水稻hpfr基因、表達產物及其應用的制作方法

專利名稱：水稻hpfr基因、表達產物及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及水稻hpfr基因、表達產物及其用途，屬農業生物技術領域，用于防治植物病蟲害、促進植物生長和提高作物產量。
背景技術：
hrp基因是植物病原細菌中決定在非寄主植物上激發過敏反應(hypersensitiveresponse，HR)和在寄主植物上致病性的基因[Lindgren P B，The role of hrp genes duringplant-bacterial interaction.Annu Rev Phytopathol，1997，35129～152]。過敏反應是植物產生的一種局部的、快速的細胞編程死亡(programmed cell death，PCD)形式。PCD可以引發一種或多種信號傳導途徑，賦予植物多種抗環境脅迫能力。
國內外對植物病原細菌的hrp基因做了較詳細的研究。Wei等人首次發現梨火疫病菌Erwinia amylovora的hrpN基因編碼的一種新蛋白質能誘導植物產生過敏反應，并將其命名為Harpin。該蛋白質的特點是富含甘氨酸和缺乏半胱氨酸，熱穩定，具有誘導植物產生過敏反應、誘導抗病和促進作物生長等生物活性[Wei Z M，Laby R J，Zumoff C H，et al.Harpin，elicitor of the hypersensitive response produced by the plant pathogen Erwinia amylovora.Science，1992.25785～88]。現已陸續從丁香假單胞菌Pseudomonas syringae和黃單胞菌Xanthomonasoryzae等多種植物病原細菌中鑒定出具有harpin活性的蛋白質。它們是由相應的植物病原細菌hrp基因簇中特定hrp基因編碼的。
聞偉剛等從水稻白葉枯病菌X.oryzae pv.oryzae中克隆了hrp基因，即hrfAXoo基因，該基因核苷酸序列大小為420bp，編碼產物harpinXoo分子量為15.6kD，該蛋白質具有harpins的功能注射煙草可以誘導植物產生過敏反應；在體外噴霧處理植物可以誘導植物產生抗性和促進作物生長等[聞偉剛，邵敏，陳功友，王金生，水稻白葉枯病蛋白質激發子誘導植物的防衛反應.農業生物技術學報，2003，11(2)192～197]。表達該蛋白質的基因工程菌株已經正在進行產業化研究與開發，相關的研究已經申請國家專利保護[專利號ZJ00135403.5]；將hrfAXoo基因轉化水稻，具有提高水稻對稻瘟病、白葉枯病的抗性[邵敏，王金生，轉hrfAXoo基因水稻對白葉枯病的抗性，南京農業大學學報2004，27(4)36-40]，相關研究已受國家專利保護[專利號ZL 02157213.5.]。因此，植物病原細菌中的hrp基因及其應用研究得較多，但植物中類似于harpin編碼基因及其應用研究至今尚未有報道。

發明內容
技術問題 本發明的目的是提供水稻中的hpfr基因、表達產物及其用途。來自于水稻的hpfr基因的表達產物，防治植物病害、促進作物生長。
技術方案本發明所提供的基因具有以下特征
1.水稻hpfr基因來源設計引物5’-GGAATTCCATATGAACTCTTTGAACACACAATTGG-3’和5’-CGGGATCCTATTACTGCATTGATGCGCTTCC-3’，用PCR方法從水稻中擴增出該片段。該基因片段命名為hpfr基因(圖1)。以hpfr基因為探針，與水稻基因組總DNA雜交，雜交結果顯示，在水稻基因組中有雜交陽性信號(圖2)。
2.水稻hpfr基因的核苷酸序列水稻hpfr基因的核苷酸序列為SEQ ID NO.1(圖3)確定該基因大小為405bp，起始密碼子處存在EcoRI酶切位點GAATTC，編碼區域富含GGT或GGC示編碼甘氨酸(glycine，G)的密碼子(陰影區)，有4個GGCGGC重復區域(方框區)。ATG示起始密碼子，TAA示終止子。
3.水稻hpfr基因編碼的推導氨基酸序列水稻hpfr基因編碼的推導氨基酸序列為SEQ IDNO.2(圖4)，根據hpfr基因的核苷酸序列推導的氨基酸序列為134個氨基酸。富含甘氨酸(陰影區)，不含半光氨酸。
4.水稻hpfr基因體外表達將水稻hpfr基因構建于蛋白質體外高效表達載體pET30a(+)形成重組質粒pETR(圖5)，產生水稻hpfr基因的體外表達產物，命名為hpfr蛋白質，其特征類似于harpinxoo的功能能夠誘導非寄主植物煙草在24小時內產生過敏反應(圖6)、親水性、對熱穩定性、對蛋白酶敏感性，經過SDS-PAGE電泳，確定該蛋白質的分子量約為14.5kD(圖7)。
5.水稻hpfr蛋白質的理化特性hpfr蛋白質經100℃水浴10min后，仍然能夠在24h內激發煙草產生過敏性反應，活性也沒有明顯的下降；用蛋白酶水解30min后則完全喪失了激發過敏反應的能力，這表明hpfr蛋白質熱穩定，但對蛋白酶敏感。
6.水稻hpfr基因的表達產物的應用水稻hpfr基因的表達產物hpfr蛋白質配制成適當濃度，在作物的不同生長季節用于作物葉面噴施，也可以用于作物移栽時浸根處理，防治植物病害、促進作物生長。
7.來源于植物的與上述水稻hpfr基因的同源序列hpfx基因，其特征在于，用水稻hpfr基因引物5’-GGAATTCCATATGAACTCTTTGAACACACAATTGG-3’和5’-CGGGATCCTATTACTGCATTGATGCGCTTCC-3’，以植物的基因組DNA為模板，用PCR方法擴增出hpfx基因，PCR擴增條件94℃/5min的1個循環，94℃/45sec+60℃/45sec+72℃/45sec的35個循環，72℃/7min的1個循環；hpfx基因編碼產物具有誘導煙草產生過敏反應反應、激發植物產生抗性和促進植物生長功能。hpfx基因所編碼的產物為hpfx蛋白質。
8、來源于小麥的與水稻hpfr基因的同源序列hpfw基因，其序列為SEQ ID NO.3，其推導的氨基酸序列為SEQ ID NO.4，hpfw基因編碼產物hpfw蛋白質具有誘導煙草產生過敏反應、激發植物產生抗性和促進植物生長功能。
有益效果本發明人將hrfAXoo基因轉化水稻[邵敏，王金生，轉hrfAXoo基因水稻對白葉枯病的抗性，南京農業大學學報，2004，27(4)36-40]，在轉基因水稻分子檢測時發現水稻中存在與hrfAXoo基因同源序列，并將其克隆和在體外表達，其表達產物具有誘導煙草產生過敏反應、激發植物產生抗性和促進植物生長等功能，在植物中發現類似于harpin編碼基因尚屬首次。
本發明為水稻中與水稻白葉枯病菌(X.oryzae pv.oryzae)的hrp基因同源序列、表達產物及其用途，來源于水稻的hrp基因同源序列表達產物與水稻黃單胞菌hrp基因的編碼產物harpinXoo有相似的功能，所以將該基因命名為hpfr(hrp-like function loci in rice)基因。該基因大小為405bp。
本發明研究發現hpfr基因在體外的表達產物與水稻黃單胞菌的hrp基因表達產物有相似的功能，即促進植物生長、誘導抗病蟲性等，本發明已從水稻中克隆了hpfr基因，并構建至表達載體中，獲得表達產物。
研究結果表明，hpfr蛋白質處理煙草有明顯誘導煙草抗TMV的能力(圖8)。將hpfr蛋白質處理的番茄、辣椒長勢明顯優于未處理(圖9)，采摘期提前1周左右hpfr蛋白質處理番茄產量比未處理提高40.3％，辣椒提高31.6％。番茄上病毒病害發生明顯減輕(圖10)。
用hpfw蛋白質噴霧處理番茄，具有促進植物生長功能(圖14)，同時，明顯減少番茄早疫病的發生；用該蛋白質噴霧處理黃瓜，對黃瓜霜霉病有較好的防治效果(表2)。
四

圖1水稻hpfr基因PCR擴增電泳2水稻hpfr基因為探針與水稻基因組總DNA雜交結果M-Marker，hplr-hplr基因陽性對照，1、2、3-水稻基因組總DNA圖3水稻hpfr基因的核苷酸序列SEQ ID NO.1圖4水稻hpfr基因推導氨基酸序列SEQ ID NO.2圖5水稻hpfr基因構建于pET30a(+)上酶切電泳6水稻hpfr蛋白質誘導煙草產生過敏反應A-BL21(DE3)/pETR的粗蛋白質抽提物，B-BL21(DE3)/pET30(a)的粗蛋白質抽提物C-H2O圖7水稻hpfr蛋白質SDS-PAGE電泳圖M-Marker，1.BL21(DE3)/pETR提取的CFEP，2.純化的水稻hpfr蛋白質圖8 BL21(DE3)/pETR表達水稻hpfr蛋白質誘導煙草抗TMV圖9水稻hpfr蛋白質葉面噴施番茄、辣椒促進生長圖10水稻hpfr蛋白質葉面噴施番茄減輕病毒病害發生圖11小麥hpfw基因的核苷酸序列為SEQ ID NO.3圖12小麥hpfw基因推導氨基酸序列SEQ ID NO.4圖13小麥hpfw蛋白質SDS-PAGE電泳14小麥hpfw蛋白質誘導煙草產生過敏反應A-BL21(DE3)/pETW的粗蛋白質抽提物，B-BL21(DE3)/pET30(a)的粗蛋白質抽提物C-H2O
圖15小麥hpfw蛋白質葉面噴施番茄促進生長五具體實施方式
實施例11.水稻hpfr基因的發現與克隆根據水稻黃單胞菌白葉枯病致病變種hrfAXoo基因開放閱讀框設計水稻hpfr基因引物5’-GGAATTCCATATGAACTCTTTGAACACACAATTGG-3’和5’-CGGGATCCTATTACTGCATTGATGCGCTTCC-3’，用PCR方法從水稻中擴增出來源于水稻中hpfr基因。PCR擴增條件94℃/5min的1個循環，94℃/45sec+60℃/45sec+72℃/45sec的35個循環，72℃/7min的1個循環。將該基因片段命名為hpfr基因(圖1)。以水稻hpfr基因為探針，與水稻基因組總DNA雜交，雜交結果顯示，在水稻基因組中有雜交陽性信號(圖2)。
2.水稻hpfr基因的體外表達PCR產物純化后經NdeI和BamHI酶切，連接于表達載體pET30a(+)上，獲得重組質粒為pETR[pET30a(+)∷hpfr](圖5)。將pETR轉化大腸桿菌BL21(DE3)，獲得重組微生物BLTR[BL21(DE3)/pET30a(+)∷hpfr]，在將重組微生物BLTR的單菌落接種20ml的LB+Km20μg/ml中37℃下振蕩培養12h，轉接于20ml的LB+Km 20μg/ml中37℃下振蕩培養3h，將1M的IPTG(TaKaRa公司)加入其中，使其終濃度為1mM，繼續培養2h。離心(5000rpm，10min)收集菌體。菌體于100℃水浴煮沸10min，冷卻后離心(12000rpm，10min)，取上清(Cell-free ElicitorProtein，CFEP)，注射煙草葉片葉肉組織細胞中，24h內產生過敏反應(圖6)。取上清液3μl進行12％SDS-PAGE電泳，根據標準蛋白質的分子量推算，水稻hpfr蛋白質的分子量約為14.5kD(圖7)。
3.實驗室小計量生產水稻hpfr蛋白質將重組微生物BLTR9的單菌落接種20ml的LB+Km20μg/ml中37℃下振蕩培養12h，轉接于5L的玉米粉發酵培養基(味精1％，酵母膏1％，玉米粉3.5％)+Km 20μg/ml中37℃下發酵培養3h，加乳糖(終濃度為10mM)誘導培養2h。離心(5000rpm，10min)收集菌體。菌體于100℃水浴煮沸10min，冷卻后離心(12000rpm，10min)，取上清，即為水稻hpfr蛋白質。1L玉米粉發酵培養基大約可以產生1.5g hpfr蛋白質。
實施例2水稻hpfr基因表達產物hpfr蛋白質的直接使用水稻hpfr基因的表達產物hpfr蛋白質按15、30、60μg/ml的濃度對植物進行葉面噴灑。
1.誘導Xanthi煙草對TMV的抗性表型將水稻hpfr和harpinXoo蛋白質的CFEP母液分別稀釋至濃度為15、30、60μg/ml，用微型噴霧器噴施成株期珊西煙，每處理5個重復；16h后，用摩擦接種活化的TMV于煙草葉片上；4天后觀測結果，并統計病斑數。研究結果表明，水稻hpfr和harpinXoo處理煙草，都有明顯誘導煙草抗TMV的能力(枯斑數目上的減少)(圖8)。經LSD法多重比較分析(F189.464)表明，BL21(DE3)/pETR和BL21(DE3)/pET30a(+)∷hrfAXoo的蛋白質抽提物處理與pET30(a)/BL21(DE3)蛋白質抽提物對照相比差異極顯著(表1)。在濃度為60uL/mL時誘導抗病性效果最顯著，水稻hpfr蛋白質的防效為96.35％，與harpinXoo防效(95.9％)相近。
2.促進植物生長，提高產量將水稻hpfr蛋白質CFEP母液稀釋至濃度為60μg/ml；在番茄、辣椒大棚，分別在苗期、花期和座果期噴施，研究結果表明，處理的番茄、辣椒長勢明顯優于未處理(圖9)，采摘期提前1周左右水稻hpfr蛋白質處理番茄產量比未處理提高40.3％，辣椒提高31.6％。番茄上病毒病害發生明顯減輕(圖10)。
表1 BL21(DE3)/DETR9表達水稻hpfr蛋白質誘導煙草抗TMV的效果

*P＜0.01水平上的差異顯著性來源于植物的與上述水稻hpfr基因的同源序列統一命名為hpfx基因，其特征在于，用實施例1水稻hpfr基因引物，以植物的基因組DNA為模板，用PCR方法(方法同實施例1)擴增出hpfx基因，其編碼產物具有誘導煙草產生過敏反應、激發植物產生抗性和促進植物生長功能。hpfx基因所編碼的產物統一命名為hpfx蛋白質。
下面實施例以小麥為例，從小麥中獲得與水稻hpfr基因同源的基因為hpfw，表達產物為hpfw蛋白質。
實施例3小麥中與水稻hpfr基因同源hpfw基因克隆與表達1.小麥hpfw基因克隆與核苷酸序列用設計引物5’-GGAATTCCATATGAACTCTTTGAACACACAATTGG-3’和5’-CGGGATCCTATTACTGCATTGATGCGCTTCC-3’，用PCR方法(方法同實施例1)從小麥中擴增與水稻hpfr基因同源基因，命名為hpfw基因。hpfw基因的核苷酸序列為SEQ ID NO.3(圖11)，大小為414bp，與水稻hpfr基因的同源性為93％。hpfw基因推導氨基酸序列為SEQ ID NO.4(圖12)。
2.小麥hpfw基因的體外表達和小計量生產hpfw蛋白質(方法同實施例1)將小麥hpfw基因連接于表達載體pET30a(+)上，獲得重組表達載體pETW9[pET30a(+)∷hpfw]，通過大腸桿菌BL21(DE3)表達的產物，命名為hpfw蛋白質。該經12％SDS-PAGE電泳，根據標準蛋白質的分子量推算，小麥hpfw蛋白質的分子量約為14.8kD(圖12)。
3.小麥hpfw蛋白質的生物活性小麥hpfw蛋白質注射煙草葉片葉肉組織細胞中，24h內激發煙草產生過敏反應(圖13)；用該蛋白質噴霧處理番茄，結果表明，該蛋白質具有促進植物生長功能(圖14)，同時，明顯減少番茄早疫病的發生；用該蛋白質噴霧處理黃瓜，對黃瓜霜霉病有較好的防治效果(表2)。
表2.小麥hpfw蛋白質對作物病害的防治效果(相對防效，％)

序列表<110>南京農業大學<120>水稻hpfr基因、表達產物及其應用<130>說明書<140>00<141>2007-02-05<160>6<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>405<212>DNA<213>Oryza sativa(水稻)<220>
<221>gene<222>(1)..(405)<223>
<400>1atgaattctt tgaacacaca attcggcggc agcacgtcca accttcaggt tggcccaagc60caggacacaa cgttcggttc gaaccagggc ggcaaccagg gcatctcgga aaagcaactg120gaccagttgc tgtgccagct catctcggcc ctgcttcagt cgagcaaaaa tgctgaggag180ggtaagggtc agggtggcga taatggcggt ggccagggcg gcaatcagca ggccgggaag240gagaatggcg cctcgccact cacccagatg ctgatgaata tcgtcggaga gattctccag300gcgcagaatg gtggtggtgc cggtggtgcc ggcggcagca gcggcggcga ctttggtggc360agtttcgcca gcagcttctc gaacgacagc gcatcaatgc agtaa405<210>2<211>134<212>PRT<213>Oryza sativa(水稻)<220>
<221>水稻hpfr基因表達的氨基酸序列<222>(1)..(134)<223>富含苷氨酸<400>2Met Asn Ser Leu Asn Thr Gln Phe Gly Gly Ser Thr Ser Asn Leu Gln1 5 10 15Val Gly Pro Ser Gln Asp Thr Thr Phe Gly Ser Asn Gln Gly Gly Asn20 25 30Gln Gly Ile Ser Glu Lys Gln Leu Asp Gln Leu Leu Cys Gln Leu Ile35 40 45Ser Ala Leu Leu Gln Ser Ser Lys Asn Ala Glu Glu Gly Lys Gly Gln50 55 60Gly Gly Asp Asn Gly Gly Gly Gln Gly Gly Asn Gln Gln Ala Gly Lys65 70 75 80Glu Asn Gly Ala Ser Pro Leu Thr Gln Met Leu Met Asn Ile Val Gly85 90 95Glu Ile Leu Gln Ala Gln Asn Gly Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly100 105 110Ser Ser Gly Gly Asp Phe Gly Gly Ser Phe Ala Ser Ser Phe Ser Asn115 120 125
Asp Ser Ala Ser Met Gln130 134<210>3<211>414<212>DNA<213>小麥(Triticum aestivum)<220>
<221>小麥hpfw基因<222>(1)..(414)<223>
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<221>小麥hpfw氨基酸<222>(1)..(137)<223>
<400>4Met Asn Ser Leu Asn Thr Gln Phe Gly Gly Ser Ala Ser Asn Phe Gln1 5 10 15Val Asp Gln Ser Gln Asn Ala Gln SerAsp Ser Ser Gln Gly Ser Asn20 25 30Gly Ser Gln Gly Ile Ser Glu Lys Gln Leu Asp Gln Leu Leu Cys Gln35 40 45Leu Ile Ser Ala Leu Leu Gln Ser Ser Lys Asn Ala Glu Glu Gly Lys50 55 60Gly Gln Gln Gly Gly Glu Asn Gly Gly Gly Gln Gly Gly Asn Gln Gln65 70 75 80Ala Gly Lys Glu Asn Gly Ala Ser Pro Leu Thr Gln Met Leu Met Asn85 90 95Ile Val Gly Glu Ile Leu Gln Ala Gln Asn Gly Gly Gly Ala Gly Gly100 105 110Ala Gly Gly Ser Ser Gly Gly Asp Phe Gly Gly Ser Phe Ala Ser Ser115 120 125Phe Ser Asn Gly SerAla Ser Met Gln130135 137<210>5<211>33<212>DNA<213>人工合成<220>
<221>水稻hpfr基因引物左序列
<222>(1)..(33)<223>
<400>5ggaattccat atgaactctt tgaacacaca att 33<210>6<211>31<212>DNA<213>人工合成<220>
<221>水稻hpfr基因引物右序列<222>(1)..(31)<223>
<400>6cgggatccta ttactgcatt gatgcgcttc c 3權利要求
1.水稻hpfr基因，其序列為SEQ ID NO.1。
2.權利要求1所述水稻hpfr基因編碼的推導氨基酸序列為SEQ ID NO.2。
3.權利要求1所述水稻hpfr基因的表達產物，命名為hpfr蛋白質，該蛋白質的分子量為14.5kDa。
4.權利要求3所述水稻hpfr基因的表達產物在防治植物病害、促進作物生長方面的應用。
5.來源于植物的與權利要求1所述水稻hpfr基因同源的序列hpfx基因，其特征在于，用水稻hpfr基因引物5’-GGAATTCCATATGAACTCTTTGAACACACAATTGG-3’和5’-CGGGATCCTATTACTGCATTGATGCGCTTCC-3’，以植物的基因組DNA為模板，用PCR方法擴增出hpfx基因，PCR擴增條件94℃/5min的1個循環，94℃/45sec+60℃/45sec+72℃/45sec的35個循環，72℃/7min的1個循環；hpfx基因編碼產物具有誘導煙草產生過敏反應、激發植物產生抗性和促進植物生長功能。
6.權利要求5所述hpfx基因所編碼的產物hpfx蛋白質。
7.根據權利要求5所述的hpfx基因，其特征在于，來源于小麥的與權利要求1所述水稻hpfr基因的同源序列hpfw基因，其序列為SEQ ID NO.3，推導的氨基酸序列為SEQ IDNO.4，小麥hpfw基因編碼產物hpfw蛋白質具有誘導煙草產生過敏反應、激發植物產生抗性和促進植物生長功能。
全文摘要
本發明涉及水稻hpfr基因、表達產物及其用途，屬農業生物技術領域，用于防治植物病蟲害、促進植物生長和提高作物產量。本發明為水稻hpfr基因，是首次從植物中發現具有類似植物病原細菌hrp基因功能的基因序列，編碼產物具有激發子的功能，在煙草上產生過敏反應、誘導植物產生抗病性、促進植物生長和提高農作物產量等，由于hpfr基因來源于植物，表達產物hpfr蛋白質通過高效表達載體與微生物發酵產生，是經濟環保的生物農藥，可以用于大田和保護地植物病蟲害防治和提高產量。本發明還提供了小麥hpfw基因，其表達產物hpfw蛋白質具有誘導煙草產生過敏反應、激發植物產生抗性和促進植物生長功能。
文檔編號C12N15/82GK101037697SQ20071002034
公開日2007年9月19日 申請日期2007年2月14日 優先權日2007年2月14日
發明者邵敏, 高學文, 黃萬春, 郭玲, 王金生 申請人:南京農業大學