專利名稱：從微生物發酵液中分離提取透明質酸的方法
技術領域：
本發明涉及透明質酸的制備方法，尤其涉及從微生物發酵液中分離提取透明質酸的方法。
背景技術：
透明質酸(Hyaluronic Acid，HA)是由葡萄糖醛酸和乙酰氨基葡萄糖通過β，1-3和β，1-4糖苷鍵所構成的重復單元而形成的線性高分子粘多糖，雙糖單位數為300-1100對，分子量范圍105-107Da。
1934年，Meyer和Palmer從牛眼玻璃體中分離出一種大分子多糖，他們把這種多糖命名為透明質酸。HA溶于水，不溶于醇、酮、乙醚等有機溶劑。由于其溶液具有超強的持水性、粘彈性和生物易吸收性，被廣泛由于眼科手術、腹腔手術中預防粘連、關節炎以及化妝品等領域。
透明質酸的生產主要有動物組織提取法和發酵法兩種生產工藝。在早期主要是提取法，可用于生產透明質酸的動物器官組織主要有雞冠、人臍帶和動物眼球。由于受原料來源少以及透明質酸含量低的限制，提取法生產透明質酸成本較高。與提取法相比，發酵法生產規模不受原料來源限制，發酵液中透明質酸以游離狀態存在，易于分離純化和形成規模化工業生產，所以生產成本遠低于提取法，而且無動物來源的致病病毒污染的危險，且可以得到大分子量、高產量的HA。因此，目前提取法正逐漸被發酵法取代。
已知的使用微生物分離并純化透明質酸的方法如下美國專利No.4784990描述的純化方法包括向獸疫鏈球菌的培養液中加入乙醇使透明質酸從微生物中分離出來，然后用氯代十六烷基吡啶使其沉淀。HA得率僅60-70％，需要經高溫加熱、兩次過濾、二次絡合、四次醇沉及一次過柱才能制得高純度HA。美國專利No.5316926描述的純化方法包括向發酵液中加入0.01％的硫酸月桂酯(SLS)表面活性劑以分離附著在細胞壁上的透明質酸，然后加入陽離子表面活性劑氯代十六烷基吡啶以形成透明質酸沉淀，并用醇使其沉淀。該過程也另外包括三次過濾和四次醇沉，還需之前對莢膜用SLS處理。美國專利No.5411874描述了向發酵液中加入福爾馬林溶液殺菌，加入十二烷基硫酸鈉(SDS)使莢膜脫落，后經一次過濾、一次超濾、一次絡合和三次醇沉及后得到的HA，蛋白較高約為0.2％(蛋白/HA(g/g))，為化妝品級HA。美國專利No.4157296公開的一種純化透明質酸的方法包括用三氯乙酸處理膿鏈球菌的培養液以除去菌株，然后用有機溶劑使其沉淀。此法通過調節發酵液pH殺菌，但由于也需大量重復使用有機溶劑進行沉淀，導致成本高并且非常耗時。膜技術可純化HA，但一般均是作為一種輔助分離手段，用于菌體或小分子量去除，仍需有機溶劑進行分離。如美國專利No.4517295、No.4801539等，采用MWCO10000，20000，30000Da超濾膜滲濾去除小分子物質。但美國專利No.6489467描述了一種無須使用有機溶劑，而是通過調節HA的pH至2.5使HA性狀改變并使用超濾進行提純的方法，但濾速很慢很耗時，不利于大規模生產，且HA不宜長期處于pH為2.5環境中，易導致分子量降解。中國專利200610057913.2和200610090586.0也描述了調節HA的pH至3，在電場和磁場的幫助下進行超濾，以加大濾速，同時避免了使用有機溶劑，但是濾速仍然僅為25.8L/(m2·h)，不利于放大。日本專利早期公開No.63-012293描述了一種通過使用大網狀陰離子交換樹脂(DianionHPA-25、HPA-75、IRA-900、IRA-904)處理含透明質酸的溶液以除去分子量等于或小于1500000Da的低分子量透明質酸及發熱物質的方法。韓國專利No.10-2002-0048915描述了發酵液經活性炭處理、芳族吸附樹脂處理、超濾作用及乙醇沉淀作用等得到高純度HA。
然而，無論提取法還是發酵法，在生產過程中都包含了反復的乙醇沉淀和選擇性沉淀。工藝路線較長、復雜、費時，成本高；采用較多有機溶劑，易造成二次污染。致使透明質酸的生產成本仍然很高，嚴重限制了透明質酸應用范圍。各種替代方法如采用一些較貴的性能穩定的吸附樹脂或離子交換樹脂進行除雜，或采用冷凍離心、pH調控、超濾等方法除雜，所得產品純度高，但HA得率和分子量損失率則因操作步驟多而有所不足，又涉及復雜的處理過程和處理設備，從而加大了生產成本。
發明內容
本發明的目的在于提供一種從微生物發酵液中收集透明質酸的方法，以克服現有技術存在的上述缺陷。
本發明的方法包括如下步驟(1)對含有透明質酸的發酵液，通過氯代十六烷基吡啶進行絡合或通過乙醇進行醇沉；(2)收集絡合物或醇沉物，加入氯化鈉水溶液，使絡合物或醇沉物的解離或溶解；
(3)收集解離物或溶解物中的透明質酸沉淀，用水溶解，干燥，獲得目標產物；所說的透明質酸的分子量為1～3MDa。
所說的發酵液可以采用田毅紅2004年發表在《中國醫藥工程雜志》上的《高分子量透明質酸的發酵研究》報道的方法，進行制備；所說的透明質酸的分子量為1～3MDa；所說的氯代十六烷基吡啶(簡稱CPC)可采用市售產品，如國藥集團化學試劑有限公司的產品；優選的，本發明的方法包括如下步驟(1)將含有透明質酸的發酵液加水稀釋至透明質酸的含量為0.3～0.5g/ml，然后加入氯代十六烷基吡啶；攪拌，絡合；CPC與透明質酸的重量比為HA∶CPC＝1∶1.5～1∶2.5；(2)將步驟(1)的產物離心分離，收集固體絡合物；(3)加入濃度為0.4～1M的氯化鈉水溶液至原發酵液體積的0.9～1.1倍，絡合物解離，獲得HA溶液；(4)加入乙醇，加量為HA溶液∶乙醇＝1∶2，體積比，攪拌，沉淀，得到纖維狀HA沉淀物；(5)加入0.1～0.2M氯化鈉至兩倍的發酵液體積，攪拌至沉淀溶解；(6)在溶解液中加入珍珠巖和活性炭，攪拌，過濾，得到濾液；所說的珍珠巖選白2號珍珠巖或4號珍珠巖中的一種以上，加入量為2～4g/L，活性炭的加入量為1.5～2.5g/L；(7)向濾液中加入乙醇，加量為HA溶液∶乙醇＝1∶1.5～2.5，體積比，攪拌后得到HA沉淀；(8)用水溶解沉淀，噴霧或真空干燥得醫用級HA干粉。
所得HA干粉1.2g，葡糖醛酸純度約44.5％，HA得率為91％，分子量為2.07MDa，分子量損失率為13％，蛋白/HA(g/g)＝0.04％。
優選的，本發明的方法包括如下步驟(1)將含有透明質酸的發酵液加水稀釋至透明質酸的含量為0.3～0.5g/ml，然后加入氯代十六烷基吡啶；攪拌，絡合；CPC與透明質酸的重量比為HA∶CPC＝1∶1.5～1∶2.5；
(2)將步驟(1)的產物離心分離，收集固體絡合物；(3)加入0.4～1M的氯化鈉水溶液至1.8～2.2倍的原發酵液體積，絡合物解離，獲得HA溶液；(4)在步驟(3)的溶液中加入珍珠巖和活性炭，攪拌，過濾，收集濾液；所說的珍珠巖選自2號珍珠巖或4號珍珠巖中的一種以上，加入量為2～4g/L，活性炭的加入量為1.5～2.5g/L；(5)在濾液中加入氧化鋁，加量為HA∶氧化鋁＝1∶4～1∶8(g/g)，另加入1～2g/L活性炭，攪拌，過濾，收集濾液；(6)向濾液中加入乙醇，加量為HA溶液∶乙醇＝1∶1.5～2.5，體積比，攪拌后得到HA沉淀；7)用水溶解沉淀，噴霧或真空干燥得醫用級HA干粉。
所得HA干粉2.18g，葡糖醛酸純度約46.1％，HA得率為91％，分子量為1.92MDa，分子量損失率為10.1％，蛋白/HA(g/g)＝0.0％。
優選的，本發明的方法包括如下步驟(1)將含有透明質酸的發酵液加入乙醇，加量為HA溶液∶乙醇＝1∶1.5～2.5，體積比，攪拌后得到纖維狀HA沉淀；(2)加入0.1～0.2M的氯化鈉水溶液至1.8～2.2倍的原發酵液體積，攪拌，沉淀溶解；(3)在步驟(2)的溶液中加入珍珠巖和活性炭，攪拌，過濾，得到濾液；所說的珍珠巖選自2號珍珠巖或4號珍珠巖中的一種以上，加入量為2～4g/L，活性炭的加入量為1.5～2.5g/L，過濾，收集濾液；(4)在步驟(3)的濾液中加入氧化鋁，加量為HA∶氧化鋁＝1∶4～1∶8(g/g)，另加入1～2g/L活性炭，攪拌，過濾，收集濾液；(5)向濾液中加入乙醇，向濾液中加入乙醇，加量為HA溶液∶乙醇＝1∶1.5～2.5，體積比，攪拌后得到HA沉淀；(6用水溶解沉淀，噴霧或真空干燥得醫用級HA干粉。
所得HA干粉2.2g，葡糖醛酸純度約45.9％，HA得率為92％，分子量為1.90MDa，分子量損失率為11.1％，蛋白/HA(g/g)＝0.0％。
本發明采用直接對發酵液進行絡合或醇沉操作，既能脫色、使蛋白變性殺菌利于后續過濾除去蛋白，又能保證HA得率，因發酵液所含HA濃度高，HA經醇沉，幾乎可完全沉淀。因此避免了采用酸化處理或高溫進行殺菌，防止HA遭到降解；也避免了加入福爾馬林溶液、SDS或SLS這些殺菌劑或表面活性劑，防止二次污染；避免了對發酵液先過濾后沉淀導致的HA得率較低，因過濾操作需要對發酵液進行稀釋，這樣得到的濾液所含HA的濃度就較低，此時加乙醇進行沉淀會導致HA得率較低，若濾液經薄膜濃縮后再沉淀，則增加了操作成本。
采用一次絡合、一次過濾和兩次沉淀的方法時，將發酵液直接用CPC絡合，CPC絡合HA關鍵在于控制好溶液離子強度，因此只要將發酵液稀釋足夠倍數(10倍)后加入CPC即可生成絡合物，且CPC的用量只與發酵液中HA的總質量有關，因此發酵液稀釋并不會加大CPC用量。絡合后將絡合物解離到原發酵液體積，此時再用乙醇沉淀，由于不是沉淀發酵液的稀釋液，保證了HA高濃度，節省了乙醇的用量，且HA得率高，蛋白去除率高。然后將沉淀物溶解后過濾，由于過濾的除蛋白效率取決于助濾劑和吸附劑的用量，當雜蛋白含量在吸附劑的吸附飽和范圍內時可一次性被除去，而CPC絡合或乙醇沉淀的除蛋白效率僅約25％，因此若將過濾安排在較為靠前的步驟中，則最終HA的蛋白去除率就只能達到95％左右，若要提高HA純度，需再次過濾或進行過吸附柱等操作進一步提純。過濾放在后面進行，除蛋白效率高，還因加入的助濾劑和活性炭等吸附劑更易于吸附變性后的蛋白，而此時蛋白早已得到了充分的變性。對發酵液先進行絡合而非醇沉，為了防止先醇沉后絡合，則絡合物的解離液通過僅有的一次過濾，多余的CPC未必能除盡，影響產品質量。采用一次過濾是為了提高生產效率，因為工業生產中過濾的時間過長或次數過多會直接導致生產效率低下。采用一次絡合、二次過濾和一次沉淀的方法，則主要考慮到有機溶劑使用成本高，污染大，通過增加一次過濾操作來替代一次醇沉，連續過濾可避免中間進行濃縮或其他操作，提高HA得率。采用二次過濾和二次沉淀的方法，則主要考慮到CPC較昂貴，大規模生產時若能避免使用，可以降低生產成本，于是采用醇沉來替代絡合。
采用簡單的設備和簡單的四步操作有序組合，就制得醫用級HA，且HA得率約90％，分子量損失率約15％，避免復雜的設備不利于放大或增加生產成本，無須煩瑣的步驟使HA得率降低，分子量損失率變大或大量使用有機溶劑增大成本，從而利于工業化放大生產透明質酸。
具體實施例方式
實施例1
1)取500ml發酵液，含HA2g，分子量為2.38MDa。發酵液用去離子水稀釋十倍2)加入CPC，加量為HA∶CPC＝1∶1.5(g/g)，攪拌絡合后，在3000rpm下離心20min后得到絡合物。
3)加入0.5M的氯化鈉至原發酵液體積，攪拌至解離4)加入乙醇，加量為HA溶液∶乙醇＝1∶2(v/v)，攪拌后得到纖維狀HA沉淀；5)加入0.1M氯化鈉至兩倍的發酵液體積，攪拌至沉淀充分溶解。
6)在溶解液中加入3g/L的2號珍珠巖，3g/L的4號珍珠巖和2g/L的活性炭，攪拌兩小時后，用紙板過濾，得到濾液。
7)向濾液中加入乙醇，加量為HA溶液∶乙醇＝1∶2(v/v)，攪拌后得到HA沉淀8)用純水溶解沉淀，噴霧或真空干燥得醫用級HA干粉。
所得HA干粉1.2g，葡糖醛酸純度約44.5％，HA得率為91％，分子量為2.07MDa，分子量損失率為13％，蛋白/HA(g/g)＝0.04％。
實施例21)取500ml發酵液，含HA2.4g，分子量為2.14MDa。發酵液需先用去離子水稀釋十倍2)加入CPC，加量為HA∶CPC＝1∶1.5(g/g)，攪拌絡合后，在3000rpm下離心20min后得到絡合物。
3)加入0.5M氯化鈉至兩倍的發酵液體積，攪拌至沉淀溶解；4)在溶解液中加入3g/L的2號珍珠巖，3g/L的4號珍珠巖和2g/L的活性炭，攪拌兩小時后，用紙板過濾，得到初濾液。
5)在初濾液中加入氧化鋁，加量為HA∶氧化鋁＝1∶5(g/g)，另加入1～2g/L活性炭，攪拌2小時后，用紙板過濾得到濾液；6)向濾液中加入乙醇，加量為HA溶液∶乙醇＝1∶2(v/v)，攪拌后得到HA沉淀7)可用純水溶解沉淀，噴霧或真空干燥得醫用級HA干粉。
所得HA干粉2.18g，葡糖醛酸純度約46.1％，HA得率為91％，分子量為1.92MDa，分子量損失率為10.1％，蛋白/HA(g/g)＝0.0％。
實施例31)取500ml發酵液，含HA2.4g，分子量為2.14MDa。發酵液不稀釋2)發酵液中加入乙醇，加量為HA溶液∶乙醇＝1∶2(v/v)，攪拌后得到纖維狀HA沉淀；3)加入0.1M氯化鈉至兩倍的發酵液體積，攪拌至沉淀溶解；4)在溶解液中加入3g/L的2號珍珠巖，3g/L的4號珍珠巖和2g/L的活性炭，攪拌兩小時后，用紙板過濾，得到初濾液。
5)在初濾液中加入氧化鋁，加量為HA∶氧化鋁＝1∶5(g/g)，另加入1～2g/L活性炭，攪拌2小時后，用紙板過濾得到濾液；6)向濾液中加入乙醇，加量為HA溶液∶乙醇＝1∶2(v/v)，攪拌后得到HA沉淀7)此后可用純水溶解沉淀，噴霧或真空干燥得醫用級HA干粉。
所得HA干粉2.2g，葡糖醛酸純度約45.9％，HA得率為92％，分子量為1.90MDa，分子量損失率為11.1％，蛋白/HA(g/g)＝0.0％。
權利要求
1.從微生物發酵液中分離提取透明質酸的方法，其特征在于，包括如下步驟(1)對含有透明質酸的發酵液，通過氯代十六烷基吡啶進行絡合或通過乙醇進行醇沉；(2)收集絡合物或醇沉物，加入氯化鈉水溶液，絡合物或醇沉物的解離或溶解；(3)收集解離物或溶解物中的透明質酸沉淀，用水溶解，干燥，獲得目標產物；所說的透明質酸的分子量為1～3MDa。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，本發明的方法包括如下步驟(1)將含有透明質酸的發酵液加水稀釋至透明質酸的含量為0.3～0.5g/ml，然后加入氯代十六烷基吡啶；攪拌，絡合；(2)將步驟(1)的產物離心分離，收集固體絡合物；(3)加入濃度為0.4～1M的氯化鈉水溶液至原發酵液體積的0.9～1.1倍，絡合物解離，獲得HA溶液；(4)加入乙醇，加量為HA溶液∶乙醇＝1∶2，體積比，攪拌，沉淀，得到纖維狀HA沉淀物；(5)加入0.1～0.2M氯化鈉至1.8～2.2倍的發酵液體積，攪拌至沉淀溶解；(6)在溶解液中加入珍珠巖和活性炭，攪拌，過濾，得到濾液；(7)向濾液中加入乙醇，加量為HA溶液∶乙醇＝1∶1.5～2.5，體積比，攪拌后得到HA沉淀；(8)用水溶解沉淀，噴霧或真空干燥得醫用級HA干粉。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，CPC與透明質酸的重量比為HA∶CPC＝1∶1.5～1∶2.5。
4.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所說的珍珠巖選自2號珍珠巖或4號珍珠巖中的一種以上，加入量為2～4g/L，活性炭的加入量為1.5～2.5g/L。
5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，本發明的方法包括如下步驟(1)將含有透明質酸的發酵液加水稀釋至透明質酸的含量為0.3～0.5g/ml，然后加入氯代十六烷基吡啶；攪拌，絡合；(2)將步驟(1)的產物離心分離，收集固體絡合物；(3)加入0.4～1M的氯化鈉水溶液至1.8～2.2倍的原發酵液體積，絡合物解離，獲得HA溶液；(4)在步驟(3)的溶液中加入珍珠巖和活性炭，攪拌，過濾，收集濾液；(5)在濾液中加入氧化鋁，加量為HA∶氧化鋁＝1∶4～1∶8(g/g)，另加入1～2g/L活性炭，攪拌，過濾，收集濾液；(6)向濾液中加入乙醇，加量為HA溶液∶乙醇＝1∶1.5～2.5，體積比，攪拌后得到HA沉淀；(7)用水溶解沉淀，噴霧或真空干燥得醫用級HA干粉。
6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，CPC與透明質酸的重量比為HA∶CPC＝1∶1.5～1∶2.5。
7.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所說的珍珠巖選自2號珍珠巖或4號珍珠巖中的一種以上，加入量為2～4g/L，活性炭的加入量為1.5～2.5g/L。
8.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，包括如下步驟(1)將含有透明質酸的發酵液加入乙醇，加量為HA溶液∶乙醇＝1∶1.5～2.5，體積比，攪拌后得到纖維狀HA沉淀；(2)加入0.1～0.2M的氯化鈉水溶液至1.8～2.2倍的原發酵液體積，攪拌，沉淀溶解；(3)在步驟(2)的溶液中加入珍珠巖和活性炭，攪拌，過濾，得到濾液；(4)在步驟(3)的濾液中加入氧化鋁，加量為HA∶氧化鋁＝1∶4～1∶8(g/g)，另加入1～2g/L活性炭，攪拌，過濾，收集濾液；(5)向濾液中加入乙醇，向濾液中加入乙醇，加量為HA溶液∶乙醇＝1∶1.5～2.5，體積比，攪拌后得到HA沉淀；(6)用水溶解沉淀，噴霧或真空干燥得醫用級HA干粉。
9.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所說的珍珠巖選自2號珍珠巖或4號珍珠巖中的一種以上，加入量為2～4g/L，活性炭的加入量為1.5～2.5g/L。
全文摘要
本發明提供了一種從微生物發酵液中分離提取透明質酸的方法，包括如下步驟(1)對含有透明質酸的發酵液，通過氯代十六烷基吡啶進行絡合或通過乙醇進行醇沉；(2)收集絡合物或醇沉物，加入氯化鈉水溶液，絡合物或醇沉物的解離或溶解；(3)收集解離物或溶解物中的透明質酸沉淀，用水溶解，干燥，獲得目標產物。采用簡單的設備和簡單的四步操作有序組合，就制得醫用級HA，且HA得率約90％，分子量損失率約15％，避免復雜的設備不利于放大或增加生產成本，無須繁瑣的步驟使HA得率降低，分子量損失率變大或大量使用有機溶劑增大成本，從而利于工業化放大生產透明質酸。
文檔編號C12P19/00GK101089021SQ200710043728
公開日2007年12月19日 申請日期2007年7月12日 優先權日2007年7月12日
發明者譚文松, 胡怡虹, 張旭, 蔡海波 申請人:華東理工大學