表達重組人凝血因子vii的畢赤酵母及其制法和應用的制作方法

專利名稱：：表達重組人凝血因子vii的畢赤酵母及其制法和應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及生物工程和免疫領域，具體而言涉及一種表達重組人凝血因子vn的酵母細胞、用于轉化酵母細胞的構建物以及它們的構建方法和應用。
背景技術：
：凝血因子VII(FVII)是一個維生素K依賴性的具有絲氨酸蛋白水解酶作用的酶原，它主要在肝臟中合成。血漿中的大部分FVII是單鏈無活性的酶原，濃度為0.5ug/ml(10nmol/l)的濃度。血漿中具有痕量的活化FVIIa，濃度為10-110pmo1/1。在血管受損后，組織因子(TF)暴露，FVII或活化FVII(FVIIa)能與TF形成復合物，并在FXa、凝血酶等作用下，在FVII鏈的精氨酸152和異亮氨酸153位點處裂解成雙鏈而被活化。原丙氨酸l精氨酸152位的殘基組成FVIIa的輕鏈，分子量為20kD;異亮氨酸153脯氨酸406位的殘基組成FVIIa的重鏈，分子量為30kD。輕鏈和重鏈由一個二硫鍵連接(135和262位半胱氨酸間的二硫鍵)。自凝血瀑布學說提出以來，FVII—直被看作外源性凝血途徑的起始酶。在鈣離子、磷脂存在的條件下，FVIIa可與組織因子(TF)結合形成復合物(FVIIa-TF)，并將FX活化為FXa。隨即相繼激活凝血酶原和纖維蛋白原，導致血凝塊形成。以后的研究還發現FVIIa-TF可激活FIX。大量的研究結果證明FVIIa激活FIX的途徑與激活FX的途徑具有同等重要的意義。FVIIa除通過活化FX啟動凝血瀑布外，還通過活化FIX放大凝血的酶促反應。從而在血凝塊生成的內、外途徑中均扮演了必不可少的角色。傳統的血源性FVIIa因含量低，并有傳播血液傳染病的危險，從而迫使人們轉向基因重組產品。重組凝血因子VIIa(rFVIIa)在1999年由美國FDA批準上市，用于治療血友病及伴有抑制物患者的出血治療。此后rFVIIa被證明能增加已被激活的血小板上凝血酶的生成，可用于血小板減少癥及血小板功能障礙患者出血時的治療。rFVIIa也被證實可以成功地用于治療手術時的急性出血情況。因此rFVIIa在臨床止血方面的應用越來越受到人們的重視。目前市場上只有丹麥的Novo公司用倉鼠腎細胞(BHK)表達出rFVIIa，經純化后制備的產品價格比較昂貴。本領域迫切需要為患有威脅生命的凝血系統缺陷病人以及手術期大量失血的患者開發出新的低成本的治療性重組FVII。雖然目前已發展了多種蛋白質表達系統來生產生物體的外源蛋白，比如大腸埃希氏菌表達系統，酵母表達系統，高等真核細胞表達系統等，但這些系統仍存在某些有待改進的缺陷。例如大腸桿菌作為宿主可表達多種蛋白，但是其存在(l)缺少真核生物的蛋白翻譯后的修飾和加工，如剪切、糖基化、形成二硫鍵等；(2)表達的蛋白多形成不溶性包涵體，需要經過復雜的復性才能恢復構象和活性；(3)菌體蛋白較不利于純化等缺點。而釀灑酵母系統也具有局限性(l)產量通常較低；(2)表達質粒易于丟失；(3)缺乏強有力的受嚴格調控的啟動子；(4)外源蛋白過度糖基化修飾會嚴重的改變蛋白質的免疫原性、降低活性、縮短滯留時間；(5)分泌效率差，純化困難。為了克服以上系統的這些缺點，人們一方面不斷地表達系統進行改造和完善，另一方面也在尋找一些可替代釀酒酵母的其他非傳統酵母。其中以嗜甲醇酵母研究得最多。嗜甲醇酵母是指能夠利用甲醇作為唯一的碳源和能源的酵母。這類酵母菌分為四屬念珠菌屬(C朋力Va)、漢遜酵母屬(〃朋^/7"7a)、畢赤酵母屬(尸/c力a)以及球擬酵母屬(7br"/oAW、)。如何應用這些新的表達系統來高效表達所需目的基因，也是本領域中急需摸索和研究的問題。而在重組蛋白表達領域，要獲得高表達量的表達載體更是取決于眾多因素。例如所表達蛋白質的性質、所采用的表達方式有關、所采用的表達盒中的各元件、表達盒中各元件的組合方式、高拷貝克隆中各拷貝的排列方式等。綜上所述，本領域仍然迫切需要開發出成本更低廉、步驟更簡便、表達量更高的FVIT生產方法。
發明內容本發明的目的正是提供一種穩定高表達FVII的酵母細胞及其制備方法，由此提高FVII的表達量及產量。在本發明的第一方面，提供了一種表達人凝血因子VII的酵母細胞，所述酵母細胞的染色體中整合有表達人凝血因子VII的構建物，所述構建物含有2-15個串聯排列的人凝血因子VII表達盒，每個所述人凝血因子VII表達盒從5'到3'依次包括以下元件(a)起始信號元件AOX;(b)人凝血因子vn基因；和(c)終止信號元件A0X(TT);并且所述酵母細胞在誘導下表達具有凝血活性的人凝血因子VII。在本發明的另一個優選例中，所述構建物中含有3-10個，最優選3-8個串聯排列的人凝血因子VII表達盒。在本發明的一個實施方式中，所述酵母細胞選自畢赤酵母、釀酒酵母、球擬酵母、或漢遜酵母。在本發明的一個優選例中，所述酵母細胞為畢赤酵母。在本發明的另一個優選例中，優選GS115菌株、SMD1163菌株，更優選為GS115菌株。在本發明的另一個優選例中，所述酵母的表達由甲醇誘導。在本發明的另一個實施方式中，所述人凝血因子VII基因包含SEQIDN0:1所示的序列。在本發明的另一實施方式中，所述人凝血因子VII基因包含GenBank號NM019616所示的序列。在本發明的一個優選例中，所述構建物是以pPIC9K質粒為基礎構建的。在本發明的另一個優選例中，所述FVII基因直接融合pPIC9K表達載體信號肽a因子的第一個信號肽切除位點后，其分泌蛋白N端不帶有信號肽殘余氨基酸。在本發明的另一個優選例中，所述FVII基因所對應的分泌蛋白N端帶有不均一氨基酸殘基，所述不均一氨基酸殘基不影響FVII的功能，優選為式(Glu-AlaV所示的重復序列，其中n為l-5之間的整數。在本發明的另一個優選例中，所述人凝血因子VII具有天然凝血因子的促凝血功能。在本發明的一個優選例中，所表達的人凝血因子VII的氨基酸序列包含SEQIDNO:2所示的氨基酸序列，優選與SEQIDNO:2所示序列相同。在本發明的第二方面，提供了一種酵母細胞群，所述的細胞群中90-100%的酵母細胞是前述的本發明的表達人凝血因子VII的酵母細胞，并且90-100%所述酵母細胞中人凝血因子VII表達盒的拷貝數是相同的或基本相同的。在本發明的一個優選例中，95-100%的酵母細胞是前述的本發明的表達人凝血因子VII的酵母細胞，更優選99-100%。在本發明的另一個優選例中，95-100%，優選99-100%所述酵母細胞中人凝血因子VII表達盒的拷貝數是相同的或基本相同的。在本發明的第三方面，提供了一種制備重組人凝血因子VII的方法，所述方法包括步驟(i)在適合表達的條件下，培養前述的本發明的表達重組人凝血因子VII的酵母細胞，從而表達重組人凝血因子VII;和(ii)從培養物中分離出重組人凝血因子VII。在本發明的第四方面，提供了一種重組人凝血因子VII，所述重組凝血因子VII是用前述的方法制備的。在本發明的第五方面，提供了前述重組人凝血因子VII在制備促凝血的藥物組合物中的用途。在本發明的第六方面，提供了一種構建物，所述構建物含有2-15個串聯排列的人凝血因子VII表達盒，每個所述人凝血因子VII表達盒從5'到3'依次包括以下元件(a)起始信號元件AOX;(b)人凝血因子VII基因；禾口(c)終止信號元件AOX(TT)。在本發明的一個優選例中，所述構建物中含有3-10個，最優選3-8個串聯排列的人凝血因子VII表達盒。在本發明的第七發明，提供了一種構建前述構建物的方法，當所述構建物為多拷貝表達質粒時，所述方法包括(1)將人凝血因子VII基因定點插入包含起始信號元件A0X和終止'信號元件AOX(TT)的質粒中，以獲得單拷貝表達質粒；(2)對所述單拷貝表達質粒進行改造以獲得完整的人凝血因子VII表達盒，其中，所述表達盒從5'到3'依次包含以下元件(a)起始信號元件AOX;(b)人凝血因子VII基因；和(C)終止信號元件AOX(TT);(3)將所述人凝血因子VII表達盒重復插入所述質粒中，從而獲得含有2-15個串聯排列的人凝血因子VII表達盒的構建物。在本發明的另一優選例中，所采用的質粒選自pPIC9K、pPIC3.5K、pA0815或pIl化-Sl，只要其含有起始信號元件AOX和終止信號元件AOX(TT);優選pPIC9K質粒。在本發明的另一優選例中，所述人凝血因子VII基因包含SEQIDNO:1所示的核苷酸序列。在本發明的另一優選例中，步驟(2)中對所述單拷貝表達質粒進行改造是通過PCR進行的。在本發明的另一優選例中，步驟(3)中將所述人凝血因子VII表達盒重復插入所述質粒中是通過同尾酶定點插入進行的。在本發明的第八方面，提供了一種前述的本發明的表達人凝血因子VII的酵母細胞的制備方法，所述方法包括步驟用前述的本發明構建物轉化酵母細胞，使所述的構建物整合入酵母染色體中，從而獲得本發明表達人凝血因子vn的酵母細胞。在本發明的一個優選例中，所述轉化是通過電轉化或原生質體轉化進行的。在本發明的另--優選例中，所述方法還包括用誘導物誘導所述酵母細胞表達人凝血因子VII的步驟。在本發明的另--優選例中，所述誘導物為甲醇。圖l:質粒pPIC9/FVII和pPIC9/Glu-Ala-Glu-Ala-FVI1Xholl、EcoRI酶切結果。泳道l-2:Xholl、EcoRI酶切的pPIC9/FVII;泳道3:lkbDNALadder;泳道4-5:Xholl、EcoRI酶切的pPIC9/Glu-Ala-Glu-Ala-FVn。圖2:通過插入重組產生重組酵母甲醇利用表型His+Mut+表型的示意圖。圖3:通過取代重組產生重組酵母甲醇利用表型His+Muts表型的示意圖。圖4:重組酵母PCR擴增產物的表型鑒定。其中泳道1-4:pPIC9K/Glu-Ala-Glu-Ala-FVII重組質粒(l是Mut+表型)；泳道5:pPIC9K/FVII重組質粒(MutS表型)；泳道6:lkbDNALadder;泳道7:pPIC9K空質粒；泳道8:pPIC9K/FVII重組質粒(Mut+表型)；泳道9-10:陰性表達重組體(MutS表型)；泳道ll:GS115空菌株。圖5:pPIC9K/FVn重組體和pPIC9K/Glu-Ala-Glu-Ala-FVII重組體在GS115菌株中的表達(96h)。圖5A:SDS-PAGE銀染結果；圖5B:蛋白質印跡結果。圖6:pPIC9K/FVII重組體和pPIC9K/Glu-Ala-Glu-Ala-FVI1重組體在SMD1163菌株中的表達(96h)。圖6A:SDS-PAGE銀染結果；圖6B:蛋白質印跡結果。圖7:人凝血因子VII高拷貝重組子的構建流程圖。圖8:多拷貝重組體的酶切鑒定。泳道l:l拷貝；泳道2:2拷貝；泳道3:3拷貝；泳道4:lkbDNALadder;泳道5:4拷貝；泳道6:5拷貝。圖9:以蛋白質印跡法測定的多拷貝重組體蛋白搖瓶表達情況(96h上清)。圖10:FVII活性與凝血時間的雙對數標準曲線圖。具體實施例方式本發明人經長期而深入的研究，篩選了大量由不同元件構成的表達盒，獲得了可高效表達人凝血因子vn的表達盒。該表達盒(尤其是串聯排列的表達盒)，可使得該酵母細胞高表達具有活性的人凝血因子vn。此外，本發明還用分子生物學遺傳重組的方法獲得整合有表達人凝血因子vn的構建物的酵母細胞，且所述構建物含有2-15個串聯排列的人凝血因子vn表達盒。本發明人在此基礎上，完成了本發明。具體而言，現有技術中畢赤酵母比較多見的高拷貝篩選方法是將單拷貝重組表達質粒轉化入酵母中后，會隨機產生單拷貝或未知數目多拷貝的重組體，再用梯度濃度的抗生素G418進行篩選，選出抗性最強的即為高拷貝子，但可能選出的為混合拷貝數。當低拷貝與高拷貝混合表達時，低拷貝的生長速率快于高拷貝，會占優勢，影響高拷貝的分泌表達量的提高。為此，本發明人通過PCR擴增獲得人凝血因子FVII基因，插入含A0X1啟動子的畢赤酵母分泌表達載體pPIC9K中，構建成表達蛋白N端殘余氨基酸不同的多種重組表達質粒(例如pPIC9K/FVI1、pPIC9K/Glu-Ala-FVII和pPIC9K/Glu-Ala-Glu-Ala-FVII),并轉入畢赤酵母宿主菌(例如GS115和SMD1163)，對獲得的重組畢赤酵母進行陽性克隆表型鑒定。挑取Mut'表型的重組克隆搖瓶培養，甲醇誘導表達。通過SDS-PAGE、蛋白質等方法鑒定表達產物，比較N端均一性對目的蛋白表達的影響及其在不同菌株中表達情況的差異。在此基礎上，選出表達情況較好的重組體及酵母菌株，進一步構建2至15個表達單元串聯的高拷貝重組體。這些重組體不含低拷貝與高拷貝重組體的混合物，是均一的重組體。因此在表達時，避免了混合拷貝重組體中所存在的因為低拷貝重組體的存在而影響高拷貝重組體的生長速率和分泌表達量的問題。探討表達單元拷貝數與表達量之間的關系，并對發酵表達產物進行了活性測定。研究結果表明，本發明的真核表達載體轉化的重組酵母經甲醇誘導后均可表達目的蛋白凝血因子FVII。N端信號肽殘余氨基酸并不影響表達，N端無信號肽殘余氨基酸的pPIC9K/FVI1重組體表達量高于其它重組體(例如pPIC9K/Glu-FVI1)。串聯了2至15個不同拷貝數的高拷貝重組酵母，搖瓶表達顯示，隨著拷貝數的增加，表達量呈拋物線狀增加。活性測定表明表達重組FVII有生物活性，并且活性隨蛋白濃度增高而呈遞增趨勢。以上研究表明Fvn可以在畢赤酵母中分泌表達，并且表達產物具有生物活性，用此途徑生產的重組凝血因子Fvn具有生產性潛力。人凝血因子vii如本文所用，術語"人凝血因子vn"、"Fvn"可互換使用，均指包含本發明SEQIDN0:2所示的氨基酸序列，且可促進機體凝血作用的蛋白質。在本發明的一個實施方式中，所述的人凝血因子VII與天然存在于人體內的因子具有相同的結構。在本發明的另一個實施方式中，所述人凝血因子VII的N端-一級結構可不同于天然人凝血因子vii，但其能在本發明的酵母細胞中表達，并具有與天然人凝血因子VII相同或類似的功能。如本文所用，術語"人凝血因子vn基因"、"fvii基因"可互換使用，均指包含本發明SEQIDN0:1所示的序列或GenBank號NM—019616所示的序列，且可表達產生本發明的人凝血因子VII的核苷酸序列。在本發明的一個實施方式中，可通過常規分子生物學方法獲得所述的人凝血因子VII基因，所述方法可按照常規條件如Sambrook等人，《分子克隆實驗室指南》(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件進行。在本發明的一個實施方式中，所述FVII基因直接融合在pPIC9K表達載體信號肽a因子的第一個信號肽切除位點后，其分泌蛋白N端不帶有信號肽殘余氨基酸。而在本發明的另一個實施方式中，所述FVII基因所對應的分泌蛋白N端帶有不均一氨基酸殘基，所述不均一氨基酸殘基不影響FVII的功能，優選為式(Glu-Ala)n-所示的重復序列，其中n為l-5之間的整數。人凝血因子VII表達盒及其制備如本文所用，術語"人凝血因子vn表達盒"是指通過本發明方法獲得的從5'到3'依次具有以下元件的表達盒(a)起始信號元件AOX;(b)人凝血因子VII基因；(c)終止信號元件AOX(TT)。其中所述的人凝血因子VII基因包含SEQIDNO:1所示的序列或包含GenBank號NM—019616所示的序列。本發明表達盒的制備方法包括如下步驟(1)將人凝血因子VII基因定點插入包含起始信號元件A0X和終止信號元件AOX(TT)的質粒中，以獲得單拷貝表達質粒；(2)對所述單拷貝表達質粒進行改造以獲得完整的人凝血因子VII表達在本發明的優選實施方式中，所采用的質粒可為pPIC9K、pPIC3.5K、pA()815或pHIL-Sl等，只要其含有起始信號元件A0X和終止信號元件A0X(TT);優選pPIC9K質粒。可將人凝血因子VII基因定點插入質粒的5'A0X1和3'A0X(TT)之間，優選插入BamHI酶切位點與EcoRl酶切位點之間。可采用PCR方法等常規方法從己構建的單拷貝表達質粒中擴增帶有終止信號元件3'A0X(TT)的FVII基因，并改變兩端的酶切位點。在本發明的優選實施方式中，優選片段5'端為BglII位點，3'端為BamHI位點，將該片段插入BamHI位點，獲得在3'A0X(TT)的3'端帶有BamHI位點的單拷貝表達質粒。如需使用EcoRI/Miml等其它同尾酶，則需對質粒及片段進行進一步改造。表達人凝血因子VII的構建物及其構建如本文所用，術語"構建物"、"本發明的構建物"和"表達人凝血因子VII的構建物"可互換使用，均指通過分子生物學方法構建的含有2-15個串聯排列的本發明的人凝血因子VII表達盒的構建物。在本發明的一個優選例中，所述構建物中優選含有2-15個(如2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、13、14或15個)，更優選3-10個，最優選3-8個串聯排列的人凝血因子VII表達盒。可通過將上文所述的人凝血因子VII表達盒重復插入質粒中來本發明的人凝血因子VII表達盒的構建物。在本發明的優選實施方式中，采用同尾酶、平末端連接等方法將所述人凝血因子VU表達盒重復插入所述質粒中，優選采用同尾酶。在本發明的另一優選實施方式中，所述方法還包括用大腸桿菌擴增所得的構建物。表達人凝血因子VII的酵母細胞及其制備如本文所用，術語"人凝血因子vn表達酵母細胞"、"本發明的酵母細胞"可互換使用，均指具有如下特征的表達人凝血因子vn的酵母細胞所述酵母細胞中整合有表達人凝血因子vn的本發明的構建物，并且所述酵母細胞在甲醇誘導下表達人凝血因子vn，并具有與天然人凝血因子vn相同或相似的功能。本發明表達人凝血因子vn的酵母細胞的制備方法包括步驟用本發明的構建物轉化酵母細胞，以獲得表達人凝血因子vn的酵母細胞。所述轉化可采用電轉化、原生質體轉化等本發明常規的轉化方法進行。在本發明的優選實施方式中，可采用選自下組的酵母細胞畢赤酵母、釀酒酵母或漢遜酵母，優選采用畢赤酵母，例如GS115菌株、S腦1163菌株(優選GS115菌株)。在本發明的優選實施方式中，還提供了一種酵母細胞群，所述的細胞群中90-10(T/。的酵母細胞是本發明表達人凝血因子Vn的酵母細胞，并且90-100%所述酵母細胞中人凝血因子vn表達盒的拷貝數是相同的或基本相同的。本文所用術語拷貝數"基本相同"是指所述酵母細胞中人凝血因子vn表達盒的拷貝數可具有土l個拷貝數的差異。在本發明的另一個優選實施方式中，95-100%的酵母細胞是本發明表達人凝血因子VII的酵母細胞，更優選99-100%。在本發明的另一個優選實施方式中，95-100%，優選99-100。/。所述酵母細胞中人凝血因子VII表達盒的拷貝數是相同的或基本相同的。即本發明的多拷貝酵母細胞群具有拷貝數的均一性。本發明的優點本發明的優點在于1.通過重組技術插入不同拷貝數本發明的人凝血因子VII基因表達盒而獲得的酵母細胞，出乎意料地獲得了高表達量且表達產物具有高活性；2.本發明的重組體具有均一的拷貝數，與產生混合拷貝數重組體混合物的常規高拷貝篩選方法相比，避免了常規重組體混合物中存在的低拷貝重組體抑制高拷貝重組體生長和分泌目標蛋白的問題；3.利用本發明的酵母細胞生產人凝血因子VII表達量高、成本低廉、生產步驟簡便穩定，適于工業化生產。實施例下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件(例如可參考通常按照常規條件如Sambrook等人，《分子克隆實驗室指南》(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件)、或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。實施例l.N端一級結構不同的重組人凝血因子VII在畢赤酵母不同菌株中的分泌表達i.Pc財廣增Fvn目的基因i.i引物設計參照人凝血因子VII全基因序列(SEQIDN0:1)設計引物，由上海生工合成。引物l<formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula>引物25'-GCCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTGCCAACGCGTTC-3'(SEQIDNO:4)XholGluAlaGluAla引物35'-GCGAATTCGCTGCTGGGCTAGGGAAATGG-3'(SEQIDNO:5)EcoRI1.2PCR反應用P1、P3引物進行PCR，擴增得到pPIC9K/FVII目的基因(不含Glu-Ala重復序列)；用P2、P3引物擴增得到pPIC9K/Glu-Ala-Glu-Ala-FVII目的基因(含Glu-Ala重復序列)。PCR反應體系如下<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>PCR反應條件為94。C預變性5分鐘；94。C變性30秒，55。C復性30秒，72。C延伸卯秒，30個循環；72t:延伸10分鐘；4'C保溫。反應結束后，取5y1擴增產物于1%瓊脂糖凝膠電泳，電壓80V，15分鐘，紫外燈下觀察鑒定。結果顯示擴增出了與1250bp的FVII基因大小相符的片段。1.3PCR擴增產物的回收純化用北京博大泰克生物基因技術有限責任公司的A型PCR產物快速純化回收試劑盒，回收DNA片段。2.pP1C9K/FV11和pPIC9K/G1u-A1a-Glu-A1a-FVII質粒的構建2.1pPlC9/FVII和pPIC9/Glu-Ala-Glu-Ala-FVII質粒的構建分別用XhoI、EcoRI對PCR擴增的基因片段和質粒pPIC9進行雙酶切消化(37°C水浴2小時)。用B型小量DNA片段快速膠回收試劑盒(北京博大泰克生物基因技術有限責任公司)對PCR基因片段與質粒pPIC9酶切產物進行膠回收。然后，用T4DNA連接酶對PCR片段和pPIC9載體進行DNA連接，在連接反應同時設置自連對照(22'C水浴過夜)。制備新鮮的感受態大腸桿菌T0P10，將目的產物與載體連接液10ul加入50ulTCM緩沖液中混勻，再加入到50ul感受態細胞中，冰水浴0.5h后，42°。熱擊90秒，迅速轉入冰水浴中冷卻2分鐘，然后加入800ylLB培養基于37'C、150rpm震蕩培養l小時，取100u1上述菌液均勻涂布于LB固體培養基(含A即100Ug/ml)上，37'C下正向放置1小時后倒置37'C培養過夜。挑取轉化菌落接種于5mlLB液體培養基(含A卿50yg/ml)中，37°C，250rpm/min振蕩培養過夜，然后采用使用博大泰克公司B型質粒小量快速提取試劑盒提取質粒。以XhoI、EcoRI37'C酶切2h，電泳鑒定酶切產物片段大小。2.2重組質粒pPIC9/FVII和pPIC9/Glu-Ala-Glu-Ala-FVII插入目的基因的序列測定將含有正確大小插入片段的重組質粒以pPIC9載體上的通用引物5'A0X、3'AOX為測序引物對插入目的基因片段進行雙向通測(上海生工公司測序)。重組質粒pPIC9/FVII插入片段測序結果顯示FVII基因直接融合在第一個信號肽切除位點后，分泌蛋白N端不帶有信號肽殘余氨基酸。酶連接位點與預期一致，讀碼框正確。重組質粒pPIC9/Glu-Ala-Glu-Ala-FVII插入片段測序結果顯示FVII基因融合在兩個Glu-Ala重復序列之后，得到的蛋白會因為信號肽的切割位點不同，N端會有不均一氨基酸殘基。酶連接位點與預期一致，讀碼框正確。2.3pPIC9K/FVII和pPIC9K/Glu-Ala-Glu-Ala-FVII載體的構建將測序正確的pPIC9/FVII和pPIC9/Glu-Ala-Glu-Ala-FVII重組載體以及pPIC9K質粒分別用BamHI和EcoRI酶切，膠回收目的片段后，經連接后酶切鑒定(結果見圖l)得到pPIC9K/FVII和pPIC9/Glu-Ala-Glu-Ala-FVn重組載體，方法步驟同2.1。3電轉化巴斯德畢赤酵母菌株GS115和SMD11633.1質粒提取及線性化如前所述方法提取質粒pPIC9K/FVII和pPIC9K/Glu-Ala-Glu-Ala-FVII質粒。以SalI酶分別對質粒進行酶切線性化處理。用酚氯仿(l:l)混合溶液對線性化DNA抽提兩次，無水乙醇沉淀線性化DNA，晾干，然后用適量的TE(pH7.4;10mmol/LTrisCIpH7.4，lmmol/LEDTApH8.0)溶解。3.2酵母感受態細胞的制備取-80。C凍存的GS115和SMD1163細胞在YPD平板上劃線活化，培養48h。挑取單菌落于5mlYTO液體培養基中，28°C，280rpm培養過夜，吸取200ul至150mlYPD液體培養基中，28°C，280rpm繼續培養至0D,n,1.3-1.5，1500g4°C離心5min收集菌體。用150nil預冷的雙蒸水重懸，1500g4°C離心5min收集菌體；再用75ml預冷的雙蒸水重懸，1500g4。C離心5min收集菌體；后用6ml預冷的lmol/L山梨醇重懸，1500g4。C離心5min收集菌體后，重懸于lml預冷的lmol/L山梨醇，備用。3.3電轉化將線性化質粒各10u1(含DNA約5ng)分別與10n1GS115、SMD1163感受態細胞混勻，加到預冷的電擊杯中，冰上放置5min后1500V5ms進行電擊(Eppendorf^、ultiporato^多功能細胞電穿孔儀)，迅速加入lml預冷的lmol/L山梨醇，充分混勻，3000g離心5min，棄上清，用200"1lmol/L山梨醇重懸后涂布于不含組氨酸RDB平板上，在28'C下培養2-4d，直到菌落長出。4.轉化菌株Mut+和Muts表型的鑒定在重組載體的///.W基因位點用Sail進行線性化，以插入重組的方式整合到酵母基因組上(圖2)，絕大部分產生的是甲醇利用生長較快的Mut+表型。但在重組的過程中，會有一小部分重組載體以取代重組的方式進行整合，破壞了酵母基因組本身的AOX基因(圖3)，產生了甲醇利用生長較慢的MutS表型。采用酵母基因組DNA小量快速提取試劑盒(博大泰克)提取轉化菌株的基因組DNA。用畢赤酵母特異性引物進行基因組DNA的PCR擴增反應，體系如下<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>PCR反應條件為94。C預變性2分鐘；94。C變性1分鐘，55T復性1分鐘，72。C延伸1分鐘，25個循環；72'C延伸7分鐘；4'C保溫。取5u1擴增產物于1%瓊脂糖凝膠電泳，電壓80V，15分鐘，紫外燈下觀察鑒定(結果如圖4所示)。以插入重組得到的His+Mut+表型，既有酵母基因組本身的A0X片段大小，也有插入重組載體的A0X片段兩個目標條帶；而取代重組的His+Muts表型，由于破壞了基因組本身的A0X基因，只有重組載體上一條A0X片段。用此方法，鑒定出一批在GS115和SMD1163兩種菌株中都是His+Mut+表型的若干個不同的一級結構重組子。不同的表型對甲醇的生長利用速率不同，誘導產生外源蛋白的時間也不同，其中His+Mut+表型所需誘導時間較短，甲醇利用較快。5.Mut—表型陽性酵母菌的搖瓶誘導表達選取PCR結果均為Mut'表型的不同菌株中的不同結構的陽性重組菌株以及GS115/pPIC9K、SMD1163/pPIC9K菌(陰性對照)在含有7.5mlBMGY液體培養基的試管中，28°C，250rpm搖床培養36h至0D柳』到2-6。離心收集菌體，重懸于15mlB醒Y培養基。每隔24h補加100%的甲醇使終濃度為0.5%保持誘導，28'C誘導表達4d，每天取待檢測樣品離心，上清凍存。6表達產物的檢測及其結果采用SDS-PAGE電泳法和蛋白質印跡法(Westernblot)鑒定表達產物，并選擇96小時的重組體表達上清比較各重組體在各菌株中的表達情況。6.1pPIC9K/FVII和pPIC9K/Glu-Ala-Glu-Ala-FVII在GS115菌株中的表達完整的FVII蛋白是45KDa，算上4個糖基化位點上的糖鏈，成熟的FVII蛋白應為50KDa。與陰性表達株比較，pPIC9K/FVII重組體在GS115菌株中誘導表達后在35KDa和15KDa處有蛋白條帶，且隨著時間的延長蛋白量有所積累。通過蛋白質印跡法進一步驗證證實此兩條蛋白帶為FVII特異性蛋白。這些結果表明重組酵母分泌表達了FVII，并且FVII外源蛋白在表達分泌過程中發生了降解，形成了兩條主要的蛋白區帶。pPIC9K/Glu-Ala-Glu-Ala-FVII重組體在GS115菌株中的表達情況與pPIC9K/FVI1重組體表達情況類似。對96h表達上清的測定結果顯示，FVII目的蛋白N端是否有殘留信號肽殘基并不影響蛋白的分泌表達，而且pPIC9K/FVI1比pPIC9K/Glu-Ala-Glu-Ala-FVII的蛋白表達量略高(見圖5A和5B)。6.2pPIC9K/FVII和pPIC9K/Glu-Ala-Glu-Ala-FVII在SMD1163菌株中表達SMD1163是一種酶缺陷型菌株，最初被廣泛應用的目的就是可以抑制外源蛋白分泌表達過程中的降解，但FVII蛋白在其中仍然發生了與GS115—樣的降解情況。35KDa和15KDa處有蛋白條帶，且隨著時間的延長蛋白量有所積累。對96h表達上清的測定結果顯示，是否N端有殘余信號肽氨基酸并不影響蛋白的分泌表達，分泌蛋白降解情況一致，而且pPIC9K/FVII比pPIC9K/Glu-Ala-Glu-Ala-FVII的蛋白表達量略高(見圖6A和6B)。質粒在SMD1163菌株的整體表達量低于GS115菌株。實施例2.人凝血因子vn高拷貝重組子的構建及酶切鑒定采用完整的表達單元重復串聯的方法來構建重組fvii的多拷貝重組子。本研究利用完整表達元件兩端兩個同尾酶BamHI:GiGATCC和BglII:AiGATCT的特殊性質，構建高拷貝重組體。將實施例1中構建好的測序正確的單拷貝重組體用BamHI、BglII酶切后，回收目的片段，利用同尾酶的性質，讓插入片段進行自連，后以BamHI、BglII酶來處理這個連接體系。若表達單元為正向重復串聯，兩個單元連接處的同尾酶連接后不成為任何酶切識別位點，正向連接結構得以保留；若反向連接，連接處仍為某一同尾酶，經酶作用后又打開連接。原單拷貝重組體再用BamHI處理作為載體，與前面正向重復串聯的插入片段進行連接，得到了多拷貝重組體。具體流程如圖7所示。最終形成含有1-5個拷貝的不同表達質粒。用BamHI、BglII、Sail對構建好的不同拷貝數的重組體進行酶切鑒定，得到2427bp、5653bp兩條非特異組成性固定條帶，以及隨著拷貝數的遞增，從2790bp一直遞增到13950bp的特征性條帶(圖8)。實施例3.pPIC9K/FVI1高拷貝重組體在GS115菌株中的搖瓶發酵蛋白表達將實施例2中所得不同拷貝數的表達質粒按實施例1中的方法轉化入GS115酵母中，挑選重組子，使其在搖瓶中進行表達。以蛋白質印跡法檢測表達量。不同拷貝重組體在GS115菌株中都得以表達。其表達情況與前面所述的單拷貝表達情況相似。在蛋白質印跡圖中，出現了完整的50KDa大小的FVII完整蛋白帶及個別降解條帶，表明并未出現明顯降解。并且，隨著拷貝數的增高，蛋白表達量明顯呈拋物線增高的趨勢(圖9)。實施例4.重組FVII的凝血活性采用15L發酵罐對實施例3中獲得的不同拷貝重組表達菌株進行發酵培養，取80h時的酵母表達上清用截留量為lOKDa的超濾膜包進行超濾濃縮。用人凝血因子VII缺乏血漿(人凝血因子VII含量低于1%的病人血槳或人工基質血漿)作為基質血漿，測定供試品人凝血因子VII效價。1.人凝血因子VII標準溶液的配制用人凝血因子VII缺乏血漿將人凝血因子VII標準品稀釋成1IU/ml，再用稀釋液(巴比妥鈉11.75g、氯化鈉14.67g溶于1570ml水中，用lmol/L鹽酸調pH至7.3，再加水至2000ml，用前加人血白蛋白至終濃度為1%)分別進行10倍、20倍、40倍和80倍稀釋，置冰浴備用。2.供試品溶液的配制用人凝血因子VII缺乏血漿將供試品稀釋成約1IU/ml，再用稀釋液進行IO倍和20倍或40倍稀釋，置冰浴待用。3.測定方法取供試品溶液O.lml，加人凝血因子VII缺乏血漿0.lml，混勻，置37i:水浴保溫一定時間(3分鐘)，然后加入已預熱至37i:含鈣促凝血酶原激酶溶液0.2ml，記錄凝固時間。用不同稀釋度的人凝血因子VII標準溶液0.lml替代供試品溶液，同法操作。4.結果計算將標準溶液人凝血因子VII效價(IU/ml)對其相應的凝固時間(秒)進行雙對數直線回歸處理，求出直線回歸方程。將供試品溶液的凝固時間(秒)對數值代入方程，求得的值的反對數，再乘以稀釋倍數，即為每lml供試品溶液人凝血因子VII效價(IU/ml)，取供試品各稀釋度的人凝血因子VII效價均值即為供試品人凝血因子VII效價(IU/ml)。5.試驗結果以商品化質控血槳為標準血漿，等比稀釋后作雙對數標準曲線(見圖io)。<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>樣品的凝血活性如下表所示:<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>與未表達陰性樣品相比，誘導表達后上清有相對活性，但活性較低，在經過超濾濃縮后，活性有了顯著的提高，說明FVII活性隨著蛋白濃度的增高有著遞增的趨勢，用畢赤酵母表達的Fvn蛋白有生物活性。在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。序列表〈110>上海生物制品研究所<120〉表達重組人凝血因子VII的畢赤酵母及其制法和應用<13()〉074299<160>5<170〉Patentlnversion3.3<220><221>CDS<222〉(52)..(1386)<220〉<221〉sigpeptide<222>(52T..(165)〈400〉1agtcccatggggaatgtcaacaggcaggggcagcactgcagagatttcatcatggtc57MetVal1tcccaggccetcaggetcetctgccttctgcttgggcttcagggctgc105SerGinAlaLeuArgLeuLeuCvsLeuLeuLeuGlyLeuGinGlyCys5li)15ctggetgcagtcttcgtaacccaggaggaagcccacggcgtcctgcac153LeuAlaAlaValPheValThrGinGluGluAlaHisGlyValLeuHis202530eggcgceggcgcgccaacgcgttcctggaggagctgeggccgggctcc201ArgArgArgArgAlaAsnAlaPheLeuGluGluLeuArgProfi工ySer35404550ctggagagggagtgcaaggaggagcagtgctccttcgaggaggccegg249LeuGluArgGluCysLysGluG]uGinCysSerPheGluGluAlaArg556065agtgatggggaccagtgtgccteaagtccatgccagaatgggggctcc345SerAspGlyAspGinCysAlaSerSerProCysGinAsnGlyGlySer859095tgcaaggaccagetccagtcctatatetgcttctgcetccctgccttc393CysLysAspGinLeuGinSerTyrlieCysPheCysLeuProAlaPhe100105110gagggceggaactgtgagacgcacaaggatgaccagctgatetgtgtg441Glu&lvArgAsnCysGluThrHisLysAspAspGinLeulieCysVal115120125130aagcgctcctgteggtgccacgaggggtactctctgctggcagacggg537LysArgSerCysArgCysHisGludlyTyrSerLeuLeuAlaAspGly150155160gigtcctgcacacccacagttgaatatccatgtggaaaaatacctatt585ValSerCysThrProThrValGluTyrProCysGlyLyslieProlie165170152412DNA智人(Homosapiens)atettcaaggacgcggagaggacgaagctgttctggatttcttac297liePheLysAspAlaGluArgThrLysLeuPheTrplieSerTyr707580>>>>o1232222cy5gG1ch03TTtstccy5gG1cy<formula>formulaseeoriginaldocumentpage22</formula>gatg卿ggcagaggc卿caggcgctggac卿ggggcagggg&gtgccaaggttgtcc1706tggaggc卿cagcccagctgagcctccttacctcccttcagccaagccccacctgcacg1766tgatctgctggccctcaggctgctgctctgccttcattgctgg卿cagtag鄉c3tga1826acscacatggatgcacacacatgcaxacacacagagatatgc3cacac3c1886ggatgcacacacagatggtcacEicagagatEicgc犯3cacaccgatgcacacgcacatag1946agtitatgcacacacagatgcatacacatggatgcacgcscatgccaatgc2006acgcscacatcagtgcacacggatgcacagagatatgcacacaccgatgtgcgcacacac2066agatatgcacacacatggatgagcacacacacaccaagtgccgatgtaca2126cacacagatgCElC3Ca^gEltgcacacacaccgatgctgactccatgtgtgctgtcctct2186gaaggcggttgtttagctctcacttttctggttcttatccattatcatcttcacttcaga2246c^ttcagaagcatcaccatgcatggtggcgaatgcccccaaactctcccccaaatgtat2306ttctcccttcgctgggtgccgggctgcacagactattccccacctgcttcccagcttcac2366aataaacggctgcgtctcctccgcacacctgtggtgcctgCC3CCC2412〈210〉2<211〉444<212〉PRT<213>智人(Homosapiens)<400>2MetVal1GlyCysLeuHisGlvSer50AlaArg65SerTyrGlySerAlaPheCysVa]130GlyThrAspGlyProlieGlyGlyl,euValSerLeuArg35LeuGluSerCysGlu115AsnValLeuLys195AsnGinAla20ArgGlulieAspLys100GlyGluArgSerGlu180ValGlyAla5AlaArgArgPheGly85AspArgAsnSerCys1^5LysCysAlaLeuValArgGluLys70AspGinAsnGlyCys150ThrArgProGinArgPheAlaCys55AspGinLeuCysGly13^ArgProAsnLysLeuValAsn40LysAlaCysGinGlu120CysCysThrAlaGly200CysLeuThr25AlaGluGluAlaSer105ThrGluHisValSer185GluGlyCys10GinPheGluArgSer90TyrHisGinGluGlu170LysCysGlyLeuGluLeuGinThr75SerlieLysTyrGly155TyrProProThrLeuGluGluCys60LysProCysAspCys140TyrProGinTrpLeuLeuAlaGlu45SerLeuCysPheAsp125SerSerCysGlyGin205lieGlyHis30LeuPhePheGinCys110GinAspLeuGlyArg190ValAsnLeu15GlyArgGluTrpAsn95LeuLeuHisLeuLys175lieLeuThrGinValProGlulie80GlyProlieThrAla160lieValLeulie<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>權利要求1.一種表達人凝血因子VII的酵母細胞，其特征在于，所述酵母細胞的染色體中整合有表達人凝血因子VII的構建物，所述構建物含有2-15個串聯排列的人凝血因子VII表達盒，每個所述人凝血因子VII表達盒從5’到3’依次包括以下元件(a)起始信號元件AOX；(b)人凝血因子VII基因；和(c)終止信號元件AOX(TT)；并且所述酵母細胞在誘導下表達具有凝血活性的人凝血因子VII。2.如權利要求1所述的表達人凝血因子VII的酵母細胞，其特征在于，所述酵母細胞選自畢赤酵母、釀酒酵母、球擬酵母、或漢遜酵母。3.如權利要求1所述的表達人凝血因子VII的酵母細胞，其特征在于，人凝血因子VII基因包含SEQIDNO:l所示的序列。4.一種酵母細胞群，其特征在于，所述的細胞群中90-100%的酵母細胞是權利要求1所述的表達人凝血因子VII的酵母細胞，并且90-100%所述酵母細胞中人凝血因子VII表達盒的拷貝數是相同的或基本相同的。5.—種制備重組人凝血因子VII的方法，其特征在于，所述方法包括步驟(i)在適合表達的條件下，培養權利要求1所述的表達重組人凝血因子VII的酵母細胞，從而表達重組人凝血因子VII;和(ii)從培養物中分離出重組人凝血因子VII。6.—種重組人凝血因子VII，其特征在于，所述重組凝血因子VII是通過權利要求5所述的方法制備的。7.如權利要求6所述的重組人凝血因子VI1的用途，其特征在于，用于制備促凝血的藥物組合物。8.—種構建物，其特征在于，所述構建物含有2-15個串聯排列的人凝血因子VII表達盒，每個所述人凝血因子VII表達盒從5'到3'依次包括以下元件(a)起始信號元件AOX;(c)終止信號元件AOX(TT)。9.一種構建權利要求8所述的構建物的方法，其特征在于，當所述構建物為多拷貝表達質粒時，所述方法包括(1)將人凝血因子VII基因定點插入包含起始信號元件A0X和終止信號元件AOX(TT)的質粒中，以獲得單拷貝表達質粒；(2)對所述單拷貝表達質粒進行改造以獲得完整的人凝血因子VII表達盒，其中，所述表達盒從5'到3'依次包含以下元件(a)起始信號元件AOX;(b)人凝血因子VII基因；禾口(c)終止信號元件A0X(TT);(3)將所述人凝血因子VII表達盒重復插入所述質粒中，從而獲得含有2-15個串聯排列的人凝血因子VII表達盒的構建物。10.—種權利要求1所述的表達人凝血因子VII的酵母細胞的制備方法，其特征在于，所述方法包括步驟用權利要求5所述的構建物轉化酵母細胞，使所述的構建物整合入酵母染色體中，從而獲得權利要求l所述的表達人凝血因子vn的酵母細胞。全文摘要本發明提供了一種表達人凝血因子VII的酵母細胞，所述酵母細胞中整合有表達人凝血因子VII的構建物，所述構建物含有2-15個串聯排列的人凝血因子VII表達盒，各表達盒從5’到3’依次包括以下元件(a)起始信號元件AOX；(b)人凝血因子VII基因；(c)終止信號元件AOX(TT)；并且所述酵母細胞在甲醇誘導下表達具有活性的人凝血因子VII。本發明還提供了所述構建物及其制法、酵母細胞的制備方法及其表達的人凝血因子VII。本發明所構建的2-15個拷貝的酵母細胞可用于提高產量、降低成本，適于人凝血因子VII制劑的大規模生產。文檔編號C12N15/55GK101376875SQ200710045279公開日2009年3月4日申請日期2007年8月27日優先權日2007年8月27日發明者威朱,樓覺人,蔡蓓蓓申請人:上海生物制品研究所