專利名稱：：耐熱聚合酶的優化方法及其優化組合物和應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及生物
技術領域：
，特別涉及一種耐熱聚合酶的非基因工程手段的優化方法及其優化組合物和應用。
背景技術：
：耐熱聚合酶，由于其在熱變性時不會被鈍化，不必每次擴增反應后再補加新的聚合酶，因而極大簡化了PCR的操作過程，是PCR技術實現自動化的重要前提。隨著PCR技術本身應用范圍不斷擴大和DNA測序方法的發展，對耐熱聚合酶的需求也在增加，各種產品大量涌現。耐熱聚合酶的優化一直是科研工作者關注的熱點。經對現有技術文獻的檢索發現，目前，主要從三種途徑提高耐熱聚合酶的活性，一種是從極端環境中篩選新的天然耐高溫聚合酶，TaqDNA聚合酶是最早發現的耐熱聚合酶，之后陸續發現具有高保真的PfU聚合酶，從海洋古菌中分離的耐熱性能更高的各種聚合酶等。篩選天然的優異聚合酶是一項繁瑣的工作，得到一種優異的聚合酶不僅需要大的工作量而且還需要有好的運氣；新篩選的聚合酶的生理生化特性需要系統研究后才可以實際應用。另外一個途徑是通過基因工程的手段改造現有的聚合酶(PavlovA&etal.RecentdevelopmentsintheoptimizationofthermostableDNApolymerasesforefficientapplications.TrendsBiotechnol,2004,22(5):253-260)。基因工程改造主要是指對現有聚合酶的單個氨基酸突變或者與其它蛋白質融合表達。基于X射線晶體衍射技術和聚合酶的序列分析技術，可以對關鍵位點的氨基酸進行替換進而影響聚合酶在某些方面的特性；而利用蛋白質的融合表達技術將某些具有特殊性能的蛋白結構域連接在聚合酶的氨基或羧基端，可以使兩者融合表達成為具有新特性的聚合酶。然而這一途徑要求對DNA聚合酶的精細結構深入了解，同時融合表達的聚合酶活性不能受到影響，操作過程也比較復雜。此外，利用非基因工程手段優化現有聚合酶也是一個重要途徑。通過尋找聚合酶的優化因子或者利用不同聚合酶特性優勢互補可以提高聚合酶在某個方面的特性，例如蛋白保護劑甘油、BSA等可以提高聚合酶的穩定性，使其不易失活、不易被非特異吸附；Taq和PfU混合使用使得保真度提高時不會犧牲延伸效率。但是這些優化手段是利用聚合酶本身已有的特性進行組合或者維持，應用范圍有一定的局限性。
發明內容本發明要解決的技術問題是提供一種耐熱聚合酶的非基因工程手段的優化方法及其優化組合物，可使其類似甚至超越基因工程手段改造的聚合酶，具有操作簡便，成本低廉，應用廣泛的優點。本發明人研究發現，將納米金粒子與耐熱聚合酶混合，得到納米金和聚合酶的組合物，在適當的優化劑納米金與聚合酶的比例下，可實現對聚合酶的優化。優化的結果可表現為相應聚合酶鏈式反應(PCR)中目標DNA片段的檢測靈敏度提高、目標產物的產量增加或者反應速度加快等等多個方面。然而在進一步的研究過程中發現對于不同種類、不同來源的耐熱聚合酶，以及不同粒徑的納米金，納米金的優化用量范圍有很大差別；但同時也驚奇地發現可優化的耐熱聚合酶有著特征性的聚合酶濃度(活性單位)-PCR產量曲線，即DNA產物量隨聚合酶濃度增大變化的曲線具有先上升后下降特點，并且在大于等于該聚合酶最佳濃度的活性單位范圍內可進行優化，在該范圍內，不同活性單位的耐熱聚合酶與相同粒徑的納米金的有效優化用量有著相對恒定的比例；另一方面，眾所周知，納米金的粒徑越小，其比表面積越大，通常反應所需的用量越少，所以，不同粒徑的納米金與同種耐熱聚合酶用量之間的比例會隨著納米金的粒徑的大小變化而相應地變化。因此，本發明通過以下技術方案來解決上述技術問題一種耐熱聚合酶的優化方法，其可包括下列步驟①選擇可優化的耐熱聚合酶及其活性單位對一定體積的PCR反應，測定耐熱聚合酶不同濃度時生成DNA產物的量，選擇DNA產物量隨聚合酶濃度增大變化的曲線具有先上升后下降特點的耐熱聚合酶，并選擇大于等于該聚合酶最佳濃度的活性單位進行優化；②確定優化劑納米金的用量在步驟①所述大于等于該聚合酶最佳濃度的活性單位范圍中選擇的任一特定的聚合酶活性單位下，以同一濃度的模板進行PCR擴增，比較不同量的同種納米金處理的聚合酶對擴增結果的影響，得到具有有效優化作用的納米金的用量與耐熱聚合酶活性單位用量之間的比例；③耐熱聚合酶的優化根據實際PCR反應所需的耐熱聚合酶活性單位用量，加入步驟②中所述比例用量的納米金。根據本發明，納米金的粒徑可為l-100nm，其可以通過公知方法自制(GrabarKCetal.PreparationandcharacterizationofAucolloidmonolayers.AnalChem，1995，67:735-743)，也可以購買商品。其中，步驟①中所述DNA產物量隨聚合酶濃度增大變化的曲線通常呈鐘形，曲線頂點對應的即為聚合酶最佳濃度的活性單位，而下降段即相應地為大于聚合酶最佳濃度的活性單位。本發明選用lOnm的納米金為例，當步驟①中所述的耐熱聚合酶選擇常用的天然Taq酶或高保真Pfii聚合酶時，步驟②中粒徑10nm的納米金的終濃度與耐熱聚合酶活性單位用量之間的比例為0.16~4:1(nM:U)。具體來說，當步驟①中所述的耐熱聚合酶為天然Taq酶(如華美，即華美生物工程公司產品)時，可優化的聚合酶的活性單位^1.75U，優選在1.75U-7.5U之間，起優化作用時，步驟②中粒徑10nm的納米金的終濃度(tiM)與天然Taq酶活性單位用量(U)之間的比例《0.8:1即可，優選0.16~0.8:1，更佳的是0.320.48:1。當所述的耐熱聚合酶為上海生工生物工程公司(簡稱生工)的高保真Pfii聚合酶時，可優化的聚合酶的活性單位>1.251;,優選在1.25U-6.25U之間，起優化作用時，步驟②中粒徑10nm的納米金的終濃度與高保真Pfii聚合酶活性單位用量之間的比例《1.92即可，優選為0.96-1.92:1(nM:U)。當所述的耐熱聚合酶為北京天為時代科技有限公司(簡稱天為)的高保真Pfii聚合酶時，可優化的聚合酶的活性單位優選在1.251>6.2511之間，步驟②中粒徑10nm的納米金的終濃度與高保真Pfii聚合酶活性單位用量之間的比例優選為24:1(nM:U)。當所述的耐熱聚合酶為上海Promega公司的高保真Pfii聚合酶，可優化的聚合酶的活性單位優選在2.5U-6.25U之間，步驟②中粒徑10nm的納米金的終濃度與高保真Pfo聚合酶活性單位用量之間的比例優選為0.32~0.43:1(nM:U)。根據本發明，上述步驟(D中耐熱聚合酶和有效優化量的納米金可預混后加入PCR體系按照擴增體系需要的用量，預先混合納米金與聚合酶，混合液置于4"C保存2-24hr備用；也可采用現混法如在PCR混合液制備時，先將納米金加入PCR小管底部，再加入聚合酶，然后加入PCR其它試劑；或者先將納米金加入PCR小管底部，再加入聚合酶與其它反應試劑的預混合劑。本發明的一種優化的耐熱聚合酶組合物，包括耐熱聚合酶和有效優化量的優化劑納米金，其按上述的優化方法制得。與現有技術相比，本發明利用了納米金材料來多方面改善聚合酶的特性，如抗高鹽能力、消除聚合酶形成的彌散等，可使PCR中目標DNA片段的檢測靈敏度提高、目標產物的產量增加或者反應速度加快等等，具有操作簡便，成本低廉，應用廣泛的優點；與基因工程改造的聚合酶相比，具有類似甚至更優異的優化效果。本發明聚合酶優化方法及優化組合物適用于各種PCR反應，特別還可應用于復雜的轉基因植物檢測中；也可適用于多種聚合酶以及與PCR反應原理類似的其它聚合酶的優化，尤其適用于一些活性較低的天然聚合酶，還有一些Km值較低容易引發引物多聚體的聚合酶，提高聚合酶用量會產生副作用的聚合酶等等。對降低試劑成本、開發新產品、改進現有的生物技術等有著潛在而巨大的應用價值。圖1為本發明優化方法流程示意圖。圖2為本發明納米金與Taq聚合酶的優化比例選擇示例，其中圖2a為不同梯度拷貝數DNA作模板得到的Taq聚合酶濃度-PCR產量曲線圖；圖2b為Taq聚合酶濃度為1.75U時，納米金終濃度和聚合酶活性單位的比值、與PCR產量之間的曲線圖；圖2c為Taq聚合酶不同濃度時，納米金終濃度和聚合酶活性單位的比值、與PCR產量之間的曲線圖。圖3為本發明納米金與Taq聚合酶的優化組合物的擴增產量及靈敏度的優化效果圖。圖4為本發明納米金與Taq聚合酶的優化組合物對長片段擴增的效果圖。圖5為本發明納米金與Taq聚合酶的優化組合物在轉基因植物檢測中的PCR電泳圖。圖6為本發明納米金與Taq聚合酶的優化組合物抗高鹽能力增強的優化效果圖。圖7為本發明納米金與Taq聚合酶的優化組合物與TaKaRaEX-Taq(HS)擴增的對比圖。圖8為本發明不同濃度納米金與PfU聚合酶的優化組合物消除彌散的優化效果圖。圖9為本發明納米金與Pfii聚合酶的優化組合物在常規和快速擴增中能力提高的優化效果圖，其中圖9a為常規擴增，圖9b為快速擴增。圖10為本發明納米金與Pfo聚合酶的優化組合物與TaKaRaZ-Taq擴增對比圖。圖ii為本發明納米金與另一Pfo聚合酶的優化組合物擴增靈敏度的提高效果圖。難錢誠下面用實施例來進一步說明本發明，但本發明并不受其限制。下列實施例中耐熱聚合酶優化方法的操作流程參見圖1。實施例1使用濃度為10nM的納米金(粒徑為10nm，Sigma公司)對華美Taq聚合酶(濃度5U/uL)進行優化。首先，在總體積為25liL的PCR反應中，選擇了0.005ng-0.5ng的梯度拷貝數作模板，作聚合酶濃度(活性單位)-PCR產量曲線，曲線成鐘形，結果表明，對這個范圍的模板數，最佳聚合酶濃度為1.75U，結果見圖2a;進一步對1.75U的華美Taq聚合酶優化，納米金小于0.7wL(終濃度為0.28nM，與聚合酶活性單位比值約為0.16)效果不明顯，大于3.5"L(終濃度為1.4nM，與聚合酶活性單位比值約為0.8)會顯著抑制擴增，所以在這個范圍優選最佳納米金用量，初步確定為1.4uL(終濃度為0.56nM)，計算納米金終濃度與聚合酶活性單位的比值，為0.32，結果見圖2b;按照這個比例上下浮動一定范圍，發現對于2.5-7.5U的聚合酶，最佳比例均為0.48，且聚合酶濃度越高，優化酶擴增產量也會較大，低濃度優化聚合酶擴增結果不如高濃度聚合酶穩定，結果見圖2c。將0.35ixL華美Taq聚合酶(1.75U)與1.4uL納米金混合成1.75iiL的優化的聚合酶組合物，4'C放置2-24hr后備用。實施例2按實施例1的最佳比例0.48，將0.75uL華美Taq聚合酶(3.75U)和4.5uL納米金混合成5.25uL的優化的聚合酶組合物，《C放置2-24hr后備用。實施例3使用濃度為10nM的納米金(粒徑為10nm，Sigma公司)對上海生工生物工程公司(簡稱生工)的高保真的Pfii聚合酶(濃度5U/uL)進行優化。與實施例l相同，首先在總體積為25uL的PCR反應中，選擇了0.005ng-0.5ng的梯度拷貝數作模板，作聚合酶濃度(活性單位)-PCR產量曲線,曲線成鐘形(圖未示)，選擇聚合酶的最佳活性單位數，對于上海生工生物工程公司的高保真的Pfo聚合酶，該值為L25U;對該濃度聚合酶優化，發現36uL納米金可以較好擴增梯度稀釋的系列模板，計算納米金終濃度與聚合酶活性單位的比值為0.961.92(nM/U)。采用0.96的比例，按照0.25pL(1.25U)Pfti聚合酶加lnL無菌水的比例稀釋高保真的聚合酶，即稀釋為1U/UL備用；在PCR管的底部首先加入3uL納米金；然后在反應體系中再加入1.25uL、即1.25U的稀釋聚合酶。可以直接應用于常規PCR反應。實施例4按照實施例3中0.96的比例，在PCR管的底部首先加入4.2uL納米金;然后在反應體系中再加入1.75UL(1U/UL)稀釋的高保真的聚合酶，備用。實施例5按照實施例3中0.96的比例，在PCR管的底部首先加入6PL納米金;然后在反應體系中再加入2.5UL(1U/UL)稀釋的高保真的聚合酶，備用。實施例6按照實施例3中0.96的比例，在PCR管的底部首先加入9UL納米金;然后在反應體系中再加入3.75uL(1U/HL)稀釋的高保真的聚合酶，備用。實施例7按照實施例3中0.96的比例，在PCR管的底部首先加入15uL納米金；然后在反應體系中再加入6.25uL(1U/^L)稀釋的高保真的聚合酶，備用。實施例8使用濃度為10nM的納米金(粒徑為10nm，Sigma公司)對北京天為時代科技有限公司(簡稱天為)的高保真的Pfii聚合酶(濃度5U/UL)進行優化。與實施例l相同，首先在總體積為25uL的PCR反應中，選擇了0.005ng-0.5ng的梯度拷貝數作模板，作聚合酶濃度(活性單位)-PCR產量曲線，曲線成鐘形(圖未示)，選擇聚合酶的最佳活性單位數，對于天為的高保真的PfU聚合酶，該值為1.0U;對1.25U的聚合酶優化，發現612uL納米金可以較好擴增梯度稀釋的系列模板，計算納米金終濃度與聚合酶活性單位的比值為1.92-3.84(nM/U)，優選比例為2.88。采用2.88的比例，按照0.25liL(1.25U)PfU聚合酶加1uL無菌水的比例稀釋高保真的聚合酶，備用。在PCR管的底部首先加入9uL納米金；然后在反應體系中再加入1.25UL、即1.25U的稀釋聚合酶。可以直接應用于常規PCR反應。實施例9使用濃度為10nM的納米金(粒徑為10nm，Sigma公司)對上海Promega公司的高保真PfU聚合酶(濃度5U/UL)進行優化。與實施例l相同，首先在總體積為25uL的PCR反應中，選擇了0.005ng-0.5ng的梯度拷貝數作模板，作聚合酶濃度(活性單位)-PCR產量曲線，曲線成鐘形(圖未示)，選擇聚合酶的最佳活性單位數，對于上海Promega公司的高保真PfU聚合酶，該值為1.25U1.75U;對濃度為2.5~6.25U的聚合酶優化，發現低濃度聚合酶有利于擴增靈敏度提高，而高濃度聚合酶有利于擴增產量提高。計算納米金終濃度與聚合酶活性單位的比值，為0.32-0.43(nM/U)時有優化效果。釆用0.32~0.43的比例，按照0.75uL(3.75U)Pfo聚合酶加3uL無菌水的比例稀釋高保真的聚合酶，備用。在PCR管的底部首先加入34uL納米金；然后在反應體系中再加入3.75uL，即3.75U的稀釋聚合酶。可以直接應用于常規PCR反應。該比例優化的上海Promega公司的高保真Pfb聚合酶組合物與使用同樣濃度的聚合酶的擴增對照相比，擴增靈敏度可以提高。試驗實施例1本發明納米金-Taq聚合酶優化組合物擴增產量及靈敏度的提高對一些天然聚合酶，納米金可以有效提高其擴增靈敏度及擴增產量，以華美的TaqDNA聚合酶為例，包括下列步驟<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>其中，擴增片段長度為309bp;不加納米金的聚合酶對照選擇L75U，因為實驗證明這是聚合酶的最適濃度。3、利用PCR技術對模板分子進行擴增，擴增條件為:94。C預熱5分鐘;50個循環，分三步第一步10個循環，每個循環包括94。C變性30秒，57'C退火1分鐘，72-C延伸1分鐘；第二步14個循環，每個循環包括94°C變性30秒，57X:降落至52-C退火l分鐘，72。C延伸l分鐘；第三步26個循環，94°。變性30秒，52。C退火30秒，72。C延伸30秒，最后72。C延伸5分鐘。4、對擴增后的DNA樣品進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。擴增結果如圖3所示。泳道1和10:分子量標記(Takara公司DL2000，分別為2000bp，1000bp，750bp,500bp，250bp和100bp);2-9:質粒模板數分別為108，107，106，105,104，103,102，5X10'個DNA分子，為對比例l;11-18:模板拷貝數同2-9，使用了本發明實施例2的納米金-Taq聚合酶優化組合物。可以看出優化后，梯度擴增體系的靈敏度可以達到50個DNA分子，而對比例1的擴增體系，只可以擴增到1()S個DNA分子；顯然對于1()S10S個DNA分子，本發明優化聚合酶組合物的PCR產量更高。該PCR擴增結果顯示了本發明對提高有些天然聚合酶擴增靈敏度和擴增產量效果顯著。試驗實施例2本發明納米金-Taq聚合酶優化組合物對長片段的擴增作用1、模板稀釋方法、PCR體系組成同試驗實施例1;2、從實施例1稀釋的質粒模板擴增長度為4K的長片段；3、利用PCR技術對模板分子進行擴增，94'C預熱5分鐘，30個循環，94。C變性30秒，55。C退火1分鐘，72。C延伸3分鐘，最后72。C延伸10分鐘。4、對擴增后的DNA樣品進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。結果見圖4。從左至右依次1為分子量標記AyHindIII(華美生物工程公司，DNA片段由上至下為23，130bp、9，416bp、6，557bp、4，361bp、2，322bp、2,027bp、56牝p以及125bp);2-6模板拷貝數分別是109-105個DNA分子，為對比例l擴增的結果；7-11模板拷貝數與2-6相同，為本發明優化的聚合酶組合物擴增的結果。以上反應條件相同，可以看出2-6，沒有擴增產物，7-11中，擴增至9泳道，靈敏度達到了1(^個DNA分子。該PCR擴增結果顯示了本發明得到的優化聚合酶組合物適宜擴增不同長度的DNA片段。實驗實施例3本發明納米金-Taq聚合酶優化組合物在轉基因植物檢測中的應用1、PCR體系組成同試驗實施例1;2、對轉基因大豆進行倍比稀釋，得到一系列拷貝數的模板，最低稀釋到3個拷貝"L;擴增片段長度為360bp;3、利用PCR技術對模板分子進行擴增，94"C預熱10分鐘，44個循環，94。C變性40秒，58。C退火40秒，72。C延伸40秒，最后72。C延伸7分鐘。4、對擴增后的DNA樣品進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。結果見圖5。泳道6:分子量標記(DL2000);1-5:為對比例1，質粒模板數分別為104，103，102，101,3X10G個DNA分子；7-11:模板拷貝數同l-5，采用本發明納米金-Taq聚合酶優化組合物。可以看出本發明納米金-Taq聚合酶優化組合物不僅適用于擴增簡單體系的片段，對復雜植物基因組擴增一樣有增效作用。該PCR擴增結果顯示了本發明的納米金-聚合酶優化組合物具有廣泛地應用領域。試驗實施例4本發明納米金-Taq聚合酶優化組合物抗高鹽能力提高濃度可以增加聚合酶的抗高鹽能力，但是聚合酶的濃度提高后，會引起很多副反應，本發明通過納米金優化，可以使廉價的天然聚合酶抗高鹽能力提高，具體步驟如下1、對AAV(腺伴隨病毒，本元正陽基因技術有限公司)進行倍比稀釋，添加一定濃度的20XPBS(上海生工生物工程有限公司)幫助病毒顆粒分散，稀釋模板體系的PBS終濃度分別是0.2X,0.4X，0.6X,0.8X，l.OX，AAV的拷貝數為107vg/uL;2、制備PCR體系，組成如下表，使用濃度遞增的PBS作為高鹽環境；table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>擴增片段長度為287bp。3、利用PCR技術分別對模板分子進行擴增，擴增條件同試驗實施例1，只是第二步退火時降落PCR的溫度從60'C到55°C。4、對擴增后的DNA樣品進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。擴增結果如圖6所示。1-11泳道是對比例2-3的TaKaRaEXTaqDNA聚合酶(HS)的擴增結果，其中1-5:對比例2;7-11:對比例3;6，12，23是分子量標記(DL2000);13-28是華美TaqDNA聚合酶的擴增結果，其中13-17:對比例1;18-22:本發明實施例1;24-28:本發明實施例2。每種聚合酶從左至右依次在5種PBS終濃度(0.08X,0.16X，0.24X,0.32X,0.40X)下進行擴增。從圖中可以看出，基因工程改造過的TaKaRaEXTaqDNA聚合酶(HS)，1.25U的體系(1-5泳道)在0.32X的PBS中已經不能擴增；增加聚合酶至2.5U的體系(7-11泳道)在0.4X的PBS中擴增很弱；未加納米金的華美聚合酶體系(13-17)均無擴增，而本發明實施例1的優化酶組合物(18-22泳道)在0.4X的高濃度下也可以擴增；本發明實施例2的優化酶組合物(24-28)在0.4X高鹽濃度下可以很好擴增。該PCR擴增結果顯示本發明納米金-聚合酶優化組合物在增加擴增靈敏度的同時抵抗抑制劑的能力也有提高。試驗實施例5本發明納米金-Taq聚合酶優化組合物與TaKaRaEX-Taq(HS)擴增短片段的對比1、質粒模板稀釋如試驗實施例l;2、擴增體系組成如試驗實施例4中的實施例1，以及對比例2采用1.25U的TaKaRaEX-T叫(HS)作擴增靈敏度對照；擴增片段長度如試驗實施例lo3、利用PCR技術對模板分子進行擴增，擴增條件為94'C預熱5分鐘;40個循環，每個循環包括94。C變性30秒，52。C退火30秒，72*€延伸30秒；最后72'C延伸5分鐘。4、對擴增后的DNA樣品進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。結果見圖7。本發明實施例l和對比例2擴增梯度稀釋的質粒模板，拷貝數是10M01，其中1-8是對比例2的EX-Taq(HS)擴增的結果，10-17使用了本發明實施例1的納米金-聚合酶優化組合物；9，18是分子量標記(DL2000)。可以看出本發明(10-17)的擴增與對比例2(1-8)的擴增相比，靈敏度接近，產量略低。說明納米金具有改善天然聚合酶活性，達到類似基因工程改造的效果。試驗實施例6本發明不同濃度的納米金-Pfb聚合酶優化組合物對聚合酶形成彌散的消除Km值較低的聚合酶(特別是校讀功能的聚合酶)不能有效的結合到引物的3'端，可使引物形成一種特殊結構(primerartifact)。這種結構含有單鏈和雙鏈的區域，形成引物單鏈或雙鏈的多聚體，很難遷移出點樣孔，或自上樣孔形成模糊條帶(FAQsforPolymerase.NewEnglandBiolabs.www.neb.com/nebecomn)。上海生工生物工程公司的高保真的Pfii聚合酶就屬于這種類型。試驗步驟如下1、以0.05ng的稀釋質粒為模板，擴增片段長度如試驗實施例1;2、制備PCR反應混合液，組成如下表:<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>采用實施例3-7中現混合法制備的本發明納米金-Pfo聚合酶優化組合物作為試驗組，對照組中加相應體積的水代替納米金，PfU聚合酶用量同試驗組。3、將lwL模板加在PCR管的側壁；4、加入PCR混合液，將側壁模板帶入擴增體系；5、利用PCR技術分別對模板分子進行擴增，擴增條件為94。C預熱5分鐘；30個循環，每個循環包括94'C變性30秒，52X:退火30秒，72'C延伸50秒；最后72'C延伸5分鐘。6、對擴增后的DNA樣品進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。擴增結果如圖8所示。本發明實施例3-7和對比例4-8擴增0.05ng的質粒模板，泳道1-5:對比例4-8的擴增結果；泳道7-11:本發明實施例3-7的優化酶組合物的擴增結果；6為分子量標記(DL2000)。從圖中可以看出，對照組聚合酶彌散，出現非特異雜帶，擴增很弱或沒有；而本發明各種濃度的聚合酶優化組合物都可以很好擴增，聚合酶彌散可以被消除，沒有非特異雜帶出現，而且高濃度聚合酶擴增產量也更高。試驗實施例7本發明納米金-Pfo聚合酶優化組合物在常規和快速擴增試驗中擴增靈敏度的提高對于試驗實施例6中低Km值的聚合酶，要消除其自點樣孔形成的模糊條帶，可以通過使用納米金-Pfii聚合酶優化組合物或者縮短反應時間來實現，但是通常高保真聚合酶的延伸速度比較慢，縮短反應時間勢必會影響DNA合成。本發明優化組合物不但可以在常規擴增速度下表現優越特性，而且還可以大大增加PfU聚合酶在快速反應中的聚合能力。1、對質粒模板稀釋如試驗實施例l，擴增片段長度為886bp;2、PCR體系制備<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>3、利用PCR技術分別對模板分子進行擴增，擴增條件為95t:預熱5分鐘;44個循環，常規擴增時每個循環包括94-C變性30秒，52。C退火30秒，72-C延伸50秒；最后72'C延伸5分鐘；快速擴增時采用兩溫循環，每個循環包括98'C變性5秒，68。C退火15秒；最后72。C延伸2分鐘。4、對擴增后的DNA樣品進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。常規擴增結果如圖9a所示，本發明對照組和試驗組均擴增梯度稀釋的質粒模板，模板拷貝數依次為108，107，106，105，104，103,102，5X101個。泳道l-8:對比例4;9:分子量標記(DL2000);10-17:試驗組，模板拷貝數同l-8，實施例3的優化酶組合物的擴增結果；18為陰性對照。從圖9a中可以看出，未加納米金優化的聚合酶只有108有擴增，而且出現自點樣孔的模糊條帶；而本發明加入納米金優化的聚合酶，不但引物形成的彌散被消除了，而且擴增靈敏度可以達到1(^個DNA分子。該PCR擴增結果顯示了本發明優化的聚合酶組合物對低Km值的聚合酶的優化效果顯著。快速擴增結果如圖9b所示，電泳上樣順序如圖9a。從圖中可以看出，對照組未加納米金優化的聚合酶只有108，107有擴增條帶，而本發明加入納米金優化的聚合酶組合物，可以在15秒完成正常延伸，保證聚合酶的靈敏度達到102個DNA分子。通常Pfli由于具有3'-5'的外切酶功能，延伸速度比較慢，每分鐘大約600bp，擴增900bp的片段約需90秒，本發明選擇886bp的片段來說明。該PCR擴增結果顯示了本發明優化組合物對提高有些高保真聚合酶的快速擴增能力優化效果顯著。試驗實施例8本發明納米金-PfU聚合酶優化組合物與TaKaRaZ-Taq擴增對比TaKaRa公司的Z-Taq聚合酶是目前市場上公認的具有快速擴增能力的聚合酶，以其作對照，考察本發明納米金-Pfii聚合酶優化組合物的快速擴增特性。1、對質粒模板稀釋如試驗實施例1;2、PCR體系制備，試驗組如試驗實施例7，只是對照組中聚合酶使用0.625U的Z-Taq而非天然PfU聚合酶；3、利用PCR技術對模板分子進行擴增，擴增條件為:95"C預熱2分鐘;44個循環，每個循環包括98t:變性5秒，66-C退火2秒；最后72i:延伸2分鐘。4、對擴增后的DNA樣品進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。結果見圖10。泳道9是分子量標記(DL2000);左側為Z-Taq擴增結果，泳道l-7:10M(^個模板分子，8是陰性對照；右側為本發明實施例3納米金-PfU聚合酶優化組合物擴增結果，10-16:10、1(^個模板分子，17是陰性對照。可以看出本發明優化的PfU聚合酶具有與Z-Taq相同的靈敏度，而且沒有自點樣孔的模糊條帶。該結果顯示了本發明納米金優化的聚合酶在快速反應中也可能達到類似基因工程改造的聚合酶的擴增效果。試驗實施例9本發明天為納米金-Pfii聚合酶優化組合物擴增產量及靈敏度的提高1、對質粒模板稀釋、擴增片段長度同試驗實施例1。2、擴增程序同試驗實施例6。3、PCR體系制備同試驗實施例7，只是采用天為自帶的緩沖液，對照組中聚合酶使用1.25U的天為Pfii聚合酶；試驗組酶為實施例8。4、對擴增后的DNA樣品進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。擴增結果如圖ll所示。泳道7:分子量標記DL2000;1-6:對照組，質粒模板數分別為109,108,107，106，105，1()4個DNA分子；8-13:模板拷貝數同1-6，使用了本發明實施例8的納米金-Pfil聚合酶優化組合物；14:陰性對照。可以看出優化后，梯度擴增體系的靈敏度顯著提高了兩個數量級。試驗實施例10本發明上海Promega納米金-Pfli聚合酶優化組合物擴增靈敏度的提高1、對質粒模板稀釋、擴增片段長度同試驗實施例1。2、擴增程序同試驗實施例6。3、PCR體系制備同試驗實施例7，只是采用Promega自帶的緩沖液，對照組聚合酶使用3.75U的Promega的Pfb聚合酶；試驗組酶為實施例9。擴增結果表明(圖未示),使用3.75U的Promega的Pfii聚合酶擴增0.005ng質粒，擴增條帶很弱，加入納米金濃度小于L2nM時，增效不顯著，加入1.2-1.6iiM納米金時，高濃度的Pfo也能用于擴增低拷貝模板。權利要求1.一種耐熱聚合酶的優化方法，其包括下列步驟①選擇可優化的耐熱聚合酶及其活性單位對一定體積的PCR反應，測定耐熱聚合酶不同濃度時生成DNA產物的量，選擇DNA產物量隨聚合酶濃度增大變化的曲線具有先上升后下降特點的耐熱聚合酶，并選擇大于等于該聚合酶最佳濃度的活性單位進行優化；②確定優化劑納米金的用量在步驟①所述大于等于該聚合酶最佳濃度的活性單位范圍中選擇的任一特定的聚合酶活性單位下，以同一濃度的模板進行PCR擴增，比較不同量的同種納米金處理的聚合酶對擴增結果的影響，得到具有有效優化作用的納米金的用量與耐熱聚合酶活性單位用量之間的比例；③耐熱聚合酶的優化根據實際PCR反應所需的耐熱聚合酶活性單位用量，加入步驟②中所述比例用量的納米金。2、如權利要求1所述的優化方法，其特征在于步驟①中所述DNA產物量隨聚合酶濃度增大變化的曲線呈鐘形。3、如權利要求2所述的優化方法，其特征在于步驟①所述的耐熱聚合酶為天然Taq酶或高保真PfU聚合酶，步驟②中粒徑10nm的納米金的終濃度與耐熱聚合酶活性單位用量之間的比例為0.16~4:1(iiM:U)。4、如權利要求3所述的優化方法，其特征在于步驟①所述的耐熱聚合酶為天然Taq酶，步驟②中粒徑10nm的納米金的終濃度與天然Taq酶活性單位用量之間的比例為0.32-0.48:1(nM:U)。5、如權利要求3所述的優化方法，其特征在于步驟①所述的耐熱聚合酶為上海生工生物工程公司的高保真PfU聚合酶，步驟②中粒徑lOrnn的納米金的終濃度與高保真Pfo聚合酶活性單位用量之間的比例為0.96-1.92:1(nM:U)。6、如權利要求3所述的優化方法，其特征在于步驟①所述的耐熱聚合酶為北京天為時代科技有限公司的高保真PfU聚合酶，步驟②中粒徑10nm的納米金的終濃度與高保真PfU聚合酶活性單位用量之間的比例為2~4:1(nM:U)。7、如權利要求3所述的優化方法，其特征在于步驟①所述的耐熱聚合酶為上海Promega公司的高保真Pfo聚合酶，步驟②中粒徑10nm的納米金的終濃度與高保真Pfii聚合酶活性單位用量之間的比例為0.32~0.43:1(nM:U)。8、一種優化的耐熱聚合酶組合物，其包括如權利要求1~7任一項所述的優化方法制得的耐熱聚合酶和優化劑納米金。9、如權利要求8所述的優化的耐熱聚合酶組合物在PCR反應中的應用。10、如權利要求9所述的應用，其特征在于所述的PCR反應為轉基因植物檢測反應。全文摘要本發明公開了一種耐熱聚合酶的優化方法，其包括下列步驟①可優化的耐熱聚合酶及其活性單位根據DNA產物量隨聚合酶濃度增大變化的曲線來選擇；②確定優化劑納米金的用量得到具有有效優化作用的納米金的用量與耐熱聚合酶活性單位用量之間的比例；③耐熱聚合酶的優化根據步驟②比例來混合耐熱聚合酶及納米金。本發明還提供了由該方法制得的一種優化的耐熱聚合酶組合物。本發明通過非基因工程手段優化現有聚合酶，使其類似甚至超越基因工程手段改造的聚合酶，具有同時提高聚合酶多種特性、優化方式簡便、成本低廉的優點，可應用于各種PCR反應，特別是復雜的轉基因植物檢測反應。文檔編號C12Q1/25GK101240265SQ20071001979公開日2008年8月13日申請日期2007年2月9日優先權日2007年2月9日發明者張曉東,楊文超,樊春海,溫燕勤,米麗娟,鈞胡申請人:蘇州市長三角系統生物交叉科學研究院有限公司