非才及性，，(A、C、V、I、L、M、K、F、Y、W、H)、"月旨肪族"(V、I、L)、"芳族，，(F、Y、W、H)、"小，，(A、C、D、G、N、P、T、S)、"微小(tiny)"(A、C、G、T、S)、"帶電荷"(K、R、D、E)用于氨基酸殘基。此外，將術語"六元環芳族"用于含有非融合六元芳香環體系的氨基酸殘基(即F、Y)。還將術語"陰性，，用于在中性pH具有帶負電的側鏈的氨基酸殘基(即D、E)。在本發明的上下文中，可將同源性作為兩個序列之間同一性的程度測定，表示第一序列從第二序列衍生。可以通過本領域已知的計算機程序的方法來合適地測定同源性，所述程序例如GCG程序包中提供的GAP(上文所述)。因此，可以按照用于同一性的默認計分矩陣和以下默認參數來使用GapGCGv8:對于核酸序列比較分別是GAP產生罰分(GAPcreationpenalty)為5.0和GAP延伸罰分(GAPextensionpenalty)為0.3;而對于蛋白質序列比較分別是GAP創造罰分為3.0和GAP延伸罰分為0.1。GAP使用NeedlemanandWunsch,(1970),J.Mol.Biol.48,p.443-453的方法來進行比對并且計算同一性。可以將SEQIDNO:1/SEQIDNO:2和另一種葡糖淀粉酶之間的結構比對用于鑒定等同/相應的位置。獲得所述結構比對的一種方法是^f吏用來自GCG程序包的PileUp程序，使用缺口罰分(gappenalty)的默認值，即，缺口產生罰分為3.0和缺口延伸罰分為0.1。其它結構比對方法包括疏水蔟分析(Gaboriaudetal.，(1987),FEBSLETTERS224,pp.149-155)和反向穿線(reversethreading)(Huber，T;Torda,AE，PROTEINSCIENCEVol.7，No.1pp.142-149(1998)。在本發明的上下文中，"源自"不僅表示由所述生物的菌抹產生或可由所述生物的菌抹產生的葡糖淀粉酶，并且還表示由分離自這種菌抹的DNA序列編碼的葡糖淀粉酶和用所述DNA序列轉化的宿主生物中產生的葡糖淀粉酶。最終，該術語旨在表示由合成和/或cDNA來源的DNA序列編碼的葡糖淀粉酶，并且其具有所述葡糖淀粉酶的鑒別特征。該術語還旨在表示親本葡糖淀粉酶可以是天然存在的葡糖淀粉酶的變體，即作為修飾(插入、取代、缺失)天然存在的葡糖淀粉酶的一個或多個氨基酸殘基的結果而得到的變體。本發明的葡糖淀粉酶變體本發明提供親本葡糖淀粉酶的變體，其包含在以下區域之一中的變化區域248-255,例如在位置248、249、250、251、252、253、254和/或255中,區域309-318,例如在位置309、310、311、312、313、314、315、316、317和/或318中，和/或區域409-415,例如在位置409、410、411、412、413、414和/或415，其中(a)所述變化獨立地是(i)在占據該位置的氨基酸的下游插入氨基酸，(ii)缺失占據該位置的氨基酸，或(iii)用不同的氨基酸取代占據該位置的氨基酸，(b)所述變體具有葡糖淀粉酶活性，并且(c)各區域和/或位置相應于親本葡糖淀粉酶的氨基酸序列的位置，所述親本葡糖淀粉酶具有SEQIDNO:2的氨基酉拼列，和/或相應于同源葡糖淀粉酶中的區域和/或位置，所述同源葡糖淀粉酶與SEQIDNO:2中所示氨基酉1^列顯示至少50%同源性。優選在以下位置中的一個或多個包含變化的變體252、312、314、315、412,其中每個位置相應于親本葡糖淀粉酶的氨基酸序列中的位置，所述親本葡糖淀粉酶具有SEQIDNO:2的氨基S吏序列。優選在相應于SEQIDNO:2中L252的位置是被任何非極性殘基取代(A、C、F、G、H、I、K、M、V、W、Y);更優選是被非極性殘基，同時也是小殘基取代(V、C、A、G);甚至更優選是被非極性殘基，同時也是微小殘基取代(A、G),并且最優選是被殘基A取代。優選在相應于SEQIDN〇2中V312的位置是一皮任何極性殘基取代(C、D、E、H、K、N、Q、R、S、T、W、Y);更優選是,皮極性殘基，同時也是小殘基取代(C、T、S、D、N);甚至更優選是被極性殘基，同時也是微小殘基取代(C、T、S)，并且最優選是被殘基S取代。優選在相應于SEQIDNO:2中Q314的位置是凈皮任何極性、脂肪族或芳族殘基取代(C、D、E、F、H、I、K、L、N、R、S、T、V、W、Y);更優選是被帶電荷、脂肪族或芳族殘基取代(D、E、F、H、I、K、L、R、V、W、Y);更優選是被脂肪族或芳族殘基取代(F、H、I、L、V、W、Y);更優選是被芳族殘基取代(F、H、W、Y);甚至更優選是被芳族殘基，同時也是六元環芳族殘基取代(F、Y),并且最優選是被殘基Y取代。優選在相應的位置中，在SEQIDNO:2的Q314之后的插入是以任何脂肪族或芳族殘基插入(V、I、L、F、Y、W、H);更優選是以脂肪族殘基插入(V、I、L);并且最優選插入殘基I。優選在相應于SEQIDNO:2中G315的位置是被任何非極性殘基(A、C、F、H、I、K、L、M、V、W、Y)取代、被極性殘基取代或被不是小殘基的殘基取代(C、D、E、F、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、W、Y);還優選是一皮小殘基或帶電荷殘基取^/.(D、E、F、H、I、K、L、M、Q、R、W、Y);更優選是被不是小殘基的殘基取代(E、F、H、I、K、L、M、Q、R、W、Y)或被既不是小殘基也不是正電殘基的殘基取代(E、F、H、I、L、M、Q、W、Y)或被既不是小殘基也不是負電殘基的殘基取代(1、L、M、F、Y、W、H、K、R),或被芳族或脂肪族殘基取代，所述殘基也不是小殘基(F、Y、W、H、I、L),或被芳族或脂肪族殘基取代，所述殘基既不是小殘基也不是帶電荷殘基(F、Y、W、I、L);或更優選是被芳族殘基并且不是帶電荷殘基(F、Y、W)取代；甚至更優選是芳族殘基并且還是六元環芳族殘基(F、Y);并且最優選是被殘基Y取代。優選在相應于SEQIDNO:2中L412的位置是被任何極性殘基(C，D,E,H,K,N，Q,R,S,T,W,Y)取代；更優選是^皮帶電荷殘基(H，K,R,E,D)取代；還更優選是被負電殘基(D,E)取代；并且最優選是被殘基D取代。更優選的是包含以下變化中的一種或多種的變體在位置252取代為A、F、G或V;在位置312取代為S，在位置314取代為E、F、N、R、T、W或Y;在位置315取代為A、D、F、H、K、L、N、Q、R、S、T或Y，在位置412取代為D，或在位置314和315之間插入氨基酸殘基I,其中每個位置對應于具有SEQIDNO:2的氨基S吏序列的親本葡糖淀粉酶氨基S1^列中的位置。甚至更優選的是包含以下取代組合中的一個或多個的變體314F+315N、314W+315N、314Y+315N、314L+315A、314N+315R、314R+315D、315R+463T、315R+556E、315L+529N,其中每個位置相應于具有SEQIDNO:2的氨基酸序列的親本葡糖淀粉酶的氨基酸序列中的位置，并且尤其是包含一個或多個以下取代的變體:V312S、Q314E、Q314F、Q314N、Q314R、Q314T、Q314W、Q314Y、G315A、G315D、G315F、G315H、G315K、G315L、G315N、G315Q、G315R、G315S、G315T、G315Y、L252A、L252F、L252G、L252V、L412D或在位置314和315之間插入氨基酸殘基I(Q314QI)，其中每個位置對應于具有SEQIDNO:2的氨基酸序列的親本葡糖淀粉酶氨基S菱序列中的位置。更優選的是包含以下取代組合中的一個或多個的變體Q314F和G315N、Q314W和G315N、Q314Y和G3I5N、Q314L和G315A、Q314N和G315R、Q314R和G315D、G315R和A463T、G315R和K556E、G315L和D529N,其中每個位置對應于具有SEQIDNO:2的氨基S史序列的親本葡糖淀粉酶氨基酸序列中的位置。本發明的變體可以具有SEQIDNO:2的成熟葡糖淀粉酶的葡糖淀粉酶活性的至少20°/。，優選至少40°/。，更優選至少60°/。，甚至更優選至少80%，甚至更優選至少90%,并且最優選至少100%。相對于SEQIDNO:2的親本葡糖淀粉酶的葡糖淀粉酶，本發明的變體可以具有降^(氐至少5%,優選至少10%，更優選至少15%,甚至更優選至少20%,更優選至少25%,并且最優選至少30%的縮合。親本葡糖淀粉酶根據本發明預期的親本葡糖淀粉酶包括野生型葡糖淀粉酶、真菌葡糖淀粉酶，尤其是可以從踝節菌屬獲得的真菌葡糖淀粉酶，尤其是可以從W〇99/28448中(參見WO99/28448的SEQIDNO:7)和本丈SEQIDNO:2中公開的7:eweraow7獲得的真菌葡糖淀粉酶。在另外的實施方式中，葡糖淀粉酶主鏈源自曲霉屬菌抹，例如黑曲霉04sj^rgz7/im'ger)或泡盛曲霉C4sperg"/wsawamon')葡糖淀粉酶和它們的變體或突變體，同源葡糖淀粉酶，和與它們在結構和/或功能上相似的其它葡糖淀粉酶。優選地，親本葡糖淀粉酶包含選自下列的一個或多個特異性氨基酸殘基；位置252的氨基酸殘基L，位置314的氨基酸殘基Q,位置315的氨基酸殘基G和位置412的氨基酸殘基L。優選地，親本葡糖淀粉酶包含SEQIDNO:2的氨基酸序列；或其等位變體；或其具有葡糖淀粉酶活性的片段。SEQIDNO:2的片段是從此氨基酸序列的氨基和/或羧基末端缺失一個或多個氨基酸的多肽。等位變體表示占據相同染色體基因座的基因的任何兩種或更多種可選形式。等位變異通過突變天然地發生，并且可導致種群內的多態性。基因突變可以是沉默的(在編碼的多肽中無變化)或可以編碼具有改變的氨基酸序列的多肽。多肽的等位變體是由基因的等位變體編碼的多肽。合適的親本葡糖淀粉酶可以是具有以下氨基酸序列的葡糖淀粉酶，所述氨基酸序列與SEQIDNO:2的氨基酸序列具有至少50%，優選至少60%,更優選至少大約70%,還更優選至少80%,甚至更優選至少90%,最優選至少95%，并且最優選至少98%的同一性程度(即同源親本葡糖淀粉酶)。同源親本葡糖淀粉酶的氨基酸序列可以因插入或缺失一個或多個氨基酸殘基和/或用不同的氨基酸殘基取代一個或多個氨基酸殘基而不同于SEQIDNO:2的氨基酸序列。優選地，氨基酸改變對性質是不重要的(ofaminornature),即不顯著影響蛋白質的折疊和/或活性的保守氨基酸取代；小缺失，通常為1至大約30個氨基酸；小的氨基或羧基末端延伸，例如氨基末端甲硫氨酸殘基；多至大約20-25個殘基的小接頭肽；或通過改變凈電荷或其它功能來促進純化的小延伸，例如多組氨酸區(tract)、抗原表位或結合域。在一個實施方案中，分離的親本葡糖淀粉酶由核酸序列編碼，所述核酸序列在非常低嚴緊條件，優選低嚴緊條件，更優選中嚴緊條件，更優選中-高嚴緊條件，還更優選高嚴緊條件，并最優選非常高嚴緊條件下與核酸探針雜交，所述核酸探針在相同條件下與下述雜交(i)SEQIDNO:1的核酸序列，(ii)SEQIDNO:1的cDNA序列,(iii)(i)或(ii)的亞序列，或(iv)(i)、(ii)或(iii)的互補《連。在另一個實施方案中，分離的親本葡糖淀粉酶由核酸序列編碼，所述核酸序列在非常低嚴緊條件，優選低嚴緊條件，更優選中嚴緊條件，更優選中-高嚴緊條件，還更優選高嚴緊條件，并最優選非常高嚴緊條件下與下述雜交(i)SEQIDNO:1的核酸序列，(ii)SEQIDNO:1的cDNA序列，(iii)(i)或(ii)的亞序列，或(iv)(i)、(ii)或(iii)的互補鏈。用于測試雜交的合適條件包括在5xSSC中預浸和在20%曱酰胺、5x登哈特溶液(Denhardt，ssolution)、50mM磷酸鈉，pH6.8和50mg變性的經聲處理的小牛胸腺DNA的溶液中在4(TC預雜交1小時，然后是在補充有的相同溶液中在4(TC雜交18小時，然后是將濾器在2xSSC,0.2%SDS中在40。C(低嚴緊性)，優選在50。C(中嚴緊性)，更優選在65。C(高嚴緊性)，還更優選在75。C(非常高嚴緊性)三次洗滌30分鐘。(J.Sambrook,E.RFritsch,andT,Maniatus,淺9,M)/ecw/arC7om.喂爿丄a6orafory她麗aZ,2ndedition,ColdSpringHarbor,NewYork)。SEQIDNO:1的亞序列可為至少100個核苷酸或優選至少200個核苦酸。而且，所述亞序列可編碼多肽片段，其具有葡糖淀粉酶活性。親本多肽還可以是具有葡糖淀粉酶活性的所述多肽等位變體或片段。SEQIDNO:1的核酸序列或其亞序列，以及SEQIDNO:2的氨基酸序列或其片段可以用于設計核酸探針以根據本領域內公知的方法從不同屬和種的菌抹中鑒定和克隆編碼具有葡糖淀粉酶活性的多肽的DNA。具體而言，根據標準的Southern印跡方法，可將這些探針用于與感興趣的屬或種的基因組或cDNA雜交，以在其中鑒定和分離相應的基因。這些探針可明顯短于完整序13列，但長度上應為至少15,優選至少25,更優選至少35個核苷酸。也可以使用更長的探針。DNA和RNA探針二者均可使用。通常將探針標記以探測相應的基因(例如，用32P、3H、35S、生物素或抗生物素蛋白(avidin)標記)。因此，可篩選由這些其它生物制備的基因組DNA或cDNA文庫中的DNA，所述DNA與上述探針雜交并且編碼具有葡糖淀粉酶的多肽。可以通過瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳，或其它分離技術來分離來自這些其它生物的基因組或其它DNA。可以將來自文庫的DNA或分離的DNA轉移至硝化纖維素(nitrocellulose)或其它合適的載體材料并且固定于其上。為了鑒定與SEQIDNO:1或其亞序列同源的克隆或DNA，將載體材料用于Southern印跡。就本發明而言，雜交表示核酸序列在非常低到非常高嚴緊條件下與核酸探針雜交，所述核酸探針相應于SEQIDNO:1所示的核酸序列，它的互補鏈或其亞序列。使用X-光片檢測在這些條件下與核酸探針雜交的分子。對于長度至少100個核苷酸的長探針，使用2xSSC、0.2%SDS,優選在45°C(非常低嚴緊性)，更優選至少在50°C(低嚴緊性)，更優選至少在55°C(中嚴緊性)，更優選至少在60。C(中-高嚴緊性)，甚至更優選至少在6S。C(高嚴緊性)，并且最優選至少在70。C(非常高嚴緊性)，將載體材料最終洗滌三次，每次15分鐘。期望的親本葡糖淀粉酶具有至少20%,優選至少40%,更優選至少60%,甚至更優選至少80%,甚至更優選至少90%，并且最優選至少100%的SEQIDNO:2的成熟葡糖淀粉酶的葡糖淀粉酶活性。克隆編碼親本葡糖淀粉酶的DNA序列可以使用多種本領域熟知的方法，從產生所述葡糖淀粉酶的任何細胞或微生物分離編碼親本葡糖淀粉酶的DNA序列。首先，應該使用染色體DNA或信使RNA構建基因組DNA和/或cDNA文庫，所述染色體DNA或信使RNA來自產生待研究的葡糖淀粉酶的生物。然后，如果葡糖淀粉酶的氨基酸序列是已知的，可以合成標記的寡核苷酸探針并且用于從由所述生物制備的基因組文庫中鑒定編碼葡糖淀粉酶的克隆。或者，可以使用非常低至非常高嚴緊性的雜交和洗滌條件，使用含有與其它已知葡糖淀粉酶基因同源的序列的標記寡核苷酸探針作為探針來鑒定編碼葡糖淀粉酶的克隆。這在上文描述。用于鑒定編碼葡糖淀粉酶的克隆的另一種方法可涉及將基因組DNA的片段插入表達載體，例如質粒；用所得基因組DNA文庫轉化葡糖淀粉酶陰性細菌；其后將轉化的細菌涂布在含有用于葡糖淀粉酶的底物(即，麥芽糖)的瓊脂上，從而使表達該葡糖淀粉酶的克隆得以鑒定。或者，可以通過已經建立的標準方法，例如S丄.Beaucage和M.H.Caruthers,(1981),TetrahedronLetters22,p.1859-1869描述的亞磷酰胺(phosphoroamidite)方法，或由Matthesetal,,(1984),EMBOJ.3,p.801-805描述的方法來合成制備編碼所述酶的DNA序列。在亞磷酰胺方法中，合成寡核苷酸，例如在自動DNA合成儀中合成；純化；退火；連4秦并且克隆到適當的載體中。最后，該DNA序列可以是基因組和合成混合來源，合成和cDNA混合來源，或基因組和cDNA混合來源，根據標準技術通過連接合成來源、基因組來源或cDNA來源的片段來制備(這些片段對應于整個DNA序列的不同部分，視情況而定)。也可以使用特異性引物通過聚合酶鏈式反應(PCR)來制備該DNA序列，例如US4,683,202或R.K.Saikietal.,(1988),Science239,1988，pp.487-491中所述。定點誘變一旦將編碼葡糖淀粉酶的DNA序列分離，并且鑒定了用于突變的期望位點，則可以使用合成寡核苷酸引入突變。這些寡核香酸含有側翼為期望突變位點的核苷酸序列。在特定方法中，在含有所述葡糖淀粉酶基因的載體中產生DNA的單鏈缺口，所述DNA是編碼葡糖淀粉酶的序列。然后將含有期望突變的合成核苷酸與單鏈DNA的同源部分退火。然后用DNA聚合酶I(幻enow片段)填補剩余的缺口，并且使用T4連接酶連接構建體。這種方法的特定實例在Morinagaetal"(1984)，Biotechnology2,p.646-639中描述。US4,760,025乂i^開了通過進行盒的較小改變(minoralterationofthecassette)來引入編碼多個突變的寡核苷酸。然而，因為能夠引入多種長度的大量寡核苷酸，可以通過Morinaga方法在任一時間引入甚至更多種突變。用于將突變引入編碼葡糖淀粉酶的DNA序列的另一種方法在NelsonandLong,(1989)，AnalyticalBiochemistry180，p.147-151中描述。其涉及三步產生包含期望突變的PCR片段，所述突變通過使用化學合成的DNA鏈作為PCR反應中的引物之一來引入。從PCR產生的片段中，可以通過用限制性內切酶切割來分離攜帶所述突變的DNA片段，并且再插入至表達質粒。jt匕夕卜,Sierks.etal.，(1989)"Site-directedmutagenesisattheactivesiteTip120ofJ^pergz7/wmvi37wn'glucoamylase.ProteinEng.，2,621-625;Sierksetal.,(1990),"Determinationofy^戸'g77/wsa而,Wglucoamylasecatalyticmechanismbysite-directedmutagenesisatactivesiteAspl76,Glul79,andGlul80".ProteinEng.vol.3,193-198;也描述曲霉屬葡糖淀粉酶中的定點誘變。表達葡糖淀粉酶變體根據本發明，可以使用表達載體以酶的形式來表達通過上述方法或通過本領域已知的任何可選方法產生的編碼葡糖淀粉酶變體的DNA序列，所述表達載體通常包含調控序列，其編碼啟動子、操縱基因、核糖體結合位點、翻譯初始信號和任選地阻抑基因或多種激活基因。表達載體攜帶編碼本發明的葡糖淀粉酶變體的DNA序列的重組表達載體可以是任何載體，其可以方便地進行重組DNA方法，并且載體的選擇將通常依賴于待引入該載體的宿主細胞。載體可以是一種當被引入宿主細胞中時，整合到宿主細胞基因組中并且與整合了該載體的染色體一起復制的載體。合適的表達載體的實例包括PMT838。啟動子在載體中，應該將DNA序列與合適的啟動子序列可操作地連接。啟動子可以是任何DNA序列，其在選擇的宿主細胞中顯示轉錄活性，并且可以源自編碼與宿主細胞同源或異源的蛋白質的基因。用于指導編碼本發明的葡糖淀粉酶變體的DNA序列的轉錄，特別是在細菌宿主中的轉錄的合適啟動子的實例是大腸桿菌的/ac操縱子的啟動子、天藍色《連霉菌(&repto,nycacoWco/or)瓊脂酶基因abg^啟動子、地衣芽孢桿菌Wflc/〃M//c/7em/onm》a-淀粉酶基因(amy丄)的啟動子、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Ba"7/mWearaAerwo;/7itf)產麥芽糖淀粉酶基因(am，y竭的啟動子、解淀粉芽孑包4干菌(B"c/〃ma"^/o//gwe^zcz'ew)a-淀4分酵(amj^)的啟動子、診古草芽孑包4于菌Wac/〃w5m^7/力xylA和xylB基因的啟動子等。對于在真菌宿主中的轉錄，有用啟動子的實例是源自下列的那些啟動子編碼米曲霉(Aorj^fle)TAKA淀粉酶的基因、來自釀酒酵母(S.cewvWae)的TPI(丙糖磷酸異構酶)啟動子(Alberetal.(1982),J.Mol.Appl.Genet1,p.419-434)、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉(Am'ge,力中性a-淀粉酶、黑曲霉酸穩定a-淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、曼赫根毛霉脂肪酶、米曲霉i威性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸異構酶或構巢曲霉(Am'血/ara)乙酰胺酶。表達載體可以包含聚腺苷酸化序列，它們與編碼本發明的葡糖淀粉酶變體的DNA序列可操作地連接。終止序列和聚腺苦酸化序列可以適當地源自與啟動子相同的來源。載體可以進一步包含使該載體能夠在所討論的宿主細胞中復制的DNA序列。這些序列的實例是以下質粒的復制起點pUC19、pACYC177、pUB110、pE194、pAMBl和pIJ702。載體還可以包含選擇標記，例如其產物補足宿主細胞中缺陷的基因，例如來自枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌的血/基因，或賦予抗生素抗性的基因，所述抗生素抗性例如氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素或四環素抗性。此外，該載體可以包含曲霉屬選擇性標記例如amdS、argB、niaD和sC,產生潮霉素抗性的標記，或所述選4奪可以通過共轉化完成，例如WO91/17243中所述。分別用于連接編碼葡糖淀粉酶變體的本發明的DNA構建體、啟動子、終止子和其它元件，并將它們插入含有復制必需的信息的合適載體中的方法，對本領域的^支術人員而言是熟知的(參見，例如，Sambrooketal.，MolecularCloning:ALaboratoryManual,2ndEd.，ColdSpringHarbor,1989)。宿主細胞在本發明的葡糖淀粉酶變體的重組生產中，將包含如上限定的本發明的DNA構建體或表達載體的本發明的細胞有利地用作宿主細胞。方便地通過將DNA構建體(以一個或多個拷貝)整合至宿主染色體，可以將細胞用編碼變體的本發明的DNA構建體轉化。通常認為這種整合是有利的，因為該DNA序列更有可能穩定地保持在所述細胞中。將所述DNA構建體整合入宿主染色體可以根據常失見方法，例如通過同源或異源重組進行。或者，可以用如上所述與不同類型的宿主細胞相關的表達載體轉化所述細胞。本發明的細胞可以是高等生物的細胞，例如哺乳動物、昆蟲或植物的細胞，但優選是微生物細胞，例如細菌或真菌(包括酵母)細月包。合適細菌的實例是革蘭氏陽性細菌例如枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌(5ac///2^/e"^s)、短芽孢桿菌(5acz7/w6,'ev&)、嗜熱脂肪芽孢桿菌、嗜堿芽孢桿菌(Bacz7/Ma/fe/op/n7ws)、解淀粉芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌(iacz7/w51coag7^3m1)、環一夫芽孑包^干菌(^Sac〃/wsc^"cw/ara)、丈山^蘭芽孑包牙干菌(^Bc(c/〃w5/flM/w力、巨大芽孑包菌(Bac/〃wwegater/ww)、蘇云金芽孑包才干菌(^a"7/z^〃寄—z'e咖》，或淺青紫鏈霉菌(iS/r一謹少c^s1/z'v油ra)或鼠灰鏈霉菌(5V印to7Mycesmwn'"ws),或革蘭氏陰性菌例如大腸桿菌。纟田菌轉化可以例如通過原生質體轉化或使用感受態細胞以本身已知的方式來實現。酵母生物可以有利地選自酵母屬GSacc/2flrowyce力或裂殖酵母(&Z7/zo犯cc/2arom;;ce)屬的菌種，例如西良酒酵母。宿主細胞還可以是絲狀真菌，例如屬于曲霉屬菌種的菌抹，最優選是米曲霉或黑曲霉，或鐮孢屬(Fw犯n'wm)的菌抹，例如下列菌種的菌抹尖鐮孢(Fwsor/wmc09Aypor/wm)、禾本牙+鐮孑包(i^us"0!rz'i/7"gn37w'we"ram)(在冗全卩介l史命名為玉蜀黍赤霉((^'6^//0^^)，曾命名為玉米球果菌OS^/weWazeae)，與粉紅赤霉((3%^,^//。rawww)和粉紅赤霉禾谷專化型(G/Mwe//aro"wwf.sp.Cereafo)為同物異名)或硫色鐮孢(Fwar&mw/p/weww)(在完全階段命名為虱狀赤霉(0%/^%//"/"",")，與擬絲孑包鐮孑包CFwsan'wmfri'c/io〃化c/o/cfes)、4干孑包4夫鐮孑包(Ft^an:'wmZ""7,/(^o/d^y)、^妻骨木鐮孑包(尸W5an'w仍scwA"d"M7")、4分纟工鐮孑包(Fwan'w/wrasewm)禾口4分纟工鐮孑包禾本矛+哭種(/^j。r/"/wras"ew/"v"/:Wamz'"wwm)為同物異名),禾谷鐮孑包CFwsar/wmcewa/^)(與庫威鐮孑包(Fw犯n'wmcraMwe〃erae)為同物異名)或鑲片鐮孑包(Ft^ar/wwve"e"",MOT)。在本發明的優選實施方式中，宿主細胞是蛋白酶缺陷型或蛋白酶陰性菌抹。例如這可以是蛋白酶缺陷菌抹米曲霉JaL125,其缺失名為"alp"的堿性蛋白酶基因。這種菌抹在WO97/35956(NovoNordisk)或EP專利號429,490中描述。可以通過涉及原生質體形成和原生質體的轉化其后再生細胞壁的方法，以本身已知的方式來轉化絲狀真菌細胞。使用曲霉屬作為宿主微生物在EP238,023(NovoNordiskA/S)中描述，將其內容通過參考并入本文。在植物中表達葡糖淀粉酶變體可以將編碼感興趣的多肽的DNA序列，例如編碼本發明的葡糖淀粉酶的DNA序列如下所述轉化到轉基因植物中并且在其中表達。轉基因植物可以是雙子葉或單子葉的，簡稱雙子葉植物(dicot)或單子葉植物(monocot)。單子葉植物的實例是草，例如草地早熟禾(meadowgrass)(藍草(bluegrass),禾本科(Poa))，牧草(foragegrass)例如羊茅屬(Fey似ca)、黑麥草屬溫帶草例如剪股穎屬(Jgro幼》，以及谷類，例如小麥、燕麥、黑麥、大麥、稻、高粱和玉蜀黍(maize)(玉米)。雙子葉植物實例為煙草，豆類例如羽扇豆，馬鈴薯，糖甜菜，豌豆，菜豆和大豆，和十字花科植物(十字花科(family5rowz'cfl"ae))例如花椰菜、油菜(oilseedrape)以及緊密相關的模型生物擬南芥(Jra6/^9/w:yZ/z"http://awa)。植物部分的實例是莖、愈傷組織、葉、根、果實、種子和塊莖，以及包含這些部分的獨立組織，例如表皮、葉肉、薄壁組織、維管組織、分生組織。在本上下文中，特定植物細胞區室，例如葉綠體(chloroplast)、質外體(apoplast)、線4立體(mitochondria)、'液泡(vacuole)、過氧物酉條體(peroxisome)和纟田月包質，也都認為是植物部分。此外，任何植物細胞，無論其組織來源，都認為是植物部分。類似地，植物部分，如分離以利于本發明利用的特定組織和細胞，也都認為是植物部分，例如胚(embryo)、胚乳(endosperm)、糊粉(aleurone)和種皮(seedcoat)。這些植物、植物部分和植物細胞的子代也包括在本發明的范圍內。表達感興趣的多肽的轉基因植物或植物細胞可按本領域的已知方法構建。簡言之，所述植物或植物細胞通過如下方法來構建將編碼感興趣的多肽的一個或多個表達構建體并入植物宿主基因組，并且將所得的經修飾的植物或植物細胞繁殖成轉基因植物或植物細胞。方便的是，表達構建體是DNA構建體，所述DNA構建體包含編碼感興趣的多肽的基因，所述基因與該基因在所選植物或植物部分中表達所需的適當調節序列可搡作地連接。此外，表達構建體可包含用于鑒定已整合了表達構建體的宿主細胞的選擇標記和用于將構建體^1入所述植物所必需的DNA序歹'J(后者取決于所用的DNA引入方法)。調節序列，如啟動子和終止子序列以及任選地信號或轉運序列的選擇，例如基于期望表達酶的時間(when)、地點(where)和方式(how)來確定。例如，編碼本發明的酶的基因的表達可以是組成型或誘導型，或可以是發育、階段或組織特異性的，并且基因產物可以靶向特定細胞區室、組織或植物部分，例如種子或葉。調節序列例如由Tagueetal，Plant,Phys.,86，506,1988描述。就組成型表達而言，可以使用35S-CaMV、玉米泛素1和稻肌動蛋白1啟動子(Francketal.1980.Cell21:285-294,ChristensenAH,SharrockRAandQuail1992.Maizepolyubiquitingenes:structure,thermalperturbationofexpressionandtranscriptsplicing,andpromoteractivityfollowingtransfertoprotoplastsbyelectroporation.PlantMo.Biol,18,675-689.;ZhangW，McElroyD.andWuR1991,Analysisofrice爿c/75'regionactivityintransgenicriceplants.PlantCell3,1155-1165)。器官特異性啟動子可以是例如，來自貯存庫組織(storagesinktissue)如種子、馬鈴薯塊莖和果實的啟動子(Edwards&Comzzi,1990.Annu.Rev.Genet.24:275-303),或來自代謝庫組織(metabolicsinktissue)如分生組織的啟動子(Itoetal.，1994，PlantMol.Biol.24:863-878),種子特異性啟動子，如來自稻的谷蛋白、醇溶谷蛋白、球蛋白或白蛋白啟動子(Wuetal.,PlantandCellPhysiologyVol.39，No.8pp.885-889(1998))，來自豆球蛋白B4的香豆(Wc/a/a6a)啟動子禾口ConradU.etal，JournalofPlantPhysiologyVol.152,No.6pp.708-711(1998)所述的來自蠶豆的未知種子蛋白基因，來自種子油體(seedoilbody)蛋白的啟動子(Chenetal.，Plantandcellphysiologyvol.39,No.9pp.935-941(1998)，來自歐洲油菜C6raw/ca"a;M》的貯存蛋白napA啟動子，或本領域已知的任何其它種子特異性啟動子，例如在WO91/14772中所描述的。此外，啟動子也可以是葉特異性啟動子，例如來自稻或番茄的rbcs啟動子(Kyozukaetal"PlantPhysiologyVol.102，No.3pp.991-1000(1993),小球藻病毒腺噤呤曱基轉移酶基因啟動子(Mitra，A.andHiggins,DW，PlantMolecularBiologyVol.26，No.lpp.85-93(1994),或來自稻的aldP基因啟動子(Kagayaetal.,MolecularandGeneralGeneticsVol.248,No.6pp.668-674(1995),或傷口i秀導的啟動子如馬鈴薯pin2啟動子(Xuetal,PlantMolecularBiologyVol.22,No.4pp.573-588(1993)。類似地，啟動子可通過非生物處理例如溫度、干旱或鹽度改變來誘導，或由激活啟動子的外源施加的物質，例如乙醇、雌激素、植物激素如乙烯、脫落酸和赤霉酸以及重金屬來誘導。啟動子增強元件中可用于取得酶在植物的較高表達。例如，啟動子增強元件可以是位于啟動子和編碼酶的核苷酸序列之間的內含子。例如，Xuetal.(前文已引用)公開了使用稻肌動蛋白1基因的第一內含子來增強表達。選擇標記基因和表達構建體的任何其它部分可由本領域可用的那些來選擇。用本領域已知的常規技術將DNA構建體整合至植物基因組，所述常規技術包括農桿菌(X^"Z^cfe/^w)介導的轉化、病毒介導的轉化、微注射(microinjection)、粒子轟擊、生物射彈轉化和電穿孔(Gasseretal,Science,244,1293;Potrykus,Bio/Techn.8,535,1990;Shimamotoetal,Nature,338,274,1989)。目前，才艮癌土》裏4干菌(Jgro6a"e7JMmm7Me^zc/era)介導的基因專爭移是用于產生轉基因雙子葉植物的優選方法(參見綜述Hooykas&Schilperoort,1992，PlantMol.Biol.19:15-38)，并且也能用于轉化單子葉植物，盡管對這些植物通常使用其它轉化方法。目前，補充土壤桿菌(Jgra6a"en'ww)法用于產生轉基因單子葉植物的優選方法是胚愈傷組織或發育中的胚的粒子轟擊(用轉化DNA涂覆的微觀的(microscopic)金或鴒顆粒)(Christou,1992.PlantJ.2:275-281;Shimamoto,1994.CumOpin.Biotechnol.5:158-162;Vasiletal"1992.Bio/Technology10:667-674)。轉化單子葉植物的可選方法基于原生質體轉化，如Omii-ullehS,etal"PlantMolecularbiologyVol.21,No.3pp.415-428(1993)所述。轉化后，根據本領域熟知的方法選擇并入表達構建體的轉化體并將其再生成全植物。通常將轉化方法設計成通過使用例如兩種獨立T-DNA構建體的共轉化或使用特異性重組酶位點特異性切除選擇基因，從而在再生期間或在后代中選擇性地消除選擇基因。產生葡糖淀粉酶變體的方法
技術領域：
：本發明還涉及產生本發明葡糖淀粉酶變體的方法，所述方法包括在有益于產生所述變體的條件下培養宿主細胞，和從所述細胞和/或培養基中回收該變體。用于培養細胞的培養基可以是任何方便的培養基，其適合于培養所述宿主細胞和獲得本發明葡糖淀粉酶變體的表達。適合的培養基可以從商業供應商獲得，或可以根據公開的配方制備(例如美國典型培養物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection)的目錄中所述)。可以通過熟知的方法方便地從培養基中回收由宿主細胞分泌的葡糖淀粉酶變體，所述熟知的方法包括通過離心或過濾從培養基分離細胞；借助鹽例如硫酸銨沉淀培養基中的蛋白質成分；其后使用層析方法例如離子交換層析、親和層析等。葡糖淀粉酶變體的用途可以將本發明的變體用于淀粉轉化方法中，例如任何淀粉降解方法中，其中將淀粉降解成例如葡萄糖，例如用于甜味劑的生產中或在用于產生有機化合物的發酵方法中，所述有機化合物例如乙醇、檸檬酸、抗壞血酸、賴氨酸、檸檬酸、谷氨酸一鈉、葡糖酸、葡糖酸鈉、葡糖酸鈣、葡糖酸鉀、葡糖酉吏5內酉旨(gluconodeltalactone)、異抗壞血酸鈉(sodiumerythorbate)、衣康酸、乳酸、葡糖酸；酮；氨基酸，谷氨酸(一谷氨酸鈉(sodiummonoglutaminate))、青霉素、四環素；酶；維生素，例如核黃素、B12、(3-胡蘿卜素或激素。常規淀粉轉化方法，例如液化和糖化方法在例如美國專利No.3，912，590和EP專利公開Nos.252,730和63，909中描述，將它們作為參考并入本文。本發明的變體對于淀粉轉化，例如在甜味劑高果糖玉米糖漿(HFCS)的產生中尤其有用。可以將本發明的變體用在用于產生酒精飲料、燃料或飲用乙醇的淀粉糖化(mashing)和/或發酵方法中。淀粉轉化本發明提供使用本發明的葡糖淀粉酶變體用于從淀粉產生葡萄糖等的方法。通常所述方法包括以下步驟在a-淀粉酶的存在下將前體淀粉部分水解，其后在葡糖淀粉酶存在下，通過切割a-(l-4)和a-(l-6)糖苷鍵，進一步從淀粉或相關寡糖和多糖分子的非還原端水解釋放D-葡萄糖。使用a-淀粉酶部分水解前體淀粉通過水解內部的a-(l-4)-連接來提供淀粉分子的初始分解。在商業應用中，使用a-淀粉酶的初始水解在大約10S。C的溫度進行。加工的淀粉濃度非常高，通常是30%至40%固體。初始水解通常在這種高溫進行5分鐘。其后可將部分水解的淀粉轉移至第二罐并且在85°至90。C的溫度溫育大約1小時以得到10至15的葡萄糖當量(D.E.)。進一步水解的步驟在葡糖淀粉酶存在下從淀粉或相關寡糖和多糖分子的非還原端釋放D-葡萄糖，該步驟通常在分開的罐中在降低的溫度30°-60。C進行。優選將底物液體的溫度降低至55。C-60。C。溶液的pH從6-6.5降低至3-5.5。優選地，溶液的pH是4-4.5。將葡糖淀粉酶添加至溶液，并且將反應進行24-72小時，優選36-48小時。可以使用本發明的葡糖淀粉酶變體的糖化方法實例包括JP3-224493;JP1-191693;JP62-272987;和EP452,238中描述的方法。可以將本發明的葡糖淀粉酶變體與僅水解具有至少四個葡糖殘基的分子中a-(l-6)-糖苦鍵的酶組合用于本發明的方法中。優選地，可將本發明的葡糖淀粉酶變體與支鏈淀粉酶或異淀粉酶組合使用。異淀粉酶和支鏈淀粉酶用于脫支(debranching)的用途、所述酶的分子性質和所述酶與葡糖淀粉酶一起的潛在用途在G.M.A.vanBeynumetal"StarchConversionTechnology,MarcelDekker，NewYork,1985,101-142中描述。本發明還涉及本發明的葡糖淀粉酶變體在淀粉轉化方法中的用途，優選在連續糖化步驟中的用途。本發明的葡糖淀粉酶變體還可以固定化的形式使用。這是合適的并且通常用于生產麥芽糊精或葡萄糖糖漿或特殊糖漿(specialitysymp)，例如麥芽糖糖漿；并且還用于與果糖糖漿生產有關的寡糖殘液液流(m伍natestream)。當期望的最終糖產品是例如高果糖糖漿時，可將葡萄糖糖漿轉化為果糖。在糖化方法之后，將pH升高至6-8的值，優選pH7.5，并且通過離子交換去除鈣。其后使用例如固定化葡萄糖異構酶(例如SweetzymeTMlT)將葡萄糖糖漿轉化為高果糖糖漿。發酵方法可以將麥芽糖和/或葡萄糖發酵成乙醇產品或其它發酵產物，例如檸檬酸、谷氨酸一鈉、葡糖酸、葡糖酸鈉、葡糖酸鈣、葡糖酸鉀、葡糖酸5內酯或異抗壞血酸鈉、衣康酸、乳酸、葡糖酸；酮；氨基酸，谷氨酸(一谷氨酸鈉(sodiummonoglutaminate))、青霉素、四環素；酶；維生素，例如核黃素、B12、卩-胡蘿卜素或激素。通常基于整谷粒的發酵方法，例如乙醇方法，可分為4個主要步驟磨碎(milling)、液化、糖化、發酵。磨J爭谷粒以打開結構和允許進一步加工。使用濕磨和干磨兩種方法。在干磨中，研磨整谷粒并且用在方法的剩余部分中。濕磨提供胚芽(germ)和粗粉(meal)(淀粉顆粒和蛋白質)的良好分離，并且除了少數例外，將濕磨應用于存在平行生產糖漿的場合。在液化方法中，通過水解成主要為DP大于4的麥芽糊精來溶解淀粉顆粒。可以通過酸處理或通過a-淀粉酶的酶處理來進行所述水解。酸水解在有限的基礎上使用。原料可以是磨碎的整谷粒或來自淀粉加工的側流(sidestream)。酶液化通常作為三步熱漿方法進行。將漿料加熱至60-95°C，優選80-85。C,并添加酶。其后將漿料在95-140°C,優選105-125°C蒸汽熱壓蒸煮(jet-cool()以將淀粉凝膠化，冷卻至60-95。C,再添加更多的酶以獲得最終水解。所述液化方法在pH4.5-6.5，通常在pH5-6進行。經磨碎和液化的谷物也稱為醇Hmash)。為了產生酵母能夠代謝的低分子糖DPw，必須將來自液化的麥芽糊精進一步水解。所述水解通常通過葡糖淀粉酶以酶方法進行，或者可以^使用a-葡糖苷酶或酸性a-淀粉酶。完整糖化步驟可以持續多至72小時，然而，一般僅進行通常為40-90分鐘的預糖化，然后是發酵期間的完全糖化(SSF)。糖化通常在30-65。C,通常大約60。C的溫度，并且在pH4.5進行。將通常源自酵母屬菌種(6bcc/7"ram;/c"spp.)的酵母添加至所述醪并且將發酵進行24-96小時，例如通常為35-60小時。溫度是26-34。C，通常是大約32°C，并且pH是pH3-6，優選大約pH4-5。注意到最廣泛使用的方法是同時糖化和發酵(SSF)方法，其中不存在用于糖化的保持階段(holdingstage)，意思是將酵母和酶一起添加。當進行SSF時，通常在即將發酵之前引入溫度在50°C以上的預糖化步驟。也可以不使淀粉凝膠化而以所謂的生淀粉水解方法來進行液化和糖化，例如在WO2004/080923、WO2004/081193或WO2003/66826中所述。生淀4分水解方法優選作為SSF方法進行。在發酵之后，蒸餾醪以提取乙醇。根據本發明的方法獲得的乙醇可以用作例如燃料乙醇；飲用乙醇，即，可飲用的精制酒精(potableneutralspirits);或工業乙醇。發酵的剩余物(leftover)是酒糟(spendgrain),酒糟通常用于液體形式或干燥的動物飼料。關于如何進行液化、糖化、發酵、蒸餾和回收乙醇的更多細節是技術人員熟知的。方法葡糖淀粉酶活性(AGU)可以將葡糖淀粉酶活性以AGU單位測量。將lAGU定義為在標準條件下每分鐘水解l微摩爾麥芽糖的酶量，所述標準條件是37。C,pH4.3,底物麥芽糖23.2mM,緩沖液乙酸鹽0.1M，反應時間5分鐘。可使用自動分析系統。將變旋酶添加至葡萄糖脫氫酶試劑，從而將存在的任何a-D-葡萄糖轉化成(3-D-葡萄糖。在上述反應中葡萄糖脫氫酶與(3-D-葡萄糖特異性地反應，形成NADH,使用光度計在340nm測定NADH作為原始葡萄糖濃度的量度。AMG溫育底物麥芽糖23.2mM緩沖液乙酸鹽0.1MpH:4.30±0.05溫育溫度37。C±1反應時間5分鐘酶工作范圍0.5-4.0AGU/mL顯色反應GlucDH:430U/L變旋酶9U/LNAD:0.21mM緩沖液磷酸鹽0.12M;0.15MNaClpH:7.60土0.05溫育溫度37。C士l反應時間5分鐘波長340nm25更詳細描述這種分析方法的文件夾(EB-SM-0131.02/01、可以根據要求乂人NovozymesA/S,Denmark獲得，將該文件夾作為參考并入本文。實施例實施例1用30%DS的DE11液化淀粉，在pH4.3和60°C在4唐化試驗中測試來自rfl/aramycMemenwwY的親本葡糖淀粉酶(SEQIDNO:2)和選擇的包含特定耳又代的變體。所述DE11液化淀粉從在pH5.2具有5ppmCa4"+的33%DSCerestar玉米淀粉制備，并且用TermamylSupra(120KNU(T)/g)液化。將所述試驗一式兩份地進行。在不含或含有下述額外的酶的條件下進行所述測試；0.012AFAU/gDS來自黑曲霉的酸性oc-淀粉酶和0.2NPUN/gDS來自Bacz7/wa/77y/oiie7""a冊ycara的支《連淀4分酉爭。表1.使用0.04mg葡糖淀粉酶/gDS的糖化。LSD對于DPI為+-0.2,而對于DP2為+-0.1<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>權利要求1.親本葡糖淀粉酶的變體，所述變體葡糖淀粉酶與親本葡糖淀粉酶相比縮合產物的產量降低。2.權利要求l的變體，其中所述縮合產物是異麥芽糖。3.親本葡糖淀粉酶的變體，其在以下區域之一中包含變化區域248-255,例如在位置248、249、250、251、252、253、254和/或255的一個或多個中，區域309-318，例如在位置309、310、311、312、313、314、315、316、317和/或318的一個或多個中，和/或區域409-415,例如在位置409、410、411、412、413、414和/或415的一個或多個中，其中(a)所述變化獨立地是(i)在占據所述位置的氨基酸的下游插入氨基酸，(ii)將占據所述位置的氨基酸缺失，或Ciii)用不同的氨基酸取代占據所述位置的氨基酸，(b)所述變體具有葡糖淀粉酶活性并且(c)各區域或位置對應于親本葡糖淀粉酶的氨基S1序列的位置，所述親本葡糖淀粉酶具有SEQIDNO:2的氨基S^f列，和/或對應于同源葡糖淀粉酶中的區域或位置，所述同源葡糖淀粉酶與SEQIDNO:2中所示氨基S銀列顯示至少50%同源性。4.權利要求1-3中任一項的變體，所述變體在以下位置的一個或多個包含變化252、312、314、315、412,其中各位置對應于親本葡糖淀粉酶的氨基酸序列的位置，所述親本葡糖淀粉酶具有SEQIDNO:2的氨基酸序列，和/或對應于同源葡糖淀粉酶中的位置，所述同源葡糖淀粉酶與SEQIDNO:2中所示氨基酸序列顯示至少50%同源性。5.權利要求1或4中任一項的變體，所述變體包含以下變化中的一種或多種在位置252取代為A、F、G或V;在位置312取代為S,在位置314取代為E、F、N、R、T、W或Y;在位置315取代為A、D、F、H、K、L、N、Q、R、S、T或Y，在位置412取代為D,或在位置314和315之間插入氨基酸殘基I,其中所述各位置對應于親本葡糖淀粉酶的氨基酸序列的位置，所述親本葡糖淀粉酶具有SEQIDNO:2的氨基S^f列，和/或對應于同源葡糖淀粉酶中的位置，所述同源葡糖淀粉酶與SEQIDNO:2中所示氨基酸序列顯示至少50%同源性。6.權利要求1至5中任一項的變體，所述變體包含以下取代中的一個或多個V312S、Q314E、Q314F、Q314N、Q314R、Q314T、Q314W、Q314Y、G315A、G315D、G315F、G315H、G315K、G315L、G315N、G315Q、G315R、G315S、G315T、G315Y、L252A、L252F、L252G、L252V、L412D或在位置314和315之間插入氨基酸殘基I(Q314QI)，其中所述各位置對應于親本葡糖淀粉酶的氨基S臾序列的位置，所述親本葡糖淀粉酶具有SEQIDNO:2的氨基酸序列，和/或對應于同源葡糖淀粉酶中的位置，所述同源葡糖淀粉酶與SEQIDNO:2中所示氨基S踏列顯示至少50%同源性。7.權利要求1至6中任一項的變體，所述變體包含I^又代G315F，其中所述位置對應于親本葡糖淀粉酶的氨基酸序列的位置，所述親本葡糖淀粉酶具有SEQIDNO:2的氨基a銀列，和/或對應于同源葡糖淀粉酶中的位置，所述同源葡糖淀粉酶與SEQIDNO:2中所示氨基酸序列顯示至少50%同源性。8.權利要求1至6中任一項的變體，所述變體包含取代G315Y，其中所述位置對應于親本葡糖淀粉酶的氨基酸序列的位置，所述親本葡糖淀粉酶具有SEQIDNO:2的氨基酸序列，和/或對應于同源葡糖淀粉酶中的位置，所述同源葡糖淀粉酶與SEQIDNO:2中所示氨基S臾序列顯示至少50%同源性。9.權利要求1至8中任一項的變體，所述變體包含取代L252A，其中所述位置對應于親本葡糖淀粉酶的氨基S殳序列的位置，所述親本葡糖淀粉酶具有SEQIDNO:2的氨基S^f列，和/或對應于同源葡糖淀粉酶中的位置，所述同源葡糖淀粉酶與SEQIDNO:2中所示氨基S^/f列顯示至少50%同源性。10.權利要求1至9中任一項的變體，所述變體包含以下取代組合中的一個或多個314F+315N、314W+315N、314Y+315N、314L+315A、314N+315R、314R+315D、315R+463T、315R+556E、315L+529N,其中所述各位置對應于親本葡糖淀粉酶的氨基酸序列的位置，所述親本葡糖淀粉酶具有SEQIDNO:2的氨基S拼列，和/或對應于同源葡糖淀粉酶中的位置，所述同源葡糖淀粉酶與SEQIDNO:2中所示氨基S吏序列顯示至少50%同源性。11.權利要求1至10中任一項的變體，所述變體包含以下取代組合中的一個或多個Q314F+G315N、Q314W+G315N、Q314Y+G315N、Q314L+G315A、Q314N+G315R、Q314R+G315D、G315R+A463T、G315R+K556E、G315L+D529N，其中所述各位置對應于親本葡糖淀粉酶的氨基酸序列的位置，所述親本葡糖淀粉酶具有SEQIDNO:2的氨基酸序列，和/或對應于同源葡糖淀粉酶中的位置，所述同源葡糖淀粉酶與SEQIDNO:2中所示氨基H拼列顯示至少50%同源性。12.權利要求1至11中任一項的變體，其中所述親本葡糖淀粉酶具有的氨基酸序列與SEQIDNO:2的氨基酸序列有至少60%,優選至少60%,更優選至少大約70%,還更優選至少80%，甚至更優選至少90°/。，最優選至少95%,并且最優選至少98%同一性程度。13.權利要求1至12中任一項的變體，其中所述親本葡糖淀粉酶由核S銀列編碼，所述核S臾序列在低嚴緊條件下，在中嚴緊條件下，或在高嚴緊務f牛下與SEQIDNO:1的核酸序列或其互補鏈雜交。14.權利要求1至13中任一項的變體，其中所述親本葡糖淀粉酶獲得自踝節菌屬,尤其是K7/ara"，es綴ersom'Z。15.權利要求1至14中任一項的變體，其中所述變體與親本葡糖淀粉酶相比具有減少的縮合。16.DNA構建體，其包含編碼根據權利要求1至15中任一項的葡糖淀粉酶變體的DNA序列。17.重組表達載體，其攜帶根據權利要求16的DNA構建體。18.用根據權利要求16的DNA構建體或根據權利要求17的載體轉化的細胞。19.根據權利要求18的細胞，所述細胞是微生物，具體而言是細菌或真菌。20.根據權利要求19的細胞，所述細胞是來自踝節菌屬菌種的菌抹。21.根據權利要求20的細月包，所述細胞是來自ra/aram_ycase/we730""的菌抹。22.用于將淀粉轉化或部分水解成為含有葡萄糖的糖漿的方法，所述方法包括在根據權利要求1至15中任一項的葡糖淀粉酶變體存在下將淀粉水解物糖化。23.權利要求22的方法，其中所述葡糖淀粉酶變體的劑量以0.05至0.5AGU每克干固體的范圍存在。24.權利要求22或23中任一項的方法，其包括糖化淀粉水解物，優選按重量計具有至少30%干固體的淀粉水解物。25.權利要求1至15中任一項的葡糖淀粉酶變體在淀粉轉化方法中的用途，優選在連續淀;盼轉化方法中的用途。26.根據權利要求1至15中任一項的葡糖淀粉酶變體在用于產生寡糖、麥芽糊精或葡萄糖糖漿的方法中的用途。27.根據權利要求1至15中任一項的葡糖淀粉酶變體在用于產生高果糖玉米糖漿的方法中的用途。28.根據權利要求1至15中任一項的葡糖淀粉酶變體在用于產生酒精飲料、燃料或飲用乙醇的方法中的用途。29.根據權利要求1至15中任一項的葡糖淀粉酶變體在用于產生有機化合物的發酵方法中的用途。全文摘要本發明涉及具有改進性質的葡糖淀粉酶變體和使用所述葡糖淀粉酶變體的方法。文檔編號C12N9/24GK101310016SQ200680042983公開日2008年11月19日申請日期2006年11月17日優先權日2005年11月18日發明者埃斯本·P·弗里斯,斯蒂芬·丹尼爾森,杰普·W·塔姆斯申請人:諾維信公司