專利名稱：重組雞痘病毒疫苗rFPV－1218AIH9及其構建方法、用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種重組雞痘病毒疫苗，特別是一種用雞痘病毒新鑒定的復制非必需區構建表達H9亞型禽流感病毒血凝素基因的重組雞痘病毒疫苗。
背景技術：
雞痘病毒(Fowlpox Virus，FPV)為痘病毒科、禽痘病毒屬的成員，是迄今發現的動物病毒中最大的一種病毒。最獨特的性質是它們在感染細胞的胞漿復制，而不在細胞核內。成熟的病毒粒子為磚型，大小為250×350nm，FPV的基因組為雙股線性DNA，大小約300kb，分子量約為2～4×105KD，G+C含量達35％，且其DNA不具有感染性。通過重組DNA技術，以FPV為載體研制禽類基因工程重組活病毒疫苗，或哺乳動物非復制型重組活病毒載體疫苗受到越來越多研究者的重視。FPV載體與已報道的病毒載體如痘苗病毒、乳頭狀瘤病毒、腺病毒、細小病毒、馬立克氏病病毒、煙草花葉病毒等相比具有明顯的優勢。FPV自然條件下只感染禽類，但能在哺乳動物細胞產生頓挫性感染，雖不產生有感染性的子代病毒粒子，卻能自動合成加工外源抗原并提呈到細胞表面，刺激機體產生免疫應答反應。
已有多種類型的具有生物活性的蛋白質在重組雞痘病毒(recombinantfowlpox virus，rFPV)中得到表達。如禽流感病毒(AIV)的血凝素基因(HA)、新城疫病毒(NDV)的融合蛋白(F)和血凝素-神經氨酸酶(HN)基因、馬立克氏病病毒(MDV)的gB基因、傳染性法氏囊病病毒(IBDV)的VP2基因、狂犬病病毒糖蛋白和麻疹病毒融合蛋白基因等，以表達外源基因的rFPV進行免疫，在SPF雞或無母源抗體的商品雞均可提供特異性的免疫保護，因此，FPV載體不僅可以用作家禽的疫苗，而且可以用作哺乳動物的疫苗。
現有技術中，FPV疫苗在商品禽中已使用了70多年，此疫苗可引起輕微的、自限性局部感染。同時，FPV宿主范圍較窄，僅感染禽，因此是相對比較安全的疫苗病毒。
雞痘病毒載體已經研究了近二十年，但能應用于臨床的重組病毒寥寥無幾，原因何在？一個主要原因就是母源抗體的干擾。商品雞的母源抗體也很高，其中針對H9N2亞型AIV的母源抗體高達27-28，H5N1亞型AIV的母源抗體也達到了25-26，這就給商品雞疫苗的使用和疫情的監測帶來不便。
Taylor等發現，在有較高ND母源抗體的試驗雞上，共表達NDV F和HN基因的重組FPV的抵抗NDV強毒攻擊的免疫保護率較在SPF雞上有所下降。因此，針對外源基因的抗體干擾了重組FPV的免疫。本室共構建的9個表達HPAIV基因的重組FPV無論是否能夠誘導HI抗體，在SPF雞上均能抵抗強毒AIV的攻擊，免疫保護率均為100％，構建的3個共表達HPAIV和MPAIV HA基因的重組苗在SPF雞上均能抑制MPAIV的排出，免疫效力與油苗相當。而在帶有高水平AIV母源抗體的商品雞上，保護率均有不同程度的下降。表明針對外源蛋白的母源抗體對重組FPV的免疫效力確實存在一定的影響。另有構建的NDV的主要保護性抗原的重組病毒疫苗進行的商品雞試驗試驗結果也表明，重組FPV的免疫效力因存在針對NDV或AIV的母源抗體而受到很大的影響(丁煒東，曹麗萍，張體銀等.表達新城疫病毒F和HN基因重組雞痘病毒疫苗的遺傳穩定性和免疫效力試驗.中國獸醫雜志，2005，4110-14.韋棟平，劉玉良，邵衛星等.共表達新城疫F基因和H9亞型禽流感病毒HA基因的重組雞痘病毒.微生物學報，2004，4414-18.)。
為了獲得理想的重組病毒首先得進行病毒復制非必需區的克隆與篩選，外源基因只有插入到病毒基因的復制非必需區才有可能實現蛋白產物的表達，而且載體表達外源基因直接受其在載體中插入位點的制約，因此非必需區的獲得是構建重組病毒的先決條件。病毒復制非必需區又有嚴格的非必需區及一般非必需區之分，在構建重組病毒時必須選擇嚴格的復制非必需區，才能維持親本株的復制能力及保證重組病毒的免疫效力。
研究發現，以前構建的插入載體p11S的復制非必需區FPV7S正好處于開放性閱讀框架上，可能破壞了IL-18結合蛋白基因。目前已有學者發現，經細胞表達的IL-18結合蛋白能夠抑制機體IL-18依賴性IFN-γ的產生。據實驗證實，IL-18是IL-1家族中具有多種功能的致炎癥細胞因子，其能夠誘導機體產生IFN-γ、Th-1型免疫應答并激活NK細胞的活性，這對小鼠誘導產生有效抗VV感染的免疫應答起到重要的作用。而IL-18結合蛋白可能具有對抗機體炎癥反應的功能，對病毒在宿主體內的繁殖與擴散是有利的為了解決這一缺陷，孫蕾，劉武杰，陳素娟等重新篩選了雞痘病毒嚴格的復制非必需區FPV12-18，構建了新的插入載體p12-18，該載體于2005年6月6日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC NO1385，長度為10450bp。
發明內容
本發明的第一個目的是為了克服現有載體的不足，能增加重組雞痘病毒基因工程疫苗在商品雞群使用的實用性，同時保持和增強重組雞痘病毒的免疫原性及外源插入基因的表達產物的免疫原性，可使用新的雞痘病毒表達載體表達外源基因，使得重組雞痘病毒活疫苗早日商品化，提供一種能在母源抗體陽性的商品雞群使用的重組雞痘病毒基因工程疫苗。
本發明重組雞痘病毒疫苗rFPV-1218AIH9為含表達H9亞型禽流感血凝素基因的重組雞痘病毒疫苗，保藏號為CGMCC 1913。
本發明的重組雞痘病毒中的外源基因為H9亞型禽流感病毒的血凝素基因，不受母源抗體干擾，能增加重組雞痘病毒基因工程疫苗在商品雞群使用的實用性，同時保持和增強重組雞痘病毒的免疫原性及外源插入基因的表達產物的免疫原性，使得重組雞痘病毒活疫苗早日應用于臨床。
本發明的第二個目的是提供一種重組雞痘病毒疫苗rFPV-1218AIH9的構建方法包括以下步驟(1)獲得含H9亞型AIV HA基因整個閱讀框架的基因；(2)將上述基因置于合適啟動子下游，插入到含FPV復制非必需片段FPV12-18和報告基因(LacZ)的插入載體中構建成轉移載體p1218AIH9，長度為11800bp；(3)用轉移載體p1218AIH9轉染已感染wt-FPV的雞胚成纖維細胞(CEF)，通過同源重組獲得表達H9亞型AIV HA基因的rFPV；(4)增殖和收獲表達H9亞型AIV HA基因的rFPV，得到重組雞痘病毒疫苗rFPV-1218AIH9。
該疫苗rFPV-1218AIH9，該載體于2007年1月12日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC 1913。
通過以上方法能得到不受母源抗體干擾的重組雞痘病毒活疫苗，其方法科學、可靠性強，獲得的疫苗穩定性好，純度高。
上述步驟(1)中H9亞型AIV HA基因可以通過以下方法獲得用9-10日齡SPF雞胚擴增病毒，收集尿囊液，酚-SDS法抽提病毒基因組的RNA，根據已發表的H9亞型AIV HA基因序列設計一對引物PH9A1 5’-GCTGGATCCGCCACCATGGAAACAATATCACTAATAGCT-3’PH9A2 5’-GTCGGATCCAAGCTTACAAAAAGCCAATTATATACAAATCTTGC-3’先反轉錄合成cDNA，然后PCR擴增出H9亞型AIV HA基因整個閱讀框架。可將H9亞型AIV HA基因連接到T-載體，測序證明所得的基因序列的正確性。
步驟(2)中啟動子可以是任何能夠在重組雞痘病毒(rFPV)感染細胞中指導基因轉錄的FPV啟動子、痘苗病毒啟動子或人工合成啟動子。
步驟(2)中啟動子和上述基因通過酶切加接的方法或用PCR設計引物加接的方法連接在一起，按常規方法將其插入到含FPV復制非必須片段FPV12-18和報告基因LacZ的FPV插入載體中，在將此連接產物轉化到適當的宿主細胞中，按常規方法純化并分析重組體，得到轉移載體p1218AIH9。可通過堿裂解方法制備轉移載體的質粒DNA并以PEG純化質粒DNA。
轉移載體p1218AIH9的構建方法是將質粒pTH9A用HindIII酶切經klenow酶補平，酚氯仿抽提回收線型質粒DNA，再用BamHI酶切電泳回收1.7kb片段，分別與用SmaI和BamHI酶切的載體質粒p12-18連接。
步驟(3)中用GeneJammerTM轉染試劑將轉移載體分別與wt-FPV共轉染雞胚成纖維細胞(CEF)，將上清稀釋液接種長成致密單層的CEF，待出現單個典型蝕斑后，用含有X-gal的營養瓊脂覆蓋，藍斑篩選純化得重組病毒rFPV-p1218AIH9。rFPV中外源基因的插入和表達，可通過核酸雜交、PCR擴增外源基因、重組病毒與特異性抗體結合的反應性及所表達外源基因產物的生物學特性等方法予以鑒定。
步驟(4)中，將表達H9亞型AIV HA基因的rFPV在CEF單層上增殖，使病毒在CEF中大量擴增。長成完全病變后收獲，分別吸取0.1ml病毒液，以細胞培養液作連續10倍稀釋，取10-4、10-5、10-6三個稀釋度的病毒液接種生長于24孔細胞培養板內的形成致密單層的CEF，每個稀釋度接種4孔，每孔接種0.1ml病毒液。37℃培養72h，然后觀察病變，計算接種每一稀釋度病毒液的CEF上形成的蝕斑數目，根據計數結果計算病毒原液中含有的病毒蝕斑形成單位(PFU)。接種實驗用動物。
本發明的第三個目的是提供重組雞痘病毒疫苗rFPV-1218AIH9的用途，用于防治H9亞型禽流感病毒。雞皮下注射，注射量為104～106PFU/只。
本方法臨床操作，副作用小，不影響流行病學疫情監測。
圖1為H9亞型AIV HA基因的PCR擴增產物電泳圖譜。
圖中，Fig1H9A gene amplified by PCR；M200bp DNA ladder maker；1F株H9A基因PCR產物。
圖2為重組質粒p1218AIH9的酶切鑒定電泳圖譜。
圖中，MDNA Maker III；1EcoRI消化p1218AIH9。
圖3為構建含H9亞型AIV HA基因的轉移載體p1218AIH9的示意圖。
圖4為純化重組病毒感染CEF后形成的蘭色空斑照片。
圖5為重組病毒感染CEF后表達外源蛋白質的熒光圖。
圖6為H9亞型禽流感病毒HA基因的序列。
具體實施例方式
以下將結合實施例子與附圖具體說明，但是下例實施例子是在進一步解釋而不是限制本發明。
本實施例中涉及雞痘病毒表達載體p12-18，于2005年6月6日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC NO1385，其長度為10450bp。
步驟一H9亞型AIV HA基因的擴增、克隆及序列分析根據已知的H9亞型AIV HA的序列，設計H9N2亞型AIV HA基因的PCR擴增引物。引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。
H9A基因的擴增引物上游引物PH9A1的5’端引入BamH I位點和Kozak序列；下游引物PH9A2的5’端引入BamHI、HindIII位點外，還引入了痘病毒基因組早期基因的轉錄終止信號。上、下游引物跨幅約為1.7kb，覆蓋整個H9A基因編碼框。
PH9A1 5’-GCTGGATCCGCCACCATGGAAACAATATCACTAATAGCT-3’PH9A2 5’-GTCGGATCCAAGCTTACAAAAAGCCAATTATATACAAATCTTGC-3’以質粒pTH9A為模板，用PH9A1和PH9A2引物和Expand High FidelityPCR system對H9A基因進行PCR擴增，使H9A基因翻譯起始區前連接一段Kozak序列，終止密碼子后連接痘病毒早期轉錄終止信號T5NT。PCR循環參數94℃預變性5min；94℃變性1min，58℃退火1min，72℃延伸2min，一共進行30個循環；循環結束后72℃再延伸10min。PCR產物通過電泳鑒定后，進行回收和純化，并與pGEM-T easy vector進行連接。用BamHI+HindIII雙酶切法篩選，以切出1.7Kb大小條帶的質粒為陽性重組質粒，命名為pTH9A。陽性重組質粒送寶生物工程(大連)有限公司進行測序確證。
步驟二轉移載體(p1218AIH9)的構建轉移載體(p1218AIH9)的構建策略如圖3。
將質粒pTH9A用HindIII酶切經klenow酶補平，酚氯仿抽提回收線型質粒DNA，再用BamHI酶切電泳回收1.7kb片段，分別與用SmaI和BamHI酶切的載體質粒p12-18連接，構建成轉移載體p1218AIH9，長度為11800bp。
步驟三轉染與純化轉染按GeneJammerTM6轉染試劑的說明進行。在60mm培養皿中培養SPF成纖維細胞至形成單層，以0.1MOI的wt-FPV疫苗株感染CEF，37℃培養3～4h，倒去上清用DMEM基礎基洗滌兩次后加4ml備用。將1-2μgp1218AIH9分別溶于30μl的TE，按1∶6將GeneJammerTM6稀釋到100μlDMEM基礎培養基中，輕輕混勻，置室溫作用15min，將p1218AIH9的上述混合物緩慢滴加至已感染wt-FPV CEF的DMEM基礎培養基中混勻；37℃培養6h后換維持液，待細胞完全病變后收獲病毒，-70℃～37℃反復凍融3次，低速離心去除細胞碎片，上清用于重組病毒的篩選。
將上清稀釋液接種長成致密單層的CEF，待出現單個典型蝕斑后，用含有200μg/ml X-gal的營養瓊脂覆蓋，37℃培養72h，待出現藍色蝕斑后挑取藍色蝕斑進一步克隆純化，直至在X-gal存在的條件下，重組病毒在CEF上所形成的蝕斑全部呈藍色。
步驟四表達H9亞型AIV HA基因的不同重組雞痘病毒的鑒定用rFPV-1218AIH9感染已形成致密單層的CEF，并分別設rFPV-1175H5A和wt-FPV為陽性和陰性對照。在37℃、5％CO2條件下培養直至出現典型蝕斑后，傾去培養液，以PBS(0.01M，pH7.4)輕輕洗滌一次，然后用冷甲醇固定10min；加入稀釋度為1∶1000的鼠抗H9亞型AIV G5株的單克隆抗體，37℃孵育1h；以含0.05％吐溫-80的0.01M PBS(簡稱PBST，pH7.2)洗5min×3次，再加入稀釋度為1∶200的羊抗鼠IgG-FITC熒光抗體，37℃孵育1h；用PBST洗滌5min×3次后置熒光顯微鏡下觀察并拍照記錄結果。
步驟五重組病毒的免疫效力實驗1、SPF實驗雞接種rFPVs后抵抗H9亞型AIV感染的免疫保護作用(以攻毒后第5天的排毒為指標)7日齡白來航SPF雛雞隨機分組，分別于頸部皮下免疫rFPV-11SH9A、rFPV-1218AIH9和wt-FPV，104-106PFU/只。PBS對照組和油乳劑滅活苗對照組，0.2ml/只。于免疫后7，10，14，18，21天采血，分離血清檢測HI抗體效價。結果發現，各種重組疫苗均能誘生針對H9亞型AIV的特異性HI抗體。由p12-18載體構建的疫苗比由p11S載體構建的相應疫苗誘生的HI抗體水平略高。
在SPF雞的免疫保護試驗中，rFPV-11SH9A和rFPV-p1218AIH9的PI分別為77.78和100。
表1.SPF雞接種rFPVs后抵抗H9亞型AIV感染的免疫保護作用
2、rFPVs在商品雞的免疫效力(以攻毒后第5天的排毒為指標)在商品雞的免疫保護試驗中，油乳劑滅活苗的PI為83；rFPV-11SH9A和rFPV-1218AIH9的PI分別為75和83。由p12-18載體構建的重組疫苗分別比相應的由p11S載體構建的重組疫苗的免疫效力略高。
表2.商品蛋雞接種rFPVs后抵抗H9亞型AIV感染的免疫保護試驗
gctggatccg ccaccatgga aacaatatca ctaatagctgtcggatcca agcttacaaa aagccaatta tatacaaatc ttgc
權利要求
1.重組雞痘病毒疫苗rFPV-1218AIH9，其特征在于該疫苗為含表達H9亞型禽流感血凝素基因的重組雞痘病毒疫苗，保藏號為CGMCC 1913。
2.如權利要求1所述重組雞痘病毒疫苗rFPV-1218AIH9的制備方法，其特征在于包括以下步驟1)獲得含H9亞型AIV HA基因整個閱讀框架的基因；2)將上述基因置于合適啟動子下游，插入到含FPV復制非必需片段FPV12-18和報告基因的插入載體中構建成轉移載體p1218AIH9；3)用轉移載體p1218AIH9轉染已感染wt-FPV的雞胚成纖維細胞，通過同源重組獲得表達H9亞型AIV HA基因的rFPV；4)增殖和收獲表達H9亞型AIV HA基因的rFPV，得到重組雞痘病毒疫苗rFPV-1218AIH9。
3.根據權利要求2所述重組雞痘病毒疫苗rFPV-1218AIH9的制備方法，其特征在于步驟1)中H9亞型AIV HA基因可以通過以下方法獲得用9-10日齡SPF雞胚擴增病毒，收集尿囊液，酚-SDS法抽提病毒基因組的RNA，根據已發表的H9亞型AIV HA基因序列設計一對引物PH9A1 5’-GCTGGATCC ATGGAAACAATATCACTAATAGCT-3’PH9A2 5’-GTCGGATCC GCCAATTATATACAAATCTTGC-3’先反轉錄合成cDNA，然后PCR擴增出H9亞型AIV HA基因整個閱讀框架。
4.根據權利要求2所述重組雞痘病毒疫苗rFPV-1218AIH9的制備方法，其特征在于步驟(2)中啟動子可以是任何能夠在重組雞痘病毒rFPV感染細胞中指導基因轉錄的FPV啟動子、痘苗病毒啟動子或人工合成啟動子。
5.根據權利要求2或4所述重組雞痘病毒疫苗rFPV-1218AIH9的制備方法，其特征在于步驟2)中啟動子和上述基因通過酶切加接的方法或用PCR設計引物加接的方法連接在一起，按常規方法將其插入到含FPV復制非必須片段FPV12-18和報告基因LacZ的FPV插入載體中，在將此連接產物轉化到適當的宿主細胞中，按常規方法純化并分析重組體，得到轉移載體p1218AIH9。
6.根據權利要求5所述重組雞痘病毒疫苗rFPV-1218AIH9的制備方法，其特征在于轉移載體p1218AIH9的構建方法是將質粒pTH9A用HindIII酶切經klenow酶補平，酚∶氯仿抽提回收線型質粒DNA，再用BamHI酶切電泳回收1.7kb片段，分別與用SmaI和BamHI酶切的載體質粒p12-18連接。
7.根據權利要求2所述重組雞痘病毒疫苗rFPV-1218AIH9的制備方法，其特征在于步驟3)中用GeneJammerTM轉染試劑將轉移載體分別與wt-FPV共轉染雞胚成纖維細胞，將上清稀釋液接種長成致密單層的雞胚成纖維細胞，待出現單個典型蝕斑后，用含有X-gal的營養瓊脂覆蓋，藍斑篩選純化得重組病毒rFPV-p1218AIH9。
8.根據權利要求2所述重組雞痘病毒疫苗rFPV-1218AIH9的制備方法，其特征在于步驟4)中，將表達H9亞型AIV HA基因的rFPV在雞胚成纖維細胞單層上增殖，使病毒在雞胚成纖維細胞中擴增。
9.重組雞痘病毒疫苗rFPV-1218AIH9的用途，其特征在于用于防治H9亞型禽流感病毒。
全文摘要
重組雞痘病毒疫苗rFPV－1218AIH9及其制備方法、用途，涉及一種重組雞痘病毒疫苗，特別是一種用雞痘病毒新鑒定的復制非必需區構建表達H9亞型禽流感病毒血凝素基因的重組雞痘病毒疫苗。將含H9亞型AIV HA基因置于啟動子下游，插入到含FPV復制非必需片段FPV12－18和報告基因的插入載體中構建成轉移載體；用轉移載體轉染已感染wt－FPV的雞胚成纖維細胞，通過同源重組獲得表達H9亞型AIV HA基因的rFPV；增殖和收獲表達H9亞型AIV HA基因的rFPV，得到重組雞痘病毒疫苗。通過以上方法能得到不受母源抗體干擾的重組雞痘病毒活疫苗，其方法可靠性強，疫苗穩定件好，純度高。
文檔編號C12N15/63GK101062412SQ20071002268
公開日2007年10月31日 申請日期2007年5月25日 優先權日2007年5月25日
發明者劉秀梵, 陳素娟, 孫蕾, 劉武杰 申請人:揚州大學