一種利用草莓花藥培養進行脫毒快繁的方法

專利名稱：一種利用草莓花藥培養進行脫毒快繁的方法
技術領域：
本發明“一種利用草莓花藥培養進行脫毒快繁的方法”屬于農作物快繁技術領域，專用于草莓的脫毒快繁。
背景技術：
草莓(Fragaria ananassa.Duch)是薔薇科(Rosaceae)草莓屬(Fragaria)多年生草本植物，2n＝8x＝56，屬于多倍體植物。草莓果實為小漿果，鮮艷亮麗，柔軟多汁，酸甜適中，芳香濃郁，是世界上七大水果之一。由于栽培草莓具有結果期長、植株小、繁殖快、經濟效益高等特點，特別是配以大棚栽培，為冬春季的果品市場增添花色品種，尤其是在元旦、春節等重大節日供應市場，因而深受生產者和消費者的喜愛很有推廣意思和發展的潛力。
但草莓在生產過程中易感染病毒，從而造成草莓品種的種性退化。因此，無性繁殖數量越大，病毒傳播也越快。草莓感染病毒后易出現葉片皺縮、果實畸形、品質變劣、產量下降、植株生長緩慢等退化現象。病毒是引起草莓產量下降的一個重要因素。
本方法通過花藥培養的方法獲得草莓再生植株，建立一種方便實用、脫毒效果好、繁殖系數高、遺傳穩定性好的草莓脫毒快繁體系，從而促進草莓脫毒技術在生產上進一步應用和推廣。

發明內容
技術問題本發明的目的是針對目前草莓在我國的栽培面積和范圍逐年增加，因病毒侵染造成的減產和品質下降的問題日漸突出的現狀，提出一種通過草莓花藥培養來實現脫毒快繁的方法。
技術方案一種利用草莓花藥培養進行脫毒快繁的方法，其特征在于(1)消毒處理取長度為4-6mm的草莓花蕾，在4℃冰箱冷處理72h；然后將花蕾用無菌水沖洗一次在70％酒精浸泡5s之后再用無菌水沖洗一次置于加體積比為0.1％的吐溫和質量體積比為0.1％的升汞溶液中浸泡8min；最后用無菌水沖洗8-10次，用無菌吸水紙吸干花蕾表面的水；(2)愈傷組織誘導分化將消毒處理好的花蕾剝取花藥，接種到MS+BA0.5mg·L-1+NAA2.0mg·L-1+KT0.1mg·L-1+蔗糖30g·L-1+瓊脂6.5g·L-1的愈傷組織誘導培養基中30～60d；
將愈傷組織轉到MS+BA1.5mg·L-1+NAA0.5mg·L-1+ZT2.0mg·L-1+瓊脂6.5g·L-1的分化培養基中70～90d；然后將分化培養基中獲得的草莓苗轉接到MS+BA0.5mg·L-1+NAA0.1mg·L-1+蔗糖30g·L-1+瓊脂6.5g·L-1的繼代培養基上，進行繼代增殖培養20～30d；(3)生根移栽草莓苗轉到1/2MS+NAA0.2g·L-1+瓊脂6.5g·L-1的生根培養基進行生根處理20～30d；苗木生根后，將生根植株經過室外自然條件下鍛煉7-10d，移栽時開蓋加水鍛煉1-2d，以蛭石和珍珠巖混合體系作為移栽基質，移栽時的溫度控制在20-25℃范圍。
有益效果本發明針對草莓脫毒技術目前在生產上存在的問題，在前人研究的基礎上，首次建立了一種方便實用、脫毒效果好、繁殖系數高、遺傳穩定性好的草莓脫毒快繁體系。草莓花藥培養在國內已經有不少報道，但是如何獲得很高的再生率，一直以來是一個比較難以解決的問題。
本發明方法將草莓花藥培養分化率提高到37.5％，現有技術提高了28.03個百分點，突破了傳統分化率很低的困境。苗木生根后，移栽成活率達到90％。可作為商業用途的草莓脫毒方法在生產上直接使用，從而促進草莓脫毒技術在生產上進一步應用和推廣。
四

圖1低溫處理不同時間對愈傷組織誘導的影響圖2雪蜜分化不定芽圖片五具體實施方式
(一)最佳處理參數的確定1確定最佳花蕾的前期處理以及消毒方法的確定1.1最佳方法確定的材料和方法取自田間健壯草莓花蕾，發育時期為單核靠邊期(大小約為4-6mm)，在4℃冰箱冷處理0h、48h、72h、96h。冷處理結束后取出，在超凈臺上進行消毒處理。
消毒時間及步驟為花蕾用無菌水沖洗一次在70％酒精浸泡5、10s之后再用無菌水沖洗一次置于0.1％升汞(加吐溫)浸泡5、8、12min最后用無菌水沖洗8-10次(10min)，具體處理組合(表1)。消毒之后用無菌吸水紙吸干花蕾表面的水，將消毒處理好的花蕾剝取花藥，接種到MS+BA0.5mg·L-1+NAA2.0mg·L-1+KT0.1mg·L-1+蔗糖30g·L-1+瓊脂6.5g·L-1培養基，30d統計污染率以及誘導率。
表1 草莓花蕾不同消毒處理

1.2低溫處理對愈傷組織誘導的影響從田間取來的健壯草莓植株花蕾，去除表面雜質，將一部分置于4℃冰箱，進行低溫處理，處理時間分別為48h、72h、96h。剩余部分不經過低溫處理直接接種到6號培養基中。花蕾在低溫處理72h時花冠開始松動，但是經過檢測小孢子發育時期還處于單核靠邊期。由圖1可以看出，所設置的四個處理中，低溫處理96h后，大部分花冠松開，不能用于接種。其他三個處理均能誘導出愈傷組織，低溫處理72h的花藥，在培養10d時雪蜜(錢亞明，王壯偉，蘇家樂，趙密珍.草莓新品種雪蜜與豐香的設施栽培試驗.落葉果樹，2004(6)20)3.7％開始分裂出愈傷組織。而低溫處理48h在接種后10d時雪蜜1.8％產生了愈傷組織。但是不經過低溫處理直接接種的花藥從接種后的15d時雪蜜4.9％產生愈傷組織。因此經過一定的低溫處理有利于花藥發育的啟動，縮短愈傷組織開始分裂的時間。所以，本研究選擇接種前花蕾低溫處理72h。
1.3消毒方法對愈傷組織誘導的影響本試驗選取的消毒組合，在愈傷組織誘導過程中，花藥污染率控制在20％左右。表2結果表明，隨酒精和升汞消毒時間增長，污染率呈下降趨勢。由于花藥包在花蕾中，而所取得試材控制花蕾在單核靠邊期，其發育時間處于花瓣還被花萼包著，其雜菌的含量相對較低，若是消毒時間太長，對花藥的傷害也較大。將消毒處理過的花藥接種到愈傷組織誘導培養基中，統計消毒時間對誘導率的影響結果，發現誘導率隨消毒時間增長而呈下降趨勢。經過6個組合統計數據來看，隨著酒精消毒時間延長，污染率降低，但是愈傷組織也隨之下降，所以在酒精進行表面消毒使用時間的選擇上，確定為5s，而升汞消毒時間在8min，污染率控制在14％左右，而誘導率雪蜜在41.7％。綜合考慮選擇該組合進行消毒處理。
表2不同消毒處理對花藥污染率和愈傷組織的影響

2最佳愈傷組織誘導培養基的確定2.1材料和方法以MS為基本培養基，添加6.5g·L-1的瓊脂條及不同的激素及不同濃度蔗糖(表3)，pH調到5.8，高壓滅菌20min。接種后進行暗處理，暗處理時間為7d，再轉入光培養的培養室培養。
培養條件為溫度25℃±1℃；光照時間12h光/12h暗；光照強度2000Lx。
各誘導培養基設兩個重復，每個重復接種三個培養皿，每個培養皿接種花藥50枚。愈傷組織誘導率統計以花藥接種后30d產生愈傷組織的花藥個數為準。
愈傷組織誘導率％＝產生愈傷組織的花藥數/接種的花藥個數×100。
表3不同誘導培養基處理

注由于IAA、KT高溫分解，故采取先將培養基高溫滅菌后，再加入IAA、KT分裝的配制方法。
2.2不同激素組合對愈傷組織誘導率的影響本試驗采用的以MS為基本培養，設計9種不同激素組合配比，20d后觀察愈傷組織誘導情況。發現組合1-3培養基接種花藥后第二天即出現了褐化，而且經過40d還未分裂出愈傷組織。而組合4-9已經可以肉眼看到愈傷組織，而且未發生接種花藥后褐化枯死的現象。30d后統計愈傷組織誘導率，結果顯示當蔗糖濃度為30g/L時，提高BA濃度而降低NAA濃度的組合4、6、9對愈傷組織形成有很好的促進作用，愈傷組織形態上表現為緊密，表面黃綠色有顆粒狀，在分化階段的分化能力強。其中組合6誘導率顯著高于其他幾個組合，雪蜜有87.2％分裂成愈傷組織(表4)，而且愈傷組織形態表現為致密、黃綠色，有利于植株的分化。雖然組合5表現為愈傷組織生長速度快，但質地膨松，表面色澤暗，而后表現為水漬狀，沒有分化能力。因此綜合考慮選用組合6(MS+BA0.5mg·L-1+NAA2.0mg·L-1+KT0.1mg·L-1+瓊脂6.5g·L-1)為本研究愈傷組織誘導最佳激素種類和濃度的配方。
2.3不同蔗糖組合對愈傷組織誘導率的影響表4顯示，在誘導率方面蔗糖濃度為30g·L-1的組合4、6、8對愈傷組織的誘導率高于同激素組合下60g·L-1的組合5、7、9。從愈傷組織的形態上看，30g·L-1組合愈傷組織生長良好，表現為黃綠色，而60g·L-1蔗糖濃度組合則表現為后期褐色，進而轉為水漬狀，不能分化植株。表明30g·L-1蔗糖濃度對花藥的分裂啟動，愈傷組織增殖都有很好的促進作用。30d統計愈傷組織在蔗糖濃度為30g·L-1，MS+BA0.5mg·L-1+NAA2.0mg·L-1+KT0.1mg·L-1+瓊脂6.5g·L-1培養基組合誘導率為87.2％。因此在本試驗中選取添加蔗糖濃度為30g·L-1。
表4不同激素組合和蔗糖組合對愈傷組織誘導的影響

注英文字母表示不同處理差異，大寫字母代表Duncan分析中差異見顯著水平(0.01)，小寫字母為顯著水平(0.05)以下同。
3最佳再生培養基的確立3.1材料與方法將繼代2次的愈傷組織轉到以MS為基本培養基，添加不同激素的分化培養基，大約70d后就分化出草莓植株(表5)。
表5不同分化培養基處理

注由于ZT高溫分解，故采取先將培養基高溫滅菌后，再加入ZT分裝的配制方法。
分化率％＝分化的愈傷組織數/接種的愈傷組織數×100。
3.2不同激素對再生的影響將愈傷組織轉入MS+蔗糖30g·L-1+瓊脂6.5g·L-1、PH＝5.8附加不同激素濃度的分化培養基中(表6)，結果顯示，多數愈傷組織在分化培養基上，顏色變綠，質地變結實，愈傷組織表面呈顆粒狀。隨著培養時間的延長，不同分化培養基上的愈傷組織出現了不同的結果，部分愈傷組織分化出叢生不定芽(圖2)；有的愈傷組織接觸培養基的一面容易變褐，并逐漸死亡。本實驗表明，在同樣以基本培養基添加同種類激素和濃度(BA1.5mg·L-1+NAA0.5mg·L-1+ZT2.0mg·L-1)情況下雪蜜草莓花藥愈傷組織分化率較高，達到37.5％。花藥培養分化速度慢，一般在置于分化培養基上70d后才開始進入分化。由實驗結果看出，當NAA濃度由0.5mg·L-1提高到1.0mg·L-1時，分化率均降低，可見草莓花藥植株的分化只在外源生長素濃度很低的條件下發生。生長素濃度高，雖然愈傷組織生長速度很快，但是愈傷組織外部形態會表現出水漬狀，并且隨時間的推移，逐漸變為褐色，不利于再生植株的分化。從試驗結果看，當其他兩個激素濃度不變，隨著玉米素濃度由1.5mg·L-1增加到2.0mg·L-1時，前三個處理雪蜜愈傷組織分化率由30.9％提高到37.5％，后三個處理雪蜜愈傷組織分化率由28.6％提高到3 1.7％，從而說明玉米素在芽分化過程中具有顯著的促進作用。
表6不同激素濃度組合對愈傷組織分化率的影響

4最佳繼代培養基的確立4.1材料和方法當分化的組培苗長至1cm左右時，小心切下接種到增殖培養基，增殖培養基選擇用MS附加BA和NAA的不同濃度對比處理(表7)，增殖培養時，每種培養基設二個重復，每個重復接種五瓶，每瓶繼代組培苗株數為3株，增殖培養過程中30d繼代1次，統計每組處理芽增殖數量。
表7增殖培養基處理

4.2繼代培養基的確定將誘導出的雪蜜草莓健壯苗轉接到繼代培養基上，培養30d后，調查芽的增殖情況，結果見表8。叢生芽的生長方式有兩種，一種是在母株的根基部產生愈傷組織，然后在愈傷組織上直接分化出不定芽，另外一種方式是直接在母株的一個腋芽長出新的植株。在BA濃度為0.5mg·L-1時，添加NAA會增加其增殖率，增殖系數由3.9提高到4.7。當BA濃度增加時，分化率提高，同時玻璃化現象也隨之出現。一般認為，培養基中BA含量的高低，直接影響玻璃化苗的發生與否，只有細胞分裂素與生長素的合理搭配，才能達到理想的生長分化效果。本研究經過綜合考慮，選取激素濃度BA為0.5mg·L-1+NAA0.1mg·L-1，芽的增殖系數為4.7，與BA為0.5mg·L-1時，NAA濃度為0.0、0.05mg·L-1存在顯著差異。
表8各增殖培養基的增殖效果

5試管苗生根培養基和移栽方法的確立將繼代幾次生長健壯的草莓花藥組培苗轉接接到1/2MS(大量元素減半，其他成分不變)和1/2MS+NAA0.2g·L-1培養基，30d后觀察其根的生長情況。
在增殖培養基上的草莓苗，一般也會有大量的根長出，但是在增殖培養基長出的根在根基部有愈傷組織出現，移栽后會影響其成活率，因此再生植株要轉到生根培養基進行生根處理。結果表明，1/2MS培養基發根晚，而且在根部會產生大量的愈傷組織，在添加了生長素后，生根早，而且生根率高，且根部愈傷組織明顯減少。
移栽前，將生根植株經過光照鍛煉7-10d，移栽時開蓋加水鍛煉1-2d，一般以蛭石和珍珠巖混合體系作為為移栽基質。移栽后注意口罩保濕，移栽時的溫度控制在20-25℃范圍，移栽成活率達到90％。
(二)實施例取自田間健壯雪蜜草莓花蕾，發育時期為單核靠邊期(大小約為4-6mm)，在4℃冰箱冷處理72h。冷處理結束后取出，在超凈臺上進行消毒處理。
消毒時間及步驟為花蕾用無菌水沖洗一次在70％酒精浸泡5s之后再用無菌水沖洗一次置于0.1％升汞(加0.1％吐溫)浸泡8min最后用無菌水沖洗8-10次(10min)。消毒之后用無菌吸水紙吸干花蕾表面的水，將消毒處理好的花蕾剝取花藥，接種到MS+BA0.5mg·L-1+NAA2.0mg·L-1+KT0.1mg·L-1+蔗糖30g·L-1+瓊脂6.5g·L-1的愈傷組織誘導培養基中。
將繼代2次(30d)的愈傷組織轉到以MS為基本培養基，同時添加BA1.5mg·L-1、NAA0.5mg·L-1和ZT2.0mg·L-1的分化培養基中，大約70d后就分化出草莓植株。本發明方法將草莓花藥培養分化率提高到37.5％，比現有技術9.47％(查中萍，柳俊，劉定富.影響草莓花藥培養因素的分析.安徽農業科學，2006，34(1)24～28)提高了28.03個百分點。
將誘導出的草莓健壯苗轉接到MS+BA0.5mg·L-1+NAA0.1mg·L-1+蔗糖30g·L-1+瓊脂6.5g·L-1繼代培養基上，進行繼代增殖培養2～3次。然后轉到1/2MS+NAA0.2g·L-1+瓊脂6.5g·L-1的生根培養基進行生根處理。
苗木生根后，將生根植株經過光照鍛煉7-10d，移栽時開蓋加水鍛煉1-2d，一般以蛭石和珍珠巖混合體系作為為移栽基質。移栽后注意用塑料薄膜罩口保濕，移栽時的溫度控制在20-25℃范圍，移栽成活率達到90％。
權利要求
1.一種利用草莓花藥培養進行脫毒快繁的方法，其特征在于(1)消毒處理取長度為4-6mm的草莓花蕾，在4℃冰箱冷處理72h；然后將花蕾用無菌水沖洗一次在70％酒精浸泡5s(秒)之后再用無菌水沖洗一次置于加體積比為0.1％的吐溫和質量體積比為0.1％的升汞溶液中浸泡8min(分鐘)；最后用無菌水沖洗8-10次，用無菌吸水紙吸干花蕾表面的水；(2)愈傷組織誘導分化將消毒處理好的花蕾剝取花藥，接種到MS(QU Shen-Chun，HUANG Xiao-De，ZHANG Zhen，YAO Quan-HONG，TAO Jian-Min，QIAO Yu-Shan，ZHANG Jun-Yi.Agrobacterium-mediated transformation of Malus robusta with tomato iron transportergene[J]，Journal of Plant Physiology and Molecular Biology，2005，31(3)235-240)+BA(6-芐氨基嘌呤)0.5mg·L-1+NAA(萘乙酸)2.0mg·L-1+KT(細胞激動素)0.1mg·L-1+蔗糖30g·L-1+瓊脂6.5g·L-1的愈傷組織誘導培養基中30～60d(天)；將愈傷組織轉到MS+BA1.5mg·L-1+NAA0.5mg·L-1+ZT(玉米素)2.0mg·L-1+瓊脂6.5g·L-1的分化培養基中70～90d；然后將分化培養基中獲得的草莓苗轉接到MS+BA0.5mg·L-1+NAA0.1mg·L-1+蔗糖30g·L-1+瓊脂6.5g·L-1的繼代培養基上，進行繼代增殖培養20～30d；(3)生根移栽草莓苗轉到1/2MS+NAA0.2g·L-1+瓊脂6.5g·L-1的生根培養基進行生根處理20～30d；苗木生根后，將生根植株經過室外自然條件下鍛煉7-10d，移栽時開蓋加水鍛煉1-2d，以蛭石和珍珠巖混合體系作為移栽基質，移栽時的溫度控制在20-25℃范圍。
全文摘要
本發明涉及“一種利用草莓花藥培養進行脫毒快繁的方法”，屬于生物工程技術領域。將取自田間健壯草莓花蕾，發育時期為單核靠邊期(大小約為4－6mm)，在4℃冰箱冷處理72h(小時)。然后將花蕾分別用70％酒精、0.1％升汞(加吐溫)消毒之后用無菌吸水紙吸干花蕾表面的水，將消毒處理好的花蕾剝取花藥，接種到愈傷組織誘導培養基中，然后轉到再生培養基中，再將誘導出的草莓健壯苗轉接到繼代培養基上，最后轉到生根培養基進行生根處理。本方法將草莓花藥培養分化率提高到37.5％，比現有技術提高了28.03個百分點，突破了傳統分化率很低的困境。苗木生根后移栽成活率90％，從而促進草莓脫毒技術在生產上進一步應用和推廣。
文檔編號C12N5/04GK101049090SQ20071002280
公開日2007年10月10日 申請日期2007年5月22日 優先權日2007年5月22日
發明者喬玉山, 渠慎春, 蔡斌華, 王三紅, 高志紅, 徐長寶, 楊曉春, 侯喜林, 吳震 申請人:南京農業大學