專利名稱：：一種藻類細胞快速高密度培養方法
技術領域：
：本發明涉及藻類高密度培養，具體說是一種藻類細胞快速高密度培養方法，可用于培養藻類、生產相關產品或提供水產養殖餌料等。技術背景藻類可利用氣體中的二氧化碳進行光自養，富含蛋白質、脂肪和維生素等營養物質，具有繁殖快、環境適應性強等優點，常作為水產養殖用的餌料。同時，藻類遺傳及生化組成特殊性及代謝途徑的復雜性，決定其潛在的營養與藥學價值，人類可從中開發出大量結構特異的高附加值的生物活性成分。亞心形扁藻規模化培養存在的主要問題是藻細胞生長緩慢，倍增時間長制約了亞心形扁藻在各領域的廣泛應用。藻類規模化人工培養目前主要有開放式培養和封閉式光生物反應器二類方式。開放式培養相對簡單、投資低；但該方式培養微藻的產率低，存在嚴重的生物污染，限制藻類培養和資源開發。復雜的封閉式光生物反應器培養藻類易于控制生物污染，產率相對高，但成本相對也高。因此，開發高密度培養基及構建低廉高效的光生物反應器裝置成為開發藻類資源的關鍵核心技術。
發明內容本發明的目的在于提供的一種藻類細胞快速高密度培養方法，本發明將優化培養基與光生物反應器聯用，可達到藻類高密度培養的目的，培養所需時間短，可大幅度地減少投資，達到藻類資源開發經濟可行的。為實現上述目的，本發明采用的技術方案為-一種藻類細胞快速高密度培養方法，于光生物反應器中添加高密度培養基，將微藻細胞接種于光生物反應器中，接種密度為0.1xl06lxl()6cells/mL，平均光強為4000~6000lx，采用左右兩個方向采光，溫度控制在15~30°C，光暗時間比為10-24h:14-0h，每升培養基通氣量為0.05-1L/min;所述高密度培養基是由經砂濾的天然海水滅菌冷卻后添加不同營養鹽制成，營養鹽的添加量為NaN0341360mg/L,NaH2P04'2H2012100mg/L，Tris0~1000mg/L,CH3COOH0~2ml，EDTA-Na20~60mg/L,H3B0325~50mg/L，FeCl3.6H2015mg/L,MnCl2.4H200~0.5mg/L，ZnCl20~0.05mg/L,CoCl2.6H20(M).05mg/L,CuS04.5H2000.05mg/L。通入的氣體為空氣或空氣與二氧化碳(包括大氣中的C02及工廠排放氣中的C02)的混合氣，二氧化碳與空氣的體積比例為0.05~10%;微藻包括來自淡水或海水的藻類，最好為綠藻或金藻。所述高密度培養基是由經砂濾的天然海水滅菌冷卻后添加不同營養鹽制成，營養鹽的添加量最好為NaN03807mg/L，NaH2PCV2H2055mg/L，Tris830mg/L，CH3COOH0.6ml,EDTA-Na45mg/L,H3B0333.6mg/L，FeCl3'6H201.3mg/L，MnCl2.4H200.36mg/L，ZnCl20.021mg/L，CoCl2.6H200.02mg/L，CuS04.5H200.02mg/L，(NH4)6M07024.4H200，mg/L。所述光生物反應器由氣源經主管路與培養單元相連接構成；其中培養單元為1個或1個以上的多個并聯；培養單元由透明材質(透明材質為玻璃管和塑料袋包括聚丙烯、聚氯乙烯或聚丙烯等)制成，培養單元的左右兩側均設置有光源(光源為太陽光和人工光源)；培養單元的底部設置有由多孔材料構成的布氣器，布氣器下端設置有與外管路相通的進氣Ch所述氣源為相互并聯的氣瓶與壓縮泵，它們分別通過氣體控制閥和氣體流量計與主管路相連通。所述多孔材料可為玻璃泡、篩板、珊瑚礁或氣石等，最好為篩板。本發明與現有技術相比具有如下優點-本發明通過合理配置氮磷營養鹽濃度、碳源、光強、有效接收轉化光能、藻液的攪動程度，實現藻類短期內快速增殖，縮短培養時間。本發明的光生物反應器能充分利用轉化光能，有效保障體系內部的藻液營養分布均勻一致，避免光反應器內存在的死角問題，氣體交換(補償二氧化碳)充分，降低了細胞貼壁生長，極大提高微藻培養效率。本發明適于微藻高密度規模生產，為微藻資源綜合開發利用提供經濟效益。圖1為本發明光生物反應器正面觀示意圖；圖2為本發明光生物反應器側面觀示意圖；注l.氣瓶；2.壓縮泵；3.氣體控制闊；4.氣體流量計；5.光生物反應器;6.光源；7為布氣器；(箭頭表示氣流方向)圖3為不同培養基及培養方式扁藻細胞的生長動力學圖譜。具體實施方式下面通過具體實施例對本發明的方法與結果進行說明，本發明細胞培養參照申請人已申報的專利(申請號03110981.0，發明名稱一種海洋綠藻兩步法生物光解水制氫方法)進行，其他試劑均為商業化的試劑。所述光生物反應器由氣源經主管路與培養單元5相連接構成；所述培養單元5為多個并聯；培養單元5由透明材質制成，培養單元的左右兩側均設置有光源6;培養單元5的底部設置有由篩板制成的布氣器7，布氣器下端設置有與外管路相通的進氣口；所述氣源為相互并聯的氣瓶1與壓縮泵2，它們分別通過氣體控制閥3和氣體流量計4與主管路相連通。實施例1亞心形扁藻由遼寧省大連水產研究所提供，并經過本實驗室平板純化。用經砂濾的天然海水ll(TC高壓蒸汽滅菌15min，冷卻后添加不同營養鹽，配制康維方培養基(NaN03100mg/L，NaH2P04'H2020mg/L，EDTA—Na45mg/L，H3B0333.6mg/L，FeCl3-6H201.3mg/L，MnCl2.4H200.36mg/L，ZnCl20.021mg/L，CoCl2.6H200.02mg/L，CuS04.5H200.02mg/L，(NH4)6M07024.4H200.009mg/L)。從瓊脂平板挑取的單細胞藻落，經逐級放大培養，獲得種子細胞。細胞接種密度為0.6xl06cells/mL，平均光強為5000lx，采用左右兩個方向采光，溫度控制在25'C，光暗時間比為14h:10h。依照均勻實驗設計要求將氮、磷、Tris-HAc按不同比例配制成10培養基，其中氮摩爾濃度為0.0516mM，磷摩爾濃度為0.01lmM，Tris-HAc濃度從1.6540mM(以Tris計，Tris:HAc=10mM:lml)，各培養基中微量元素含量均同康維方培養基。對培養10天的結果進行藻細胞計數，并取200ml勻勻的藻A菱離心、精'洗、烘干、稱重。結J艮如下<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>由上表可知7~10號培養基培養效果均明顯優于其它培養基，即氮源濃度在4~16mM范圍內能有效促進扁藻細胞快速增殖，其獲得藻細胞數量均為在康維方培養條件下的1.98倍以上，最高達2.3倍。利用10種培養基獲得扁藻細胞干重對其培養基成分進行優化，在不計微量元素的情況下，由Matlab統計軟件計算得到優化培養基為N03—-N9.50mM，P043—_P0.34mM，Tris-HAc6.7mM。實施例2亞心形扁藻由遼寧省大連水產研究所提供，并經過本實驗室平板純化。5用經砂濾的天然海水ll(TC高壓蒸汽滅菌15min，冷卻后添加營養鹽，配制康維方培養基(NaN03100mg/L，NaH2P04'H2020mg/L，EDTA—Na45mg/L，H3B0333.6mg/L，FeCl3.6H201.3mg/L，MnCl2.4H200.36mg/L，ZnCl20.021mg/L，CoCl2.6H200.02mg/L，CuS04.5H200.02mg/L，(NH4)6M07024.4H200.009mg/L)和優化培養基(NaN03807mg/L,NaH2P04.2H2055mg/L,Tris830mg/L,CH3COOH0.6ml，EDTA-Na45mg/L，H3B0333.6mg/L，FeCl3.6H201.3mg/L,MnCl2.4H200.36mg/L，ZnCl20.021mg/L，CoCl2.6H200.02mg/L，CuS04'5H200.02mg/L,(NH4)6M07024.4H200.009mg/L))。。從瓊脂平板挑取的單細胞藻落，經逐級放大培養，獲得種子細胞。細胞接種密度為0.6xl06CellS/mL，將藻液分為兩組，一組進行康維方培養基搖瓶靜置培養，每天定時搖46次，另一組放入12個培養單元裝置，透明材料為玻璃管，底部通氣裝置多孔材料為篩板，均勻設計得到的優化培養基，通入空氣培養，流速為200ml/min，平均光強為5000lx，采用左右兩個方向采光，溫度控制在25t:，光暗時間比為14h:10h。從圖3可以看出，培養到第15天，采用搖瓶靜置培養的方式，細胞密度達2X10^dls/mL，而采用光生物反應器優化培養基通空氣培養，細胞密度達8X10^ells/mL。利用光生物反應器，光自屏蔽現象得以改善，光能利用率提高，氣體交換通暢，縮短生產周期，降低生產成本。權利要求1.一種藻類細胞快速高密度培養方法，其特征在于于光生物反應器中添加高密度培養基，將微藻細胞接種于光生物反應器中，接種密度為0.1×106～1×106cells/mL，平均光強為4000～6000lx，采用左右兩個方向采光，溫度控制在15～30℃，光暗時間比為10-24h∶14-0h，每升培養基通氣量為0.05～1L/min；所述高密度培養基是由經砂濾的天然海水滅菌冷卻后添加不同營養鹽制成，營養鹽的添加量為NaNO34～1360mg/L，NaH2PO4·2H2O12～100mg/L，Tris0～1000mg/L，CH3COOH0～2ml，EDTA-Na20～60mg/L，H3BO325～50mg/L，FeCl3·6H2O1～5mg/L，MnCl2·4H2O0～0.5mg/L，ZnCl20～0.05mg/L，CoCl2·6H2O0～0.05mg/L，CuSO4·5H2O0～0.05mg/L。2.按照權利要求1所述藻類細胞快速高密度培養方法，其特征在于所述通入的氣體為空氣或空氣與二氧化碳的混合氣，二氧化碳與空氣的體積比例為0.05~10%。3.按照權利要求1所述藻類細胞快速高密度培養方法，其特征在于所述微藻為綠藻或金藻。4.按照權利要求1所述藻類細胞快速高密度培養方法，其特征在于所述高密度培養基是由經砂濾的天然海水滅菌冷卻后添加不同營養鹽制成，營養鹽的添加量為NaN03807mg/L，NaH2P(V2H20:55mg/L,Tris830mg/L,CH3COOH0.6ml,EDTA-Na45mg/L,H3B0333.6mg/L，FeCl3.6H201.3mg/L，MnCl2.4H200.36mg/L,ZnCl20.021mg/L,CoCl2-6H200.02mg/L,CuS04.5H200.02mg/L，(NH4)6M07024.4H200.009mg/L。5.按照權利要求1所述藻類細胞快速高密度培養方法，其特征在于所述光生物反應器由氣源經主管路與培養單元(5)相連接構成；其中培養單元(5)可為1個或1個以上的多個并聯；培養單元(5)由透明材質制成，培養單元的左右兩側均設置有光源(6);培養單元(5)的底部設置有由多孔材料構成的布氣器(7)，布氣器下端設置有與外管路相通的進氣口；所述氣源為相互并聯的氣瓶(1)與壓縮泵(2)，它們分別通過氣體控制閥(3)和氣體流量計(4)與主管路相連通。6.按照權利要求5所述藻類細胞快速高密度培養方法，其特征在于所述多孔材料為玻璃泡、篩板、珊瑚礁或氣石。7.按照權利要求5所述藻類細胞快速高密度培養方法，其特征在于所述多孔材料為篩板。全文摘要本發明涉及藻類高密度培養，具體說是一種藻類細胞快速高密度培養方法，于光生物反應器中添加高密度培養基，將微藻細胞接種于光生物反應器中，采用左右兩個方向采光。本發明通過合理配置氮磷營養鹽濃度、碳源、光強、有效接收轉化光能、藻液的攪動程度，實現藻類短期內快速增殖，縮短培養時間。本發明的光生物反應器能充分利用轉化光能，有效保障體系內部的藻液營養分布均勻一致，避免光反應器內存在的死角問題，氣體交換充分，降低了細胞貼壁生長，極大提高微藻培養效率。本發明適于微藻高密度規模生產，為微藻資源綜合開發利用提供經濟效益。文檔編號C12N1/12GK101265449SQ20071001059公開日2008年9月17日申請日期2007年3月14日優先權日2007年3月14日發明者遠劉,衛張,虞星炬,禎郭,金美芳,陸洪斌,陳兆安申請人:中國科學院大連化學物理研究所