專利名稱：嶗山食用牛肝菌液體菌種的培養方法
技術領域：
本發明涉及食用菌液體菌種的培養方法，特別涉及其中的產自于山東青島嶗山的嶗山食 用牛肝菌液體菌種的培養方法。
技術背景美味牛肝菌屬于擔子菌綱散菌目、牛肝菌科牛肝菌屬，據報道，美味牛肝菌含有二十種 多氨基酸，多種礦物質、維生素和多糖，具有協調內分泌、提高人體免疫機能和顯著的抗腫 瘤活性。液體培養是微生物產品大規模生產的基本方法，它可在短時間內獲得大量生物產品， 該法具有不受環境與氣候條件的限制，重復性好，工藝易于放大，而且安全性不用懷疑的優 點。由于美味牛肝菌是菌根菌，目前不能人工栽培，野生資源不能滿足人們的需要，液體發 酵培養取代子實體的體外培養是解決這一問題的有效辦法。目前，研究人員分離了一牛肝菌 菌株，研究了PDA培養基中的葡萄糖、培養基的pH、培養溫度對該菌株液體培養的影響，結 果表明，該菌株在培養基中添加60mg/ml葡萄糖、pH5. 5-6. 0培養溫度為26。C時，該菌生長 良好，多糖產量為6.7mg/ml;還采用響應曲面法對影響牛肝菌(化"^s邵.)ACCC50328產 糖與生長的工藝參數，發酵溫度、發酵時間和裝液量的最佳水平范圍進行了研究和探討，確 定了馬鈴薯培養基中添加5g/L葡萄糖、22g/L的麥芽糖、14g/L的酵母膏、0. 5g/L KH2P04、 2. 7g/L(NHj氛0.067g/LFeS04、 100 u g/L CuS(X適于該菌生長，最適生長溫度為26. 77°C, 最佳培養時間為10. 9天，裝液量為64.90ml。還有研究人員對美味牛肝菌(^^etuse由"s) 深層發酵條件及菌絲體的主要營養成分進行了研究，結果表明，最適培養基配方為葡萄糖 30. Og,玉米粉20. Og,酵母膏7. Og, KH2P04 2. Og， MgS(X. 7H20 1. 0g, VB1 0. Olg, CaCO:, 2. 0g, 最優發酵條件的初始pH5.2-5.8，振蕩速度180r/min,培養溫度27°C ，三角瓶裝液量為60ml 。 此外，適合食用菌培養的培養基和培養工藝還有很多種，中國專利00123385. 8公開了一種利 用酒精廢糟液添加了淀粉、蔗糖、酵母粉配置的培養基，通過深層發酵生產食用藥用菌種的 制備方法；中國專利01114001. l公開了一種食用菌液體菌種的培養基和培養方法。該培養基 含有土豆汁、紅塘、蛋白胨、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、硫酸鋅、VB1、瓊脂等，培養方式為含有 空氣提升管的罐體發酵培養；中國專利200410001084. 7還公開一種食用菌液體菌種深層發酵 工藝，該工藝涉及母種培養基、 一級發酵培養基和深層發酵培養基，主要成分有葡萄糖、酵 母膏、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、棉子皮粉、玉米粉、蛋白胨、麩皮、闊葉木屑、瓊脂等成分。產自于山東青島嶗山的嶗山食用牛肝菌子實體飽滿，味道鮮美，營養豐富，但受氣候季 節條件限制產量不高，需要通過發酵大量獲得菌絲體以滿足其在食品等行業的應用，但目前
己報道的培養基和培養條件對制備嶗山牛肝菌菌種及液體培養效果并不理想，因此迫切需要提供新的嶗山食用牛肝菌液體菌種的培養方法。發明內容本發明的任務在于提供一種新的嶗山牛肝菌液體菌種的培養方法，該方法能快速地進行 嶗山牛肝菌菌絲體的液體發酵培養。 其技術解決方案是-一種嶗山食用牛肝菌液體菌種的培養方法，包括步驟-a使用菌種制備培養基培養嶗山食用牛肝菌離體部分子實體制備菌種，上述的菌種制備 培養基由下述原料及重量份配制而成。 馬鈴薯 190 210 葡萄糖 18 21 松根細粉 15 25 維生素Bl 0. 0008 0. 0012瓊脂 12 18 蒸餾水 1000 pH值4. 6 5. 0 上述歩驟a中，包括步驟 ai將新鮮馬鈴薯洗凈，去皮，切成小塊，稱取；量取蒸餾水，放入大燒杯中煮沸后加 入馬鈴薯及松根細粉，小火煮沸30分鐘，然后過濾取濾液，在濾液中加入瓊脂、葡萄糖， 煮至瓊脂完全溶解,調節pH值為4.8，在12rC條件下高溫滅菌30分鐘；待滅菌完成后，取 出冷卻至5(TC，加入維生素B1母液，混勻，在超凈工作臺上倒平皿，凝固后即可使用。 上述歩驟a中，包括步驟a2取新鮮嶗山食用牛肝菌子實體，在超凈工作臺上無菌操作，用解剖刀切取子實體組織， 將子實體組織分離后迅速移植到含有菌種制備培養基的平皿上，待長出菌絲體后，轉皿擴繁。 上述歩驟a2中，包括步驟a21將嶗山食用牛肝菌子實體，用小刀小心削去柄基部泥土和表面臟物，將子實體一掰 為二，在用解剖刀切取菌柄連接處的菌蓋中心組織塊直徑3 5mm，迅速用接種針挑取移放到 平皿上，在25'C條件下培養觀察。上述嶗山食用牛肝菌液體菌種的培養方法，還包括步驟-b使用液體培養基按照液體培養方法進行菌絲體的發酵培養，上述的液體培養基由下述
馬鈴薯 190 210 葡萄糖 18 21 松根細粉 15 25 維生素Bl0. 0008 0. 0012 蒸餾水 1000 上述歩驟b中，包括歩驟-bl量取蒸餾水，放入大燒杯中煮沸后加入馬鈴薯及松根細粉，小火煮沸30分鐘，然后 過濾取濾液，在濾液中加入葡萄糖，調節pH值為4.6 5.0， 12rC條件下高溫滅菌30分 鐘；待滅菌完成后，取出冷卻至5(TC，加入維生素B1，混勻，裝/分裝在三角瓶中備用。上述歩驟b中，包括歩驟b2將在上述步驟a2中獲得已活化好的菌絲體連同培養基，切成4，2左右的菌餅，接種 于歩驟bl中瓶裝液體培養基中，在25。C、 150 300r/min回旋式搖床上振蕩培養，濾紙過濾 得濕菌絲體。本發明提供了一種嶗山食用牛肝菌菌種的培養方法,與已報道有關牛肝菌的培養方法比， 本發明提供的培養基的配方簡單，其中添加了松根粉，培養基pH也低于已報道培養基的pH， 培養溫度也較其它牛肝菌的培養溫度低，嶗山牛肝菌液體菌種在此培養條件下生長良好，獲 得的菌絲體的可溶性蛋白、糖以及游離氨基酸含量都與野生嶗山食用牛肝子實體的含量相當。
具體實施方式
實施例1-1將新鮮馬鈴薯洗凈，去皮，切成小塊，稱取；量取1000毫升蒸餾水，放入大燒杯中煮沸 后加入馬鈴薯205克，干燥的松根細粉19克，小火煮沸30分鐘，然后將用兩層紗布過濾， 在煮汁中加入瓊脂15克、葡萄糖20克，煮至瓊脂完全溶解將溶液定溶至1000毫升，鹽酸調 pH至4.8; 12rC條件下高壓滅菌30分鐘。待滅菌完成后，取出冷卻至5(TC，加入維生素Bl 母液(50mg/ml) 20微升，混勻，在超凈工作臺上倒平皿，凝固后即可使用。取夏季產于嶗山上北九水等地帶的新鮮嶗山食用牛肝菌子實體，用小刀小心削去柄基部 泥土和表面臟物，在超凈工作臺上無菌操作，將子實體一掰為二，在用解剖刀切取菌柄連接 處的菌蓋中心組織塊直徑3、 4或5mm，迅速用接種針挑取移放到含有菌種制備培養基的平皿 上，25t:條件下培養7天后，即在25。C條件下培養觀察、待長出菌絲體后，轉皿擴繁。直至 獲得已活化好的菌絲體作為菌種，將菌種連同培養基放入冷藏(凍)設備中保存備用。實施例1-2量取1000毫升蒸餾水，放入大燒杯中煮沸后加入馬鈴薯196克，干燥的松根細粉21克，
小火煮沸30分鐘，然后將用兩層紗布過濾，在煮汁中加入葡萄糖19克，定容至1000毫升， 用鹽酸調pH為5.0; 12(TC條件下高壓滅菌30分鐘。待滅菌完成后，取出冷卻至50。C，加 入維生素B1母液(50mg/ml) 20微升，混勻，裝/分裝在三角瓶中。 按上述示例說明，可制取選定用量及數量的三角瓶裝液體培養基。 將保存于冷藏(凍)設備中的菌種取出，用無菌打孔器在超凈工作臺上打取約3、 4或 5cm2的菌餅接種于30ml瓶裝液體培養基中，25。C,振蕩(250r/min)培養6天，轉接到裝有 2升液體培養基的8升三角瓶內，25"，振蕩(250r/min)培養7天，濾紙過濾得12. 7克菌 絲體，采用考馬斯亮藍R250比色法測得菌絲體中蛋白含量為0.450%，采用蒽酮比色法測得 菌絲體中可溶性多糖含量為0. 820%，采用茚三酮法測得菌絲體中游離氨基酸含量為0. 175%， 三種成分與野生嶗山牛肝菌子實體的含量相當(表1)。表i子實體和菌絲體中可溶性蛋白、糖及氨基酸含量樣品 可溶性蛋白含量(％) 可溶性糖含量(％) 氨基酸含量(％)了-實體 0.471 0.832 0.172菌絲體 0.450 0.820 0.175實施例2-1將新鮮馬鈴薯洗凈，去皮，切成小塊，稱取；量取1000毫升蒸餾水，放入大燒杯中煮沸 后加入馬鈴薯190克，干燥的松根細粉15克，小火煮沸30分鐘，然后將用兩層紗布過濾， 在煮汁中加入瓊脂12克、葡萄糖18克，煮至瓊脂完全溶解將溶液定溶至1000毫升，鹽酸調 pH至4.6; 120、 121或130'C條件下高壓滅菌30分鐘。待滅菌完成后，取出冷卻至5(TC， 加入維生素B1母液(50mg/ml) 16微升，混勻，在超凈工作臺上倒平皿，凝固后即可使用。取夏季產于嶗山上北九水等地帶的新鮮嶗山食用牛肝菌子實體，用小刀小心削去柄基部 泥土和表面臟物，在超凈工作臺上無菌操作，將子實體一掰為二，在用解剖刀切取菌柄連接 處的菌蓋中心組織塊直徑3、 4或5mm，迅速用接種針挑取移放到含有菌種制備培養基的平皿 上，25'C條件下培養7天后，即在25'C條件下培養觀察、待長出菌絲體后，轉皿擴繁。直至 獲得己活化好的菌絲體作為菌種，將菌種連同培養基放入冷藏(凍)設備中保存備用。實施例2-2量取1000毫升蒸餾水，放入大燒杯中煮沸后加入馬鈴薯190克，干燥的松根細粉15克， 小火煮沸30分鐘，然后將用兩層紗布過濾，在煮汁中加入葡萄糖18克，定容至1000毫升， 用鹽酸調pH為4.6; 120、 121或13(TC條件下高壓滅菌30分鐘。待滅菌完成后，取出冷
卻至5(TC，加入維生素B1母液(50mg/ml) 16微升，混勻，裝/分裝在三角瓶中。 按上述示例說明，可制取選定用量及數量的三角瓶裝液體培養基。 將保存于冷藏(凍)設備中的菌種取出，用無菌打孔器在超凈工作臺上打取約3、 4或 5cm2的菌餅接種于30ml瓶裝液體培養基中，25°C，振蕩(150r/min)培養5、 6、 7或8天， 轉接到裝有2升液體培養基的8升三角瓶內，25。C，振蕩(150r/min)培養7、 8或9天，濾 紙過濾得菌絲體。 實施例3-1將新鮮馬鈴薯洗凈，去皮，切成小塊，稱取；量取1000毫升蒸餾水，放入大燒杯中煮沸 后加入馬鈴薯210克，干燥的松根細粉25克，小火煮沸30分鐘，然后將用兩層紗布過濾， 在煮汁中加入瓊脂18克、葡萄糖21克，煮至瓊脂完全溶解將溶液定溶至1000毫升，鹽酸調 pH至5.0; 120、 121或130。C條件下高壓滅菌30分鐘。待滅菌完成后，取出冷卻至5(TC， 加入維生素B1母液(50mg/ml) 24微升，混勻，在超凈工作臺上倒平皿，凝固后即可使用。取夏季產于嶗山上北九水等地帶的新鮮嶗山食用牛肝菌子實體，用小刀小心削去柄基部 泥土和表面臟物，在超凈工作臺上無菌操作，將子實體一掰為二，在用解剖刀切取菌柄連接 處的菌蓋中心組織塊直徑3、 4或5mm，迅速用接種針挑取移放到含有菌種制備培養基的平皿 上，25。C條件下培養6、 7或8天后，即在25'C條件下培養觀察、待長出菌絲體后，轉皿擴 繁。直至獲得己活化好的菌絲體作為菌種，將菌種連同培養基放入冷藏(凍)設備中保存備 用。實施例3-2量取1000毫升蒸餾水，放入大燒杯中煮沸后加入馬鈴薯210克，干燥的松根細粉25克， 小火煮沸30分鐘，然后將用兩層紗布過濾，在煮汁中加入葡萄糖21克，定容至1000毫升， 用鹽酸調pH為4.8; 120。C條件下高壓滅菌30分鐘。待滅菌完成后，取出冷卻至5(TC，加 入維生素B1母液(50mg/ml) 24微升，混勻，裝/分裝在三角瓶中。按上述示例說明，可制取選定用量及數量的三角瓶裝液體培養基。將保存于冷藏(凍)設備中的菌種取出，用無菌打孔器在超凈工作臺上打取約3、 4或 5cr^的菌餅接種于30ml瓶裝液體培養基中，25。C,振蕩(300r/min)培養5、 6、 7或8天， 轉接到裝有2升液體培養基的8升三角瓶內，25。C，振蕩(300r/min)培養7、 8或9天，濾 紙過濾得菌絲體。本發明還可用于其他產地食用牛肝菌菌種的培養。
權利要求
1、一種嶗山食用牛肝菌液體菌種的培養方法，其特征在于包括步驟a使用菌種制備培養基培養嶗山食用牛肝菌離體部分子實體制備菌種，上述的菌種制備培養基由下述原料及重量份配制而成。馬鈴薯 190～210葡萄糖 18～21松根細粉 15～25維生素B1 0.0008～0.0012瓊脂 12～18蒸餾水 1000pH值4.6～5.0
2、根據權利要求l所述的嶗山食用牛肝菌液體菌種的培養方法，其特征在于所述歩驟a 中，包括歩驟al將新鮮馬鈴薯洗凈，去皮，切成小塊，稱取；量取蒸餾水，放入大燒杯中煮沸后加 入馬鈴薯及松根細粉，小火煮沸30分鐘，然后過濾取濾液，在濾液中加入瓊脂、葡萄糖， 煮至瓊脂完全溶解，調節pH值為4.6 5.0，在12(TC條件下高壓滅菌30分鐘；待滅菌完成 后，取出冷卻至5(TC，加入維生素B1母液，混勻，在超凈工作臺上倒平皿，凝固后即可使 用。
3、 根據權利要求1所述的嶗山食用牛肝菌液體菌種的培養方法，其特征在于所述歩驟a中，包括歩驟a2取新鮮嶗山食用牛肝菌子實體，在超凈工作臺上無菌操作，用解剖刀切取子實體組織， 將子實體組織分離后迅速移植到含有菌種制備培養基的平皿上，待長出菌絲體后，轉皿擴繁。
4、 根據權利要求3所述的嶗山食用牛肝菌液體菌種的培養方法，其特征在于所述步驟a2中，包括歩驟:a21將嶗山食用牛肝菌子實體，用小刀小心削去柄基部泥土和表面臟物，將子實體一掰 為二，在用解剖刀切取菌柄連接處的菌蓋中心組織塊直徑3-5rara，迅速用接種針挑取移放到 平皿上，在25'C條件下培養觀察。
5、 根據權利要求1至4任一要求所述的嶗山食用牛肝菌液體菌種的培養方法，特征在于其 還包括歩驟b使用液體培養基按照液體培養方法進行菌絲體的發酵培養，上述的液體培養基由下述 原料及重量份配制而成。馬鈴薯 190 210 葡萄糖 18 21 松根細粉 15 25 維生素Bl 0. 0008 0. 0012蒸餾水 1000
6、 根據權利要求5所述的嶗山食用牛肝菌液體菌種的培養方法，其特征在于所述步驟b中，包括歩驟bl量取蒸餾水，放入大燒杯中煮沸后加入馬鈴薯及松根細粉，小火煮沸30分鐘，然后 過濾取濾液，在濾液中加入葡萄糖，調節pH值為4.6 5.0， 12(TC條件下高壓滅菌30分 鐘；待滅菌完成后，取出冷卻至50。C，加入維生素B1，混勻，裝/分裝在三角瓶中備用。
7、 根據權利要求5所述的嶗山食用牛肝菌液體菌種的培養方法，其特征在于所述歩驟b中，包括歩驟b2將在上述步驟a2中獲得己活化好的菌絲體連同培養基，切成4，2的菌餅，接種于步 驟bl中瓶裝液體培養基中，在25。C、 150 300r/min回旋式搖床上振蕩培養，濾紙過濾得濕菌絲體。
全文摘要
本發明公開一種嶗山食用牛肝菌液體菌種的培養方法，其特征是使用馬鈴薯、葡萄糖、松根細粉、維生素B1、瓊脂、蒸餾水等原料按照一定配比配制菌種制備培養基和液體培養基，使用菌種制備培養基培養嶗山食用牛肝菌離體部分子實體制備菌種，使用液體培養基按照液體培養方法進行菌絲體的發酵培養。本發明中，所提供培養基特別適合嶗山牛肝菌的菌種制備與菌絲體的液體發酵培養，利用該培養基和培養方法，可快速進行嶗山牛肝菌菌絲體的液體發酵培養。
文檔編號C12N1/14GK101130755SQ20071001514
公開日2008年2月27日 申請日期2007年7月19日 優先權日2007年7月19日
發明者怡 韓 申請人:青島大學