專利名稱：一種藻類細胞破碎的方法
技術領域：
本發明涉及一種藻類細胞破碎的方法，更具體地說是利用臭氧氧化和加壓-減壓共同作用破碎小球藻細胞的新方法。
背景技術：
人類的生產生活產生了大量的含氮、磷等營養物質的廢水，這些廢水經由市政排水管網等系統進入湖泊、河流、海灣等水體，引起藻類迅速繁殖，水體中溶解氧含量下降，水質惡化，繼而導致魚類及其它生物大量死亡。近年來由于污染造成的環境惡化逐步加重，水體藻類污染的程度也逐年加深。水體出現富營養化現象時，由于藻類等浮游生物大量繁殖，往往使水體呈現藍色、紅色、綠色等，這種現象在江河湖泊中稱為水華，在海洋中稱為赤潮。赤潮或水華在全球范圍內頻繁出現是藻類污染程度加深的直接反映。我國在1933 年到1979年的46年中僅發生過12次赤潮；1990年到1994年的5年中就發生了 139次赤潮；2002年發生79起，影響面積為10150平方公里；2003年發生119起，影響面積為14550平方公里；2005年發生82起，影響面積為27070平方公里；2006年93起，影響面積為19840平方公里；2012年我國深圳南澳海面出現較大面積夜光藻赤潮。隨著各自然水體中富營養化程度的日趨嚴重，藻類生長對水體的危害也變得不容忽視，湖泊海洋等水體中水華、赤潮現象的層出不窮使得快速有效地殺死水體中藻類技術的研發顯得愈發重要和急迫。目前世界范圍內有多種除藻技術，如物理除藻、化學除藻以及生物除藻等。隨著世界范圍內化石能源的逐年減少，研究熱點從單一的除藻問題轉向藻類的綜合利用，破碎藻類細胞壁提取藻類體內的生物油脂就是一個重要的方向。目前國內外微藻油脂破壁提取技術主要包括機械超微粉碎破壁技術、熱化學破壁提取技術、超臨界流體提取技術、超聲微波輔助提取法等。但上述方法存在著步驟繁多，操作困難，適用范圍有限，成本過高等問題。在壓力輔助下利用臭氧的強氧化性破碎藻類細胞的研究還未有報道。臭氧氧化分為直接和間接兩種，直接氧化是臭氧直接作用于反應物發生的氧化反應，間接氧化是利用在臭氧水中分解產生的比臭氧氧化能力更強的羥基自由基(· 0H)等活性自由基與反應物發生的反應。利用臭氧的氧化性，伴隨著壓力的增減交替，更加有助于藻類細胞的破碎。本發明旨在探尋破碎藻類細胞的一種新方法，可以快速高效滅殺水體中藻類，且可以利用部分藻類生物質能源。
發明內容
本發明的目的是為了解決上述的步驟繁多，操作困難，適用范圍有限等技術問題而提供一種藻類細胞破碎的方法，該方法能有效地破碎藻類細胞，具有處理效率高等特點。本發明的技術原理
適當壓力下通入一定量的臭氧有利于細胞壁的破碎。首先，臭氧的直接或間接氧化作用作用于細胞的細胞壁，通過改變細胞的通透性迫使藻類細胞壁變薄甚至裂開，臭氧的強氧化性不僅可以氧化細胞壁薄的微藻，對細胞壁厚的微藻也有很好的氧化效果。其次，借助壓力的反復增減，微藻經歷膨脹、擠壓的反復交替過程，進一步加速了藻類細胞的破碎。在循環次數一定的條件下控制壓力的大小及在壓力一定的條件下改變循環次數，對藻類細胞的破碎效果都會產生顯著的影響。本發明的技術方案
一種藻類細胞破碎的方法，具體包括下列步驟
(I)、將收獲的藻液置于高壓反應釜中，控制120 130 r/min轉動5 min將藻液攪拌混勻；
(3)、打開臭氧發生器和空壓機，控制臭氧和空氣混合氣體的流量為2L/min，并控制反應釜轉速為120 130 r/min勻速攪動藻液，使通入的臭氧、空氣和藻液混合均勻；
所述的臭氧和空氣組成的混合氣體按體積比計算，即臭氧空氣為I :150 ； (4)、將壓力條件設置為O.4 O. 8 MPa、維持I 2 s時間后降壓至常壓，然后再升壓至O. 4 O. 8 MPa、維持I 2 s時間后再降壓至常壓，反復40 80個循環，即完成藻類細胞破碎。本發明的有益效果
本發明的藻類細胞破碎的方法，利用壓力輔助臭氧法對藻類細胞破壁，可有效地殺死水體中的藻類，抑制富營養化對水體的危害。實驗證明，在系統最大壓力為O. 8 MPa，加壓-減壓循環數為80的條件下，可以有效破碎藻類細胞壁和細胞膜，使細胞內含物外流，且某些易被氧化的葉綠素等物質可以被臭氧進一步氧化，從而降低藻類在自然水體中腐敗氧化時所需的氧量。采用本發明的藻類細胞破碎的方法破碎小球藻細胞，小球藻藻液處理前呈現綠色，處理后呈現白色，顯微鏡鏡檢結果顯示有大量藻類細胞碎片生成。對比實驗前后水體中的化學需氧量COD可以發現，體系中溶解性有機物含量有著明顯的增多。本發明的藻類細胞破碎的方法以臭氧為媒介，通過氣-液反應，作用于藻液，在攪拌器作用下使臭氧與藻液混合均勻進而破碎藻類細胞的方法具有所需設備簡單，操作方便，破壁效果好，易于實現自動化控制等優勢，是一種有效的藻類細胞破碎方法。
圖I為本發明的藻類細胞破碎的方法的工藝流程 圖2為本發明的藻類細胞破碎的方法所用的裝置示意圖，圖中I為高壓反應釜、2為臭氧發生器、3為空壓機、11為高壓反應釜的攪拌裝置、12為高壓反應釜的排氣閥、13為高壓反應釜的壓力表。
具體實施例方式下面通過實施例并結合附圖對本發明的藻類細胞破碎的方法及其所用的裝置進一步詳細描述，但并不限于本發明。本發明所用的小球藻藻種、所用的BGll培養基，購買于中國科學院水生生物研究所。一種藻類細胞破碎的方法，其工藝流程示意圖如圖I所示，首先是藻種培養與藻液獲取，然后將收獲的藻液放入反應釜中攪拌均勻，通入按體積比即臭氧空氣為I :150的臭氧和空氣的混合氣體，加壓至O. 4 O. 8 MPa，維持I 2 s時間，打開反應釜排氣閥釋放壓力至常壓，這時過飽和的氣體從藻液中釋放出來；
重復上述的攪拌均勻，通入臭氧和空氣的混合氣體、加壓，釋壓，過飽和的氣體從藻液中釋放的過程40 80個循環，即完成了藻類細胞的破壁。本發明的各實施例中所述的藻種培養與藻液獲取，即將中國科學院水生生物研究所購買小球藻藻種按接種量為5%接種于BGll培養基中，于塞福PGX-350B智能培養箱25°C, 5000 lx，光暗比12h 12h條件下培養，待小球藻生長到穩定期時收獲藻液。本發明的各實施例中一種藻類細胞破碎的方法所用的裝置，其示意圖如圖2所示，包括高壓反應釜I、臭氧發生器2和空壓機3，臭氧發生器2和空壓機3通過管道與高壓反應釜I頂部連接，所述的高壓反應釜I帶有攪拌裝置11，進一步所述的高壓反應釜并設有排氣閥12和壓力表13。實施例I
一種藻類細胞破碎的方法，具體包括下列步驟
(1)、量取200ml收獲的藻液于I L的高壓反應釜中，在120 130 r/min條件下攪拌5 min ；
(2)、打開臭氧發生器和空壓機，將按體積比即臭氧空氣為I:150的臭氧和空氣組成的混合氣體控制總流量為2 L/min通入到高壓反應釜中，繼續以120 130 r/min勻速攪動藻液，使通入的臭氧、空氣和藻液均勻混合；
(3)、控制高壓反應釜壓力為O.6 MPa，當達到O. 6 MPa時，維持I 2 s時間，打開高壓反應釜的排氣閥使壓力降至常壓，然后再升壓至O. 6 10^，當達到0.6 Mpa時，再次打開高壓反應釜的排氣閥使壓力降至常壓，循環升壓、降壓過程40次即得到破碎的藻類細胞。收集上述所得的破碎的藻類細胞100 ml于潔凈的燒杯中，體系中溶液溫度為230C，未見明顯變化。溶解性COD含量增加275 mg/L,葉綠素a減少了 O. 3 mg/L,葉綠素b含量減少了 O. 3 mg/L,總葉綠素含量減少了 O. 6 mg/L,可萃取有機物產率為17. 6g/100g干藻。對比實施例I
目前最為常用的藻類細胞破碎的方法為超聲波破碎法，可以有效地破碎藻類細胞壁和細胞膜。利用超聲波對藻類細胞的進行破碎的方法，具體包括如下步驟
(1)、量取培養好的小球藻藻液80mL,置于200 mL燒杯之中；
(2)、將超聲頭置入小球藻藻液中部區域，并且將超聲頻率設置為20kHz，功率設置為360 W ；
(3)、打開超聲波發生器(生產廠家上海之信儀器有限公司，型號JYD-1200L)電源，設置超聲時間為30 min，即得破碎的小球藻藻類細胞。上述藻類細胞破碎完畢后，測定溶液溫度，溶解性C0D，葉綠素含量，結果表明，經過上述超聲波方法處理后，體系中溶液溫度上升至70°C，溶解性COD含量增加979 mg/L,葉綠素a增加了 3.5 mg/L，葉綠素b含量增加了 3.7 mg/L，總葉綠素含量增加了 7.2 mg/L,可萃取有機物產率為14. lg/100g干藻。通過實施例I和對比實施例I進行對比，可以看出，本發明的藻類細胞破碎的方法對細胞進行破碎后，體系的溫度基本維持恒定，而超聲破碎后體系溫度上升很高，這說明了在超聲波破碎藻類過程中有很大一部分能量轉化為熱量散失了，而本工藝過程則沒有這一問題；
進一步，本發明的藻類細胞破碎的方法對細胞進行破碎后，溶解性COD含量增加僅為275 mg/L，相對于超聲破碎減少了 654 mg/L，由此表明了藻類碎裂后有機物進入水體中，部分有機物被臭氧氧化，減少了水體溶解性化學需氧量；
進一步，本發明的藻類細胞破碎的方法對細胞進行破碎后，葉綠素a減少了 0.3 mg/L,葉綠素b含量減少了 0.3 mg/L,總葉綠素含量減少了 0.6 mg/L,而超聲破碎后，葉綠素a增加了 3.5 mg/L，葉綠素b含量增加了 3.7 mg/L，總葉綠素含量增加了 7.2 mg/L,由此表明葉綠素容易被臭氧氧化，細胞破碎后很快與臭氧反應而得到去除。進一步，本發明的藻類細胞破碎的方法對細胞進行破碎后，可萃取有機物產率為17. 6g/100g干藻,而超聲破碎后可萃取有機物產率為14. lg/100g干藻，由此表明了本工藝 過程生成的某些易萃取有機物與超聲波方法相當，具有相似的萃取效率。綜上所述，本發明的藻類細胞破碎的方法，不但可以有效地破碎藻類細胞壁和細胞膜，使細胞內含物外流，得到17. 6g/100g干藻產率，與超聲工藝14. lg/100g干藻產率相當。且某些易被氧化的葉綠素等物質可以被臭氧進一步氧化，破碎后體系中葉綠素含量下降O. 6 11^/1，而超聲工藝則上升了7.2 mg/L，因此，本發明的藻類細胞破碎的方法可以降低藻類在自然水體中腐敗氧化時所需的氧量。實施例2
一種藻類細胞破碎的方法，具體包括下列步驟
(1)、量取200ml收獲的小球藻溶液于I L的高壓反應釜中，在120 130 r/min條件下攪拌5 min ；
(2)、打開臭氧發生器和空壓機，將按體積比即臭氧空氣為I:150的臭氧和空氣組成的混合氣體控制總流量為2 L/min通入到高壓反應釜中，繼續以120 130 r/min勻速攪動藻液，使通入的臭氧、空氣和藻液均勻混合；
(3)、設定壓力為O.6 MPa，當達到O. 6 Mpa時，維持I 2 s時間，打開高壓反應釜的排氣閥使壓力降至常壓，然后再升壓至O. 6 10^，當達到0.6 Mpa時，再次打開高壓反應釜的排氣閥使壓力降至常壓，循環升壓、降壓過程80次即得到破碎的藻類細胞。收集上述所得的破碎的藻類細胞100 ml于潔凈的燒杯中，體系中溶液溫度為240C，未見明顯變化。溶解性COD含量增加243 mg/L,葉綠素a減少了 O. I mg/L,葉綠素b含量減少了 O. 2 mg/L，總葉綠素含量減少了 O. 3 mg/L,可萃取有機物產率為26. 7g/100g干藻。實施例3
一種藻類細胞破碎的方法，具體包括下列步驟
(1)、量取200ml收獲的小球藻溶液于I L的高壓反應釜中，在120 130 r/min條件下攪拌5 min ；
(2)、打開臭氧發生器和空壓機，將按體積比即臭氧空氣為I:150的臭氧和空氣組成的混合氣體控制總流量為2 L/min通入到高壓反應釜中，繼續以120 130 r/min勻速攪動藻液，使通入的臭氧、空氣和藻液均勻混合；(3)、設定壓力為O. 8 10^，當達到0.8 Mpa時，打開高壓反應釜的排氣閥使壓力降至常壓，然后再升壓至O. 8 10^，當達到0.8 Mpa時，再次打開高壓反應釜的排氣閥使壓力降至常壓，循環升壓、降壓過程80次即得到破碎的藻類細胞。收集上述所得的破碎的藻類細胞100 ml于潔凈的燒杯中，體系中溶液溫度為24°C，未見明顯變化。溶解性COD含量增加1126 mg/L，葉綠素a減少了 O. 3 mg/L，葉綠素b含量減少了 O. 4 mg/L，總葉綠素含量減少了 O. 7 mg/L,可萃取有機物產率為24. 3g/100g干藻。實施例4
一種藻類細胞破碎的方法，具體包括下列步驟
(1)、量取200ml收獲的小球藻溶液于I L的高壓反應釜中，在120 130 r/min條件 下攪拌5 min ；
(2)、打開臭氧發生器和空壓機，將按體積比即臭氧空氣為I:150的臭氧和空氣組成的混合氣體控制總流量為2 L/min通入到高壓反應釜中，繼續以120 130 r/min勻速攪動藻液，使通入的臭氧、空氣和藻液均勻混合；
(3)、設定壓力為O.4 MPa，當達到O. 4 MPa時，維持I 2 s時間，打開高壓反應釜的排氣閥使壓力降至常壓，然后再升壓至O. 4 10^，當達到0.4 MPa時，再次打開高壓反應釜的排氣閥使壓力降至常壓，循環升壓、降壓過程80次即得到破碎的藻類細胞。收集上述所得的破碎的藻類細胞100 ml于潔凈的燒杯中，體系中溶液溫度為240C，未見明顯變化。溶解性COD含量增加201 mg/L,葉綠素a減少了 O. 2 mg/L,葉綠素b含量減少了 O. 2 11^/1，總葉綠素含量減少了0.4 mg/L,可萃取有機物產率為22. 5g/100g干藻。綜上所述，本發明的一種藻類細胞破碎的方法，由于臭氧的直接或間接氧化作用作用于藻類細胞的細胞壁，通過改變細胞的通透性迫使藻類細胞壁變薄甚至裂開，并且借助壓力的反復增減，微藻經歷膨脹、擠壓的反復交替過程，進一步加速了藻類細胞的破碎。在循環次數一定的條件下控制壓力的大小及在壓力一定的條件下改變循環次數，可以快速高效滅殺水體中藻類，且可以使部分生物質溶出，以利用部分藻類生物質能源。以上所述僅是本發明的實施方式的舉例，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明技術原理的前提下，還可以做出若干改進和變型，這些改進和變型也應視為本發明的保護范圍。
權利要求
1.一種藻類細胞破碎的方法，其特征在于首先是藻種培養與藻液獲取，然后將收獲的藻液放入反應釜中攪拌均勻，通入由臭氧與空氣組成的混合氣體并攪拌均勻，加壓至.O.4 O. 8 MPa，維持I 2 s時間，打開反應釜排氣閥釋放壓力至常壓，這時過飽和的氣體從藻液中釋放出來； 重復上述的攪拌均勻，通入臭氧和空氣的混合氣體，加壓，釋壓，過飽和的氣體從藻液中釋放的過程40 80個循環，即完成了藻類細胞的破碎。
2.如權利要求I所述的一種藻類細胞破碎的方法，其特征在于臭氧和空氣混合氣體的流量控制為2 L/min。
3.如權利要求2所述的一種藻類細胞破碎的方法，其特征在于所述的臭氧和空氣組成的混合氣體，按體積比計算即臭氧空氣為I :150。
4.如權利要求3所述的一種藻類細胞破碎的方法，其特征在于反應釜中攪拌均勻即控制轉速為120 130 r/min。
5.如權利要求1、2、3或4所述的一種藻類細胞破碎的方法，其特征在于所述的藻種培養與藻液獲取，即取中國科學院水生生物研究所購買小球藻藻種按接種量為5%將小球藻藻種接種于BGl I培養基中，于塞福PGX-350B智能培養箱25°C，5000 lx，光暗比12h : 12h條件下培養，待小球藻生長到穩定期時收獲藻液。
全文摘要
本發明公開一種藻類細胞破碎的方法，即首先是藻種培養與藻液獲取，然后將收獲的藻液放入反應釜中攪拌均勻，通入按體積比臭氧空氣為1150組成的混合氣體并攪拌均勻，加壓至0.4～0.8MPa維持1～2s，打開反應釜排氣閥釋放壓力至常壓，這時過飽和的氣體從藻液中釋放出來，重復上述的攪拌均勻，通入臭氧和空氣的混合氣體，加壓，釋壓，過飽和的氣體從藻液中釋放的過程40～80個循環即完成了藻類細胞的破碎。本發明的藻類細胞的破碎方法以臭氧為媒介，通過氣-液反應，作用于藻液，在攪拌器作用下使臭氧與藻液混合均勻進而破碎藻類細胞，具有設備簡單，操作方便、破壁效果好，易于實現自動化控制等特點。
文檔編號C12R1/89GK102888346SQ201210431250
公開日2013年1月23日 申請日期2012年11月2日 優先權日2012年11月2日
發明者黃遠星, 李亮, 李洋洋, 許智華, 金小穎, 崔晨晨, 宋翠紅, 方學友 申請人:上海理工大學