專利名稱：雞傳染性喉氣管炎、雞痘二聯活疫苗的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種雞傳染性喉氣管炎、雞痘二聯活疫苗，特別是指一種雞傳染性喉氣管炎、雞痘二聯凍干活疫苗，屬于獸用疫苗領域。
背景技術：
雞傳染性喉氣管炎是由傳染性喉氣管炎病毒引起的一種急性、接觸性上部呼吸道傳染病。其特征是呼吸困難、咳嗽和咳出含有血樣的滲出物。剖檢時可見喉部、氣管粘膜腫脹、出血和糜爛。在病的早期患部細胞可形成核內包涵體。本病1925年在美國首次報道后，現已遍及世界許多養雞地區。本病傳播快，死亡率較高，在我國較多地區發生和流行，危害養雞業的發展。雞痘是由雞痘病毒引起的傳染病，多年來在全國各地都有發生。尤其在秋季，根據癥狀和病變的表現，雞痘可分為皮膚型、白喉型和混合型。一般以皮膚型者居多，它在冠、肉垂、嘴角、眼皮、耳球和腿、腳、泄殖腔以及翅的內側等部位形成一種特殊的痘疹。病雞往往精神萎頓，雞群采食量減少，明顯消瘦，生長受阻，發育不良等。白喉型雞痘主要在喉頭及氣管中產生多量黃色干酪樣或 膿樣物，堵塞咽喉，造成病雞呼吸困難，因氣流不暢，喉部發出
“咯......咯”的尖叫聲，患雞因停食衰竭和窒息而死亡。混合型雞痘具備上述兩型雞痘特
征，死亡率更高，嚴重者可高達30% -40%，給養雞業帶來巨大的經濟損失。通常情況下，雞群發生溫和性及皮膚型痘時，死亡率較低，而發生全身性感染，特別是發生白喉型，或者有并發感染傳染性喉氣管炎及環境條件差時，死亡率較高，給雞場帶來嚴重的損失。疫苗免疫是控制這兩種病的根本措施，目前使用最多的是雞痘病毒鵪鶉化株弱毒活疫苗，通過刺種的方法免疫；及雞傳染性喉氣管炎弱毒雞胚組織苗，采用滴鼻點眼方式接種來防治。因為接種方式不同，這兩種病需要至少需要兩次接種才能預防，多次接種不僅養殖成本上升，而且多次對雞體產生刺激，影響免疫效果。另外，由于雞傳染性喉氣管炎弱毒疫苗點眼后往往引起免疫雞結膜發炎、失明等嚴重副反應，給養雞戶帶來一定損失。
發明內容
本發明通過雞全胚成纖維細胞培養雞傳染性喉氣管炎病毒及雞痘病毒，特別是成功使用雞全胚成纖維細胞培養雞傳染性喉氣管炎病毒，獲得雞全胚成纖維細胞培養的雞傳染性喉氣管炎病毒及雞痘病毒，進而通過對兩種病毒液比例進行調整，使得兩種病毒抗原相互無影響，加入適宜的凍干保護劑后，而獲得了一種二聯凍干活疫苗。該二聯凍干活疫苗可以采用翅下皮下刺種的方式免疫接種，既可以減輕雞傳染性喉氣管炎活疫苗的副反應，又能簡化免疫操作，減少應激反應以及降低生產成本。同時，采用新的配方制備的凍干保護齊U，能有效的延長活疫苗的存放時間，為產品的保藏及運輸帶來了極為便利的條件。技術方案即本發明的主要目的在于提供一種雞傳染性喉氣管炎、雞痘二聯活疫苗，其含有雞傳染性喉氣管炎病毒，與雞痘病毒。
優選地，本發明所述的雞傳染性喉氣管炎病毒，與所述的雞痘病毒均使用雞全胚成纖維細胞培養獲得的。優選地,本發明所述的雞傳染性喉氣管炎病毒含量為106/0.1mlEID5tl,雞痘病毒含量為 106/0.Iml EID500優選地，本發明所述的二聯活疫苗為使用雞痘病毒與雞傳染性喉氣管炎病毒兩種病毒液按1:1的體積比例混合，使二聯活疫苗中每羽份雞痘病毒含量為IO4EID5tl、雞傳染性喉氣管炎病毒含量為104EID5(i。本發明還提供了一種雞傳染性喉氣管炎、雞痘二聯凍干活疫苗，即使用上述二聯活疫苗，加入凍干保護劑，經冷凍干燥后獲得。優選地，本發明所述的凍干保護劑包括以下組分:A液:L_谷氨酸鈉3% W/V，蔗糖7% ff/V,D-山梨醇2% W/V，硫代硫酸鈉2% W/V，維生素C 0.2% W/V，余量為水；B液:聚乙烯吡咯烷酮3% W/V，余量為水；A液和B液體積配比為1:1。本發明還提供了一種雞傳染性喉氣管炎、雞痘二聯活疫苗制備方法，其中，使用雞全胚成纖維細胞分別培養雞傳染性喉氣管炎病毒與雞痘病毒。優選地，本發明二聯活疫苗的制備方法包括以下步驟:I)在形成細胞單層的雞全胚成纖維細胞中，加入含1%胎牛血清的細胞維持液，PH調至6.8，接種雞痘病毒，吸附并培養至CPE大于80%以上時停止培養，收獲雞痘病毒；2)在形成細胞單層的雞全胚成纖維細胞中，加入含1%胎牛血清的細胞維持液，pH調至6.8，接種雞傳染性喉氣管炎病毒，吸附并培養至CPE大于80%以上時停止培養，收獲雞傳染性喉氣管炎病毒；3)將上述兩種病毒液按1:1的比例混合，混合后定量分裝，即制成二聯活疫苗。優選地，本發明上述步驟3)還包括在混合后的病毒液中，加入凍干保護劑，經冷凍真空干燥，以獲得雞傳染性喉氣管炎、雞痘二聯凍干活疫苗的步驟。因此，本發明提供了上述二聯活疫苗在預防或治療雞傳染性喉氣管炎和雞痘病中的應用；以及二聯凍干活疫苗在預防或治療雞傳染性喉氣管炎和雞痘病中的應用。技術效果 由上可以看出，首先，本發明通過雞胚成纖維細胞培養獲得了雞傳染性喉氣管炎病毒與雞痘病毒，特別是成功地使用雞全胚成纖維細胞培養獲得了滴度足夠夠高的雞傳染性喉氣管炎病毒與雞痘病毒，因此，可以實現方便、快捷地實現了雞傳染性喉氣管炎、雞痘二聯活疫苗及凍干活疫苗的大規模生產；其次，發明人創造性選擇使用翅下皮下刺種的方法，優于以前的滴鼻點眼方式接種雞傳染性喉氣管炎疫苗，節約了接種步驟和時間，并獲得了同時預防或治療雞傳染性喉氣管炎和雞痘病的效果；此外，本發明的二聯疫苗和凍干活疫苗安全性較佳，抗原間無相互干擾，免疫效果大于單苗的免疫效果；最后，通過加入合適凍干保護劑，延長凍干疫苗的保藏時間，為產品的運輸與儲存提供了方便。
具體實施例方式下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發明的范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和范圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護范圍內。實施例11.雞全胚成纖維單層細胞制備方法選取10日齡SPF雞胚(購自北京梅里亞維通實驗動物技術有限公司)，用0.1%新潔爾滅和2%碘酊對蛋殼表面做消毒處理，無菌挑出雞胚放入滅菌容器中，加入維持液洗滌3遍，徹底洗掉血液和粘性代謝物質。用滅菌剪刀將胚體剪成米粒大小的組織碎塊，分別倒入盛有滅菌玻璃珠的500ml中性玻璃瓶中，視組織塊的多少加入0.25%胰蛋白酶消化液(1:4)。然后放入37°C水浴鍋中消化25分鐘(期間要輕搖3次使胰酶與組織碎塊充分接觸)，待組織塊呈蓬松絨毛狀時停止消化。倒出胰酶消化液，再用維持液輕洗消化好的組織塊3遍，以徹底洗脫胰酶消化液。隨后加入維持液由輕漸重搖晃分散細胞，靜置5分鐘，上清經6層滅菌紗布過濾。將得到的細胞懸液加入所需含5%胎牛血清的生長液，pH調至7.2.分裝于小方瓶中，于37°C培養。2.病毒液的制備雞痘病毒液的制備:待上述細胞培養24h已經基本形成致密的細胞單層，倒出培養液，加入含I %胎牛血清的維持液，pH調至6.8，同時按培養液總量的3%接種雞痘生產種毒(鵪鶉化雞痘弱毒株，購自中國獸醫藥品監察所，保藏號CVCC AV1003)，并吸附一個小時，然后補加細胞維持液，并于同條件下繼續培養。接毒后每天肉眼或低倍顯微鏡下觀察細胞病變，待80%以上單層細胞出現細胞圓縮、空斑或拉網脫落等病變時停止培養，-15°C冷凍保藏。雞傳染性喉氣管炎病毒液的制備:待上述細胞培養24h已經基本形成致密的細胞單層，倒出培養液，加入含1%胎牛血清的維持液，PH調至6.8，同時按培養液總量的3%接種雞傳染性喉氣管炎生產種毒(雞胚化弱毒株，購自中國獸醫藥品監察所，保藏號CVCCAV23)，并吸附一個小時，然后補加細胞維持液，并于同條件下繼續培養。接毒后每天肉眼或低倍顯微鏡下觀察細胞病變，待80%以上單層細胞出現細胞圓縮、空斑或拉網脫落等病變時停止培養，_15°C冷凍保藏。3.病毒含量測定雞痘病毒液病毒含量:將上述制備的雞痘病毒液進行10倍系列稀釋，取10_4、10_5、10_6、10_7四個稀釋度，每個稀釋度絨毛尿囊膜接種9-11日齡SPF雞胚6枚，每胚0.1ml,置37°C孵育，接種后24小時內死亡的雞胚棄去不計，每個稀釋度的活胚數不應少于4枚。7日后觀察雞胚的感染情況。根據R eed-Muench法計算EID5tl，對雞胚最小感染量為106EID50/0.1mlo雞傳染性喉氣管炎病毒液病毒含量:將上述制備的雞傳染性喉氣管炎病毒液進行10倍系列稀釋，取ιο'ιο'ιο'ιο—7四個稀釋度，每個稀釋度絨毛尿囊膜接種9-11日齡SPF雞胚6枚，每胚0.1ml，置37°C孵育，接種后24小時內死亡的雞胚棄去不計，每個稀釋度的活胚數不應少于4枚。7日后觀察雞胚的感染情況。根據Reed-Muench法計算EID5tl,對雞胚最小感染量為106EID5Q/0.lmlo4.凍干保護劑的制備A液組成成分為:L_谷氨酸鈉3g，蔗糖7g，D-山梨醇2g，硫代硫酸鈉2g，維生素C0.2g,完全溶解后用注射用水補至100mL。經0.22 μ m濾膜過濾除菌,備用。B液組成成分為:聚乙烯吡咯烷酮3g，完全溶解后用注射用水補至lOOmL。116°C高壓滅菌30分鐘，備用。A液和B液按照1:1的體積配比混合，即為凍干保護劑。5.雞痘、傳染性喉氣管炎二聯活疫苗的配制將上述檢驗合格的雞痘、傳染性喉氣管炎兩種病毒液按1:1的比例混合，混合后定量分裝，每羽份病毒含量雞痘病毒為IO4EID5tl,每羽份雞傳染性喉氣管炎病毒為104EID5(i。分裝后加入凍干保護劑，經冷凍真空干燥制成凍干活疫苗。制備三批，分別是S101、S102和S103。6.疫苗的安全性檢驗 取35日齡的SPF雞40只，隨機分成4組，每組10只，第1-3組為試驗組，分別翅膀內側無血管處皮下刺種3批二聯苗，每只0.1ml (含10羽份)；第4組為對照組，不作任何處理。免疫組雞接種后連續21天每天進行觀察，觀察免疫組雞和對照組雞的精神狀態和全身反應。檢查是否有眼炎、頭部腫脹和呼吸道癥狀等雞傳染性喉氣管炎癥狀，同時檢查刺種部位是否有腫脹等局部反應及腫脹消失時間。結果3批疫苗0.1ml (含10羽份)對35日齡的雞進行翅下皮下刺種后，連續觀察21天內，全部免疫組雞接種后3-5日出現雞痘疫苗接種后的正常局部反應，接種部位出現痘腫，并在接種后9-12日消失，沒有出現融合性的結痂，不發生全身痘。免疫組雞和對照組雞精神、食欲和發育均正常，沒有出現眼炎和呼吸道癥狀，無全身不良反應。表I 二聯苗安全性試驗結果
分組接種接種方法接種后反應 雞數及劑量接種局部腫賬全身精神 出現時消失時間反應食欲
____N____S101 ip_翅下皮下3-5天 9-12天無 正常
510210 刺種 3-5天 9-12天無 正常
510310 0.1ml ( 10 3-5 天 9-12 天無 正常
___羽份)_____
對照組 10 /__^__^__無正常7.疫苗的免疫效力試驗
取35日齡的SPF雞80只，隨機分成8組，每組10只。第1_3組和5_7組為疫苗接種組，第1-3組分別翅下皮下刺種3批二聯苗，每只雞0.1ml (含1/100羽份)；第5_7組分別翅下皮下刺種3批二聯苗，每只雞0.1ml (含I羽份)；第4組和第8組分別作為雞痘陽性對照組和雞傳染性喉氣管炎陽性對照組，不接種疫苗。接種后14日，取1-4組的試驗雞，用10_4稀釋的雞痘病毒102株病毒液(購自中國獸醫藥品監察所，保藏號CVCC AV1001)進行毛囊涂抹攻毒，每只雞0.1ml，攻毒后觀察14日，每天進行兩次，觀察雞的發病情況。雞痘發病雞判斷標準為:在羽毛囊擦拭部位出現典型的雞痘病毒引起的損傷，即痘斑。接種后21日，取5-8組的雞,用雞傳染性喉氣管炎病毒北京株病毒液(購自中國獸醫藥品監察所，保藏號CVCC AV22)氣管內注射進行攻毒，每只雞0.1ml (含IO4EID5tl)，攻毒后觀察14日，每天進行兩次，觀察雞的發病情況。雞傳染性喉氣管炎發病雞的判定標準為:1)喘氣或呼吸困難；2)啰音；3)打噴嚏；4)結膜炎；出現上述癥狀之一即判為發病。3批二聯苗免疫1/100羽份的劑量免疫35日齡的雞后14日，對雞痘強毒102株攻毒產生可靠的攻毒保護，攻毒保護率均達到10/10(對照組雞10/10發病)。雞痘強毒102株攻毒后，免疫組雞全部沒有局部不良反應和全身癥狀，接種部位出現痘腫，并在接種后9-12日消失，沒有出現融合性的結痂，不發全身痘。對照組雞攻毒部位全部出現痘斑，嚴重者出現融合性結痂，有的發生破潰流水和濃汁。3個雞傳染性喉氣管炎病毒北京株強毒攻毒組的保護率均達到10/10 (對照組雞10/10發病)，沒有出現局部和全身癥狀。對照組雞均出現呼吸困難、流淚、伸頸呼吸、打噴嚏的雞傳染性喉氣管炎癥狀。可見二聯苗能有效的預防雞痘及雞傳染性喉氣管炎，可 對雞群產生有效的攻毒保護。表2 二聯苗免疫效力試驗結果
權利要求
1.一種雞傳染性喉氣管炎、雞痘二聯活疫苗，其特征在于，含有雞傳染性喉氣管炎病毒7與雞痘病毒。
2.根據權利要求1所述的二聯活疫苗，其特征在于，所述的雞傳染性喉氣管炎病毒，與所述的雞痘病毒均使用雞全胚成纖維細胞培養獲得的。
3.根據權利要求1所述的二聯活疫苗，其特征在于，所述的雞傳染性喉氣管炎病毒含量為 106/0.Iml EID5tl，雞痘病毒含量為 106/0.1ml EID500
4.根據權利要求1所述的二聯活疫苗，其特征在于，所述的二聯活疫苗為使用雞痘病毒與雞傳染性喉氣管炎病毒兩種病毒液按1:1的體積比例混合，每羽份雞痘病毒含量為。1O4EID50、雞傳染性喉氣管炎病毒含量為1O4EID50
5.一種雞傳染性喉氣管炎、雞痘二聯凍干活疫苗，其特征在于，所述的二聯凍干活疫苗為使用權利要求1-4任意一項所述的二聯活疫苗，加入凍干保護劑，經冷凍干燥后獲得。
6.根據權利要求5所述的二聯凍干活疫苗，其特征在于，所述的凍干保護劑包括以下組分:A液:L-谷氨酸鈉3% W/V，蔗糖7% W/V，D-山梨醇2% W/V，硫代硫酸鈉2% W/V，維生素C 0.2% W/V，余量為水；B液:聚乙烯吡咯烷酮3% W/V，余量為水；A液和B液體積配比為1:1。
7.一種雞傳染性喉氣管炎、雞痘二聯活疫苗制備方法，其特征在于，使用雞全胚成纖維細胞分別培養雞傳染性喉氣管炎病毒與雞痘病毒。
8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟: 1)在形成細胞單層的雞全胚成纖維細胞中，加入含1%胎牛血清的細胞維持液，PH調至6.8，接種雞痘病毒，吸附并培養至CPE大于80%以上時停止培養，收獲雞痘病毒； 2)在形成細胞單層的雞全胚成纖維細胞中，加入含1%胎牛血清的細胞維持液，pH調至6.8，接種雞傳染性喉氣管炎病毒，吸附并培養至CPE大于80%以上時停止培養，收獲雞傳染性喉氣管炎病毒； 3)將上述兩種病毒液按1:1的比例混合，混合后定量分裝，即制成二聯活疫苗。
9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于，所述步驟3)還包括在混合后的病毒液中，加入凍干保護劑，經冷凍真空干燥，以獲得雞傳染性喉氣管炎、雞痘二聯凍干活疫苗的步驟。
10.權利要求1-4任意一項所述的二聯活疫苗在預防或治療雞傳染性喉氣管炎和雞痘病中的應用。
11.權利要求1-4任意一項所述的二聯凍干活疫苗在預防或治療雞傳染性喉氣管炎和雞痘病中的應用。
12.根據權利要求10或11所述應用，其特征在于，所述疫苗是通過翅下皮下刺種免疫接種的。
全文摘要
本發明通過雞全胚成纖維細胞培養雞傳染性喉氣管炎病毒及雞痘病毒，特別是成功使用雞全胚成纖維細胞培養雞傳染性喉氣管炎病毒，獲得雞全胚成纖維細胞培養的雞傳染性喉氣管炎病毒及雞痘病毒，加入適宜的凍干保護劑后，而獲得了一種二聯凍干活疫苗。該二聯凍干活疫苗可以采用翅下皮下刺種的方式免疫接種，既可以減輕雞傳染性喉氣管炎活疫苗的副反應，又能簡化免疫操作，減少應激反應以及降低生產成本。同時，采用新的配方制備的凍干保護劑，能有效的延長活疫苗的存放時間，為產品的保藏及運輸帶來了極為便利的條件。
文檔編號A61P31/20GK103182080SQ20111044965
公開日2013年7月3日 申請日期2011年12月29日 優先權日2011年12月29日
發明者張許科, 孫進忠 申請人:普萊柯生物工程股份有限公司