羅非魚選育良種的scar標記檢測技術的制作方法

專利名稱：：羅非魚選育良種的scar標記檢測技術的制作方法
技術領域：
：本發明屬于遺傳育種學和水產養殖學領域，更具體地，本發明涉及一種羅非魚選育良種的鑒定方法以及遺傳標記。
背景技術：
：中國大陸從引進尼羅羅非魚起，羅非魚養殖業有了迅速發展。1994年，上海水產大學從菲律賓國際水生生物資源管理中心(ICLARM)引進了吉富(GIFT)品系尼羅羅非魚，它是由四個非洲原種群體和四個亞洲養殖品系經過混合選擇產生的優良品系。經過在黃河、長江和珠江三個農業生態區二年半的評估試驗，發現吉富品系的個體生長速度比國內主養品系("78"、"88"、"美國"禾口"埃及"品系)快5-30%，單位面積產量高20-30%，池養三網起捕率高l-2倍。1997年經全國水產原、良種審定委員會確認為良種，登記號為GS03001-1997。鑒于該引進種是尼羅羅非魚種內8個群體間雜交、選育產生的第三代，遺傳性尚不夠穩定，并有進一步改良的潛力，為了進一步提高該品系尼羅羅非魚養殖性能，提高其遺傳穩定性，培育出適合中國羅非魚產業發展需要的羅非魚新品種，本發明人以該吉富尼羅羅非魚為基礎群體，進行了進一步的選育工作，從而獲得新吉富羅非魚(參見本發明人的專利申請CN200510029412.9)，新吉富羅非魚的生長速度比基礎群體提高30%以上，種質純度達90%以上，經濟性狀優勢十分明顯。盡管不同品系或不同世代的羅非魚在外觀上非常相似，然而它們在生長速度、規格、品質、肉質等方面有很大不同，因此有必要對各品系或世代的羅非魚加以鑒定，以利良種選育的進行和新品種的保護。然而，目前現有技術中對于魚類的鑒定方法許多還是停留在傳統的形態學方法，如觀察魚的可量、可數性狀。傳統的方法準確性差，當樣品量多時工作量極大；并且，傳統的方法往往局限于區分親緣關系遠的、形態學特征差異大的魚類的物種以上的研究，對于親緣關系接近的、遺傳相似度高的物種以下的類群則難以準確地區分。因此，本領域需要找到可明確地鑒定新吉富羅非魚的方法，以準確地將新吉富羅非魚與其它羅非魚種群加以區分，為羅非魚種質的保存和良種的養殖提供技術保障，為在縱向上和橫向上將新吉富羅非魚和其它羅非魚進行比較研究提供技術依據。
發明內容本發明的目的在于提供一種羅非魚良種選育的方法以及遺傳標記。在本發明的第一方面，提供一種用于鑒定新吉富羅非魚群的DNA分子，所述的DNA分子具有(i)SEQIDNO:2中14-566位所示的核苷酸序列；或(ii)SEQIDNO:2所示的核苷酸序列；或(iii)SEQIDNO:6中11-568位所示的核苷酸序列；或(iv)SEQIDNO:6所示的核苷酸序列。在本發明的第二方面，提供一種用于鑒定新吉富羅非魚群的引物，所述引物的長度為8-35個核苷酸，并且所述的引物可擴增出具有選自下組的核苷酸序列的DNA分子(i)SEQIDNO:2中14-566位所示的核苷酸序列；或(ii)SEQIDNO:2所示的核苷酸序列；或(iii)SEQIDNO:6中11-568位所示的核苷酸序列；或(iv)SEQIDNO:6所示的核苷酸序列。在另一優選例中，所述引物的長度為10-30個。在另一優選例中，所述的引物構成引物對，所述引物對選自由具有SEQIDNO:3所示核苷酸序列的引物和具有SEQIDNO:4所示核苷酸序列的引物構成的引物對；或由具有SEQIDNO:7所示核苷酸序列的引物和具有SEQIDNO:8所示核苷酸序列的引物構成的引物對。在另一優選例中，所述的引物選自具有SEQIDNO:1所示核苷酸序列的引物；或具有SEQIDNO:5所示核苷酸序列的引物。在本發明的第三方面，提供一種從待測魚群中鑒定新吉富羅非魚的方法，所述方法包括(1)從待測魚群隨機選取10-100尾(優選20-50尾)魚，檢測它們的基因組DNA中是否存在具有SEQIDNO:6中11-568位所示核苷酸序列的DNA分子；若存在所述DNA分子的魚的頻率高于80%(優選高于85%;更優選高于88%)，則該待測魚群是吉富羅非魚群；(2)從步驟(l)獲得的吉富羅非魚群中隨機選取10-100尾(優選20-50尾)魚，檢測它們的基因組DNA中是否存在具有SEQIDNO:2中14-566位所示核苷酸序列的DNA分子；若存在所述DNA分子的魚的頻率高于80%(優選高于85%)，則該吉富羅非魚群是新吉富羅非魚群。在另一優選例中，利用所述的引物檢測待測魚的基因組DNA。在本發明的第四方面，提供一種用于鑒定新吉富羅非魚的試劑盒，所述的試劑盒中含有容器，以及裝于容器中的引物和/或探針，所述的引物和/或探針用于鑒定待測樣品中是否存在選自下組的DNA分子(i)SEQIDNO:2中14-566位所示的核苷酸序列；或(ii)SEQIDNO:2所示的核苷酸序列；或(iii)SEQIDNO:6中11-568位所示的核苷酸序列；或(iv)SEQIDNO:6所示的核苷酸序列。在本發明的第五方面，提供本發明所述的DNA分子的用途，用于鑒定新吉富羅非魚。本發明的其它方面由于本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。圖1顯示了以S3。4為引物，以F。群體和F,。群體的基因組DNA為模板進行PCR擴增，擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳結果。其中，泳道1-10:F。的PCR擴增產物的電泳結果；泳道11-20:Fn,的PCR擴增產物的電泳結果;泳道M:lOObpDNAladder。圖2顯示了利用S:i。,^基因片段的特異性引物(見表1),以F。群體和F,。群體的基因組麗A為模板進行PCR擴增，擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳結果，其中，泳道1-10:F。的PCR擴增產物的電泳結果；泳道11-20:F,。的PCR擴增產物的電泳結果；泳道M:100bpDNA1adder。圖3顯示了以S:w為引物，以新吉富群體和其它7個群體的基因組DNA為模板進行PCR擴增，擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳結果。其中，泳道1-7:新吉富群體(J);泳道8-10:海南吉諾瑪(H);泳道11-13:廈門鷺業(L);泳道14-16:廣西水產所埃及品系(E);泳道17-19:非洲尼羅羅非魚(A);泳道20-22:泰國尼羅羅非魚(T);泳道23-25:廣東偉業尼羅羅非魚(W);泳道26-28:廣東珠海北極品尼羅羅非魚(G);泳道M:500bpDNAladder。圖4顯示了利用S^,P基因片段的特異性引物(見表2)，以新吉富群體和其它7個群體的基因組DNA為模板進行PCR擴增，擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳結果，其中，泳道1-7:新吉富群體F,。(J);泳道8-10:海南吉諾瑪尼羅羅非魚(H);泳道11-13:廈門鷺業尼羅羅非魚(L);泳道14-16:廣西水產所尼羅羅非魚埃及品系(E);泳道17-19:非洲尼羅羅非魚(A);泳道20-22:泰國尼羅羅非魚(T);泳道23-25:廣東偉業尼羅羅非魚(W);泳道26-28:廣東珠海北極品尼羅羅非魚(G);泳道M:lOObpDNAladder。具體實施方式本發明人經過長期而廣泛的研究，首次揭示可特異性鑒定新吉富羅非魚的分子標記，所述分子標記存在于新吉富羅非魚的基因組DNA中，而在新吉富羅非魚的選育基礎群體(吉富品系羅非魚)或多種其它品系尼羅羅非魚的基因組DNA中不存在或者存在幾率顯著降低，因而所述分子標記可良好地應用于分離鑒定新吉富羅非魚，以及應用于新吉富羅非魚選育世代的縱向追溯和不同羅非魚品系的橫向比較。本發明還揭示了基于所述分子標記設計的引物和試劑盒。在此基礎上完成了本發明。基本原理本發明的最主要理論基礎是基于不同品系或者同一品系不同選育世代的羅非魚之間基因組序列的多態性，以及隨機擴增多態DNA(RandomAmplifiedPolymorphicDNA，RAPD)、序列特異擴增區域(SequenceCharacterizedAmplifiedRegions,SCAR)分析方法。RAPD是以聚合酶鏈反應(PolymeraseChainReaction,PCR)為基礎，利用人工合成的大約lObp的隨機序列寡核苷酸作為引物，以生物的基因組DNA為模板，進行PCR擴增，產生不連續的DNA擴增產物，然后通過如瓊脂糖凝膠電泳等技術來檢測DNA序列的多態性。通常，隨機引物的數量越多，所覆蓋的基因組范圍越大，其與基因組結合的位點更加密集，能夠更全面的反映基因組之間的差異。對于同源性較高的樣本來說，大量的引物是發現微小差異的前提。SCAR標記一般是由RAPD、RFLP、AFLP等標記轉換而來，是根據已獲得的標記片段的序列信息，設計特異引物，然后通過普通的PCR手段來揭示多態性。本發明中，所述的SCAR標記是基于RAPD標記轉換而來。SCAR是一種十分穩定的分子標記，在應用上具有迅速、簡便、低成本的特點，非常適合于樣品的大量分析。分子標記及其應用本發明人通過對大量的隨機引物的分析篩選，獲得了可將新吉富羅非魚群體(F,。)及其基礎群體(F。)與其它品系的羅非魚群體區分開來的DNA分子標記，所述的DNA分子標記具有SEQIDNO:6中11-568位所示的核苷酸序列或SEQIDNO:6所示的核苷酸序列。所述分子標記在新吉富羅非魚群體的基因組DNA中出現的頻率達到90%以上，在新吉富羅非魚的基礎群體的基因組DNA中出現的頻率達到85%以上，而在其它品系的羅非魚群體的基因組DNA中出現的頻率在70%或以下。因而，利用該分子標記可方便地將新吉富羅非魚群體及其基礎群體與其它品系的羅非魚群體區分開來。并且，該分子標記適用于新吉富羅非魚群與其它品系羅非魚群的橫向比較。更特別的，還可利用所述的分子標記在新吉富羅非魚群體與其基礎群體之間出現頻率的差異，來鑒別新吉富羅非魚群體和新吉富羅非魚的基礎群體。作為本發明的優選方式，本發明人還篩選獲得了可將新吉富羅非魚群體(FJ與其基礎群體(F。)區分開來的DNA分子標記，所述的DNA分子標記具有SEQIDNO:2中14-566位所示的核苷酸序列或SEQIDNO:2所示的核苷酸序列。所述的DNA分子標記在新吉富羅非魚群體的基因組DNA中出現的頻率為85%以上；而在新吉富羅非魚的選育基礎群體(Fo)的基因組DNA中出現的頻率是20%以下。因而，利用該分子標記可方便地將新吉富羅非魚群體與其基礎群體區分開來。并且，該分子標記適用于新吉富羅非魚選育世代的縱向追溯。上述兩種DNA分子標記的聯合使用，可準確地從各種羅非魚品系中選擇出經選育的優良品種，從而為鑒別羅非魚種質，選擇優良品種，確保魚類養殖業的持續發展提供有效支持。本發明的分子標記的另一應用是進行遺傳分析。可利用本發明的分子標記分析不同群體或不同個體的羅非魚的遺傳相似性以及各魚或魚群之間的遺傳距離。若各魚或魚群之間遺傳相似性較高(遺傳相似系數較高)，表現出較高的同源性，則遺傳距離較近；反之，若各魚或魚群之間遺傳相似性較低(遺傳相似系數較低)，則說明遺傳距離較大，親緣關系較遠。引物及其應用本發明人利用許多種長度約10bp的寡核苷酸隨機引物，通過對隨機引物的篩選，獲得可良好地將新吉富羅非魚群體(F,。)及其基礎群體(F。)與其它品系的羅非魚群體區分幵來的引物。所述的引物具有SEQIDNO:5所示的核苷酸序列。以新吉富羅非魚群體中各魚的基因組DNA為模板，利用所述的引物，擴增出長度約為568bp的DNA片段的頻率為90%以上；以新吉富羅非魚的基礎群體中各魚的基因組DNA為模板，利用所述的引物，擴增出長度約為568bp的DNA片段的頻率為85%以上；而以其它品系的羅非魚基因組DNA為模板，利用所述的引物，擴增出長度約為568bp的DNA片段的頻率低于或等于70%。并且，以之作為引物，擴增產物多、譜帶清晰、多次試驗的重復性以及穩定性非常好。根據利用SEQIDNO:5所示的引物擴增出的DNA分子標記(具有SEQIDNO:6所示的核苷酸序列)，可設計特異性擴增該DNA分子標記的引物對。引物的設計方法是本領域人員所熟知的。任何可特異性擴增該DNA分子標記或其片段的引物對均被包括在本發明中。作為本發明的優選方式，所述的引物對由具有SEQIDNO:7所示核苷酸序列的引物和具有SEQIDNO:8所示核苷酸序列的引物構成。作為本發明的優選方式，本發明人通過對隨機引物的篩選，還獲得可良好的將新吉富羅非魚群體(FJ與其基礎群體(F。)區分開來的引物。所述的引物具有SEQIDNO:1所示的核苷酸序列。以新吉富羅非魚群體中各魚的基因組DNA為模板，利用所述的引物，擴增出長度約為624bp的DNA片段的頻率為85。/。以上；以新吉富羅非魚的基礎群體中各魚的基因組DNA為模板，利用所述的引物，擴增出長度約為624bp的DNA片段的頻率為20%以下。并且，以之作為引物，擴增產物多、譜帶清晰、多次試驗的重復性以及穩定性好。根據利用SEQIDNO:1所示的引物擴增出的DNA分子標記(具有SEQIDNO:2所示的核苷酸序列)，可設計特異性擴增該DNA分子標記的引物對。引物的設計方法是本領域人員所熟知的。任何可特異性擴增該DNA分子標記或其片段的引物對均被包括在本發明中。作為本發明的優選方式，所述的引物對由具有SEQIDNO:3所示核苷酸序列的引物和具有SEQIDNO:4所示核苷酸序列的引物構成。本發明的這些引物還可以用放射性同位素、生物素、酶、熒光素或其他化學發光物質進行標記。利用本發明的引物，只需進行常規的PCR反應和/或瓊脂糖凝膠電泳，并通過判斷相應大小PCR產物的有無，就可以準確、快速地判斷待測魚或魚群是否屬于新吉富羅非魚，而且所需的樣品量很少。鑒定方法基于本發明所提供的適用于鑒定新吉富羅非魚的分子標記，本發明還提供了一種鑒定新吉富羅非魚的方法，所述方法包括(1)從待測魚群隨機選取一定數量(通常多于10條，數量越多，準確性越高)的魚，檢測它們的基因組DNA中是否存在具有SEQIDNO:6中11-568位或有SEQIDNO:6所示核苷酸序列的DNA分子；若存在所述DNA分子的魚的頻率高于80%(優選高于85%;更優選高于88%)，則該待測魚群是吉富羅非魚；(2)從步驟(l)獲得的吉富羅非魚群中一定數量的魚，檢測它們的基因組DNA中是否存在具有SEQIDNO:2中14-566位所示核苷酸序列的DNA分子；若存在所述DNA分子的魚的頻率高于80%(優選高于85%)，則該吉富羅非魚群是新吉富羅非魚群。從魚群中隨機選取的魚的數量沒有特別的限制，通常多于10條，數量越多，準確性越高。然而考慮到檢測的工作量等因素，通常選擇10-100條即可獲得較為準確的結果。鑒定待測魚基因組中是否存在所述分子標記的方法是本領域技術人員所熟知的，本發明對此沒有特別的限制。例如(但不限于)可通過設計特異性引物和/或探針來鑒定。作為本發明的優選方式，通過可擴增出所述分子標記的隨機引物或所述分子標記的特異性引物來檢測待測魚的基因組DNA。更優選的，在步驟(l)中，采用具有SEQIDN0:5所示核苷酸序列的引物、以待測魚基因組DNA為模板，進行PCR擴增，觀察擴增產物中是否存在約568bp的條帶；或者，采用由具有SEQIDNO:7所示核苷酸序列的引物和具有SEQIDN0:8所示核苷酸序列的引物構成的引物對、以待測魚基因組DNA為模板，進行PCR擴增，觀察擴增產物中是否存在約558bp的條帶。更優選的，在步驟(2)中，采用具有SEQIDNO:1所示核苷酸序列的引物、以待測魚基因組DNA為模板，進行PCR擴增，觀察擴增產物中是否存在624bp的條帶；或者，采用由具有SEQIDN0:3所示核苷酸序列的引物和具有SEQIDNO:4所示核苷酸序列的引物構成的引物對、以待測魚基因組DNA為模板，進行PCR擴增，觀察擴增產物中是否存在約553bp的條帶。制備待測魚的基因組DNA的方法是本領域技術人員所熟知的技術，例如可采取傳統的酚-氯仿法。PCR技術是本領域技術人員熟知的技術，其基本原理是體外酶促合成特異DNA片段的方法。本發明的方法可采用常規的PCR技術進行。鑒定PCR擴增產物中是否存在特異性基因片段(分子標記)的技術是本領域技術人員所熟知的。最為常用的技術是瓊脂糖凝膠電泳，其可將不同分子質量的DNA分離開來，還可顯示擴增產物中相應的基因片段的多少，其具有操作簡單，結果直觀的特點。試劑盒本發明還涉及一種用于鑒定新吉富羅非魚的試劑盒，所述試劑盒中含有容器，以及裝于容器中的引物和/或探針，所述的引物和/或探針用于鑒定待測樣品中是否存在選自下組的DNA分子(i)SEQIDNO:2中14-566位所示的核苷酸序列；或(ii)SEQIDNO:2所示的核苷酸序列；或(iii)SEQIDNO:6中11-568位所示的核苷酸序列；或(iv)SEQIDNO:6所示的核苷酸序列。每種引物或探針均被置于獨立的容器中。用于鑒定特定基因片段(分子標記)的引物或探針的設計方式是本領域人員熟知的技術。此外，所述的試劑盒還可含有其它鑒定待測魚所需的試劑，如(但不限于)(A)各種PCR反應用試劑，例如但不限于PCR緩沖液，dNTP，DNA聚合酶等；或(B)各種提取魚類DNA(即制備PCR反應模板)所需的試劑，例如(但不限于)酚、氯仿等；或(C)進行瓊脂糖凝膠電泳所需的試劑，例如(但不限于)瓊脂糖粉、電泳緩沖液、溴化乙錠等。此外，所述的試劑盒中還可含有鑒定待測魚的使用說明書，從而指導技術人員正確使用所述試劑盒。所述的試劑盒可實現快速檢測、批量檢測待測魚的目的。本發明的主要優點在于(1)首次揭示可特異性鑒定新吉富羅非魚的分子標記，所述分子標記存在于新吉富羅非魚的基因組DNA中，而在新吉富羅非魚的選育基礎群體或多種其它品系尼羅羅非魚的基因組DNA中存在幾率顯著降低或者不存在，因而可良好地應用于分離鑒定新吉富羅非魚，以及應用于新吉富羅非魚選育世代的縱向追溯和不同羅非魚品系的橫向比較。本發明克服了傳統方法難以區分羅非魚品系的遺傳差異、尤其是不同品系或不同世代間的遺傳差異、導致混雜的技術缺陷，為羅非魚良種選育和新品種保護提供了有效途徑。(2)利用本發明揭示的引物或含有所述引物的檢測試劑盒，可快速、大批量地檢測待測魚，從待測魚中快速準確地鑒定出新吉富羅非魚，所需樣品量少，操作簡單，準確性高，并且具有良好的再現性、結果穩定可靠。下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室指南(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。I.材料用于本發明的吉富品系尼羅羅非魚F,。群體(以下簡稱新吉富群體，或新吉富羅非魚)35尾，取自上海水產大學南匯水產動物種質試驗站；基礎群體F。(即用于選育新吉富群體的原始群體)30尾，取自青島羅非魚良種場；其余7群體為海南吉諾瑪吉富尼羅羅非魚、廈門鷺業尼羅羅非魚、廣西淡水水產所尼羅羅非魚埃及品系、廣東偉業尼羅羅非魚、廣東珠海北極品尼羅羅非魚，分別取自各冠名養殖場；非洲尼羅羅非魚和泰國尼羅羅非魚取自匈牙利Sjarvas養殖場。各隨機取樣20尾。各種魚分別剪取鰭條，95%酒精固定。隨機引物為10堿基引物，均為上海生工公司產品。SCAR分析除將PCR擴增條件調整為退火溫度56.8'C和57i:、35個循環外，其他條件參數同RAPD分析。n.具體實施例實施例lS3。/一SCAR轉化標記的建立1.基因組DNA的提取基因組DNA提取采用常規的"酚-氯仿"方法進行。提取組織為魚的尾鰭組2.基因組DNA的RAPD分析PCR擴土曾反應在EppendorfMastercyclerGradientPCR儀上進行，每一樣品的反應總體積25叱，含2.5叱IOX擴增緩沖液(含100mmol/LTris-HC1，pH9.5，500mmol/LKC1，30mmol/LMgCl"0.001%明膠，最后調節pH值至9.0)。2叱dNTP混合液(每種dNTP的終濃度0.2mmol/L)，正、反向引物各l化(終濃度0.2陶ol/L)，2PL基因組DNA(約50150ng)，0.5叱fagDNA聚合酶(1.25單位)，16叱無菌重蒸水，加入30叱石臘油。PCR的擴增程序為94"C預變性5min，接下來進行45個循環，每個循環包括94。C45s，36°C45s，72°C90s;最后一次循環結束后在72°C延伸5min。取10叱擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色后照相顯影。3.PCR擴增結果先用50個10堿基隨機引物，對基礎群體(F。)和選育群體(F,。)基因組DNA各10個樣品進行RAPD分析。在這50個引物中，能夠重復穩定擴增且表現為多態的引物有23個。結果，兩個群體間僅產生l個特異擴增帶，約在624bp處，即53()462*，此條帶對應的基因片段為F,。所特有。引物S3。4擴增的約624bp條帶如圖1所示。引物S3M的堿基序列如下CCGCTACCGA(SEQIDN0:1)。4.特異RAPD帶克隆、測序及SCAR標記的建立利用購自上海申能博彩生物科技有限公司的瓊脂糖凝膠回收試劑盒(3SSpinDNAAgaroseGelPurificationKit),從2.0%的低熔點瓊脂糖凝膠中回收純化RAPD特異片段，純化后的產物用pGEM-T載體(Invitrogen)連接，轉化到大腸桿菌DH5a上，PCR法鑒定后在ABI3700測序儀上測序。采用上述方法回收S:,。,基因片段，并克隆、測序。S則624bP片段測序結果如下(SEQTDN0:2):CTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCC根據S:,。廣，基因片段的序列設計一對長度分別為20bp和21bp的正向引物和反向引物，由于需考慮引物中GC堿基的含量，部分引物的位置沒有從片段的兩個末端開始，而是向片段的中間靠攏了一部分。引物的序列、退火溫度及擴增片段大小見表1。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>用表1所示的引物對分別在F。群體和F,。群體中進行PCR擴增，僅在F,。群體中產生了553bp的擴增帶，而F。群體中未出現此擴增帶，結果見圖2。本發明人進一步擴大檢測樣本，在F,。群體和F。群體各30尾樣本中，用表l所示的SCAR標記引物進行分析。結果發現，在F,。群體中出現該標記的頻率高達86.7%(26/30);而在Fo群體中出現該標記的頻率僅為16.7%(5/30)。因此，553bp標記(S:,，'hp)的高頻率，可良好地作為鑒定新吉富羅非魚的分子標記。實施例2S36，PSCAR轉化標記的建立先用80個10堿基隨機引物，對新吉富群體和其它7群體(海南吉諾瑪吉富尼羅羅非魚、廈門鷺業尼羅羅非魚、廣西淡水水產所尼羅羅非魚埃及品系、廣東偉業尼羅羅非魚、廣東珠海北極品尼羅羅非魚、非洲尼羅羅非魚、泰國尼羅羅非魚)基因組DNA各IO個樣品進行RAPD分析。基因組DNA的提取、PCR擴增方法、瓊脂糖凝膠電泳及電泳條帶的回收方法同實施例1。結果發現，在這80個引物中，能夠重復穩定擴增且表現為多態的引物有20個。8個群體間僅產生l個特異擴增條帶，約在568bp處，即536568\此條帶對應的基因片段為新吉富群體所特有。引物S:,6擴增的568bp條帶如圖3所示。引物S.w的堿基序列如下AGCCAGCGAA(SEQIDNO:5)。特異RAPD帶克隆、測序及SCAR標記的建立方法同實施例1。53656一片段測序結果如下(SEQIDNO:6):TCTGAGACCACTTCTATAGATCTTGGTTCGCTGGCT根據S:^"P基因片段的序列設計一對長度分別為20bp和21bp的正向引物和反向引物，引物對的序列、退火溫度及擴增片段大小見表2。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>本發明人進一步擴大檢測樣本，用表2所示的引物對分別在F1D群體的35尾樣本、F。群體的26尾樣本和其它7個群體各20尾樣本中進行PCR擴增，在新吉富F,。群體和F。群體中產生了558bp的擴增帶，見圖4，其中，在新吉富F,。群體中的出現頻率高達91.4y。，F。群體中出現頻率88.5%;在其它7群體中的出現頻率依次為0%(廣西水產研究所尼羅羅非魚埃及品系)、30%(珠海北極品尼羅羅非魚)、35%(廈門鷺業尼羅羅非魚)、55%(廣東偉業尼羅羅非魚)、60%(泰國尼羅羅非魚)、65%(海南吉諾瑪吉富尼羅羅非魚)、70%(非洲尼羅羅非魚)。因此，558bp標記在新吉富羅非魚群體中的高出現頻率，可作為檢測該良種的依據。綜上，本發明人建立了2個SCAR擴增帶。S，553bPSCAR轉化標記的出現頻率在F,。為86.7%，而在F。僅16.7。/。，適用于新吉富選育世代的縱向追溯；S36558bPSCAR轉化標記的出現頻率在F,。為91.4%，在F。為88.5%，而在7個國內外具有代表性的尼羅羅非魚品系僅070%，適用于新吉富同其它尼羅羅非魚的橫向比較。在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。序列表<110〉李，思發<120〉羅非魚選育良種的SCAK標記檢測技術<130>075327<160>8<170〉Patentlnversion3.3〈210〉1<211〉10<212〉DNA<213〉人工序列<220><221〉misc—feature<223〉引物<400〉1ccgctaccga10<210>2<211>624<212〉麵<213>羅非魚(Oreochromis)<棚>2gtgtaaagcctggggtgccttttgaatgagctaactcacattaattgcgttgcgctccct60cagcccgctttctagcaggga肌cctgtcgtgccagctgc3ttaatg犯tcggccaacgc120gccaggggagaggcggtttgcgtattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgc180tgcgcactcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacg240gttatccacacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaa300aaggccagcagaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgccccc360ctgacgagcaatcgacgctctggcgaaacccgacaggact420ataaagataccacaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgacc480ctgccgcttaccggcaatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctc540atagctcacgctgtagcagtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctg600tgtgcacg犯ccccccgttcagcc624<210>3<211〉20<212〉DNA<213〉人工序列<220><221〉misc—feature<223〉引物<400〉3ggtgccttttgaatgagcta20〈210〉<211〉<212〉<213〉<220><221〉<223>421DNA人工序列misc一feature引物<400>4tgagatactgctacagcgtga21<210〉<211〉<212〉〈213〉<220〉<221〉<223>510DNA人工序列misc—feature引物<400>5agccagcgaa10<210〉6<211〉568〈212〉DNA<213〉羅非魚(0reochromis)<400〉6agccagcgaatggatggatggattgatggatttattttcgttttttctgcagtatataaa60aattggtgtatctcaaaaataaaactatgaagacactcaaaataaatttcctgttgttgt120aaactattttttgcaacttttctatatttaaagttttatatcttaaatttttctaagtag180aaa_tatatgtaaaaaaaaaaaaaa犯agaaaagattttcaatttttttgtagtttattgc240acttttttgcaatttatgtagttactatggacttaatgcatacatattattaaactttgg300gctataacagttgtattgatttatagttgaaatgctcccaaaaatggcactacagcatgt360aaaaatataaagtaagcttggttctatggtaggtcttaaagggttaaaaagataaatggc420ttctcagtagaccctctgctcagatgccttgatgaaataagtgcctggatggctttgaac480ttttttacattttaatgagcagaaaacagaagtgatagtttttggtggcgcttctgagac540cacttctatagatcttggttcgctggct刷<210>7〈211〉20<212〉DNA<213〉人工序列<220〉<221>misc—feature〈223〉引物<400〉7tggatggatggattgatgga<210〉8<211>21<212>DNA<213〉人工序列<220〉<221〉misc—feature<223〉引物〈400〉8agccagcgaaccaagatctat2權利要求1.一種用于鑒定新吉富羅非魚群的DNA分子，其特征在于，所述的DNA分子具有(i)SEQIDNO2中14-566位所示的核苷酸序列；或(ii)SEQIDNO2所示的核苷酸序列；或(iii)SEQIDNO6中11-568位所示的核苷酸序列；或(iv)SEQIDNO6所示的核苷酸序列。2.—種用于鑒定新吉富羅非魚群的引物，其特征在于，所述引物的長度為8-35個核苷酸，并且所述的引物可擴增出具有選自下組的核苷酸序列的DNA分子(i)SEQIDNO:2中14-566位所示的核苷酸序列；或(ii)SEQIDNO:2所示的核苷酸序列；或(iii)SEQIDNO:6中11-568位所示的核苷酸序列；或(iv)SEQIDNO:6所示的核苷酸序列。3.如權利要求2所述的引物，其特征在于，所述引物的長度為10-30個。4.如權利要求2所述的引物，其特征在于，所述的引物構成引物對，所述引物對選自由具有SEQIDNO:3所示核苷酸序列的引物和具有SEQIDNO:4所示核苷酸序列的引物構成的引物對；或由具有SEQIDNO:7所示核苷酸序列的引物和具有SEQIDNO:8所示核苷酸序列的引物構成的引物對。5.如權利要求2所述的引物，其特征在于，所述的引物選自具有SEQIDNO:1所示核苷酸序列的引物；或具有SEQIDNO:5所示核苷酸序列的引物。6.—種從待測魚群中鑒定新吉富羅非魚的方法，其特征在于，所述方法包括(1)從待測魚群隨機選取10-100尾魚，檢測它們的基因組DNA中是否存在具有SEQIDNO:6中11-568位所示核苷酸序列的DNA分子；若存在所述DNA分子的魚的頻率高于80%，則該待測魚群是吉富羅非魚群；(2)從步驟(l)獲得的吉富羅非魚群中隨機選取10-100尾魚，檢測它們的基因組DNA中是否存在具有SEQIDNO:2中14-566位所示核苷酸序列的DNA分子；若存在所述DNA分子的魚的頻率高于80y。，則該吉富羅非魚群是新吉富羅非魚群。7.如權利要求6所述的方法，其特征在于，利用權利要求2所述的引物檢測待測魚的基因組DNA。8.—種用于鑒定新吉富羅非魚的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒中含有容器，以及裝于容器中的引物和/或探針，所述的引物和/或探針用于鑒定待測樣品中是否存在選自下組的DNA分子(i)SEQIDNO:2中14-566位所示的核苷酸序列；或(ii)SEQIDNO:2所示的核苷酸序列；或(iii)SEQIDNO:6中11-568位所示的核苷酸序列；或(iv)SEQIDNO:6所示的核苷酸序列。9.如權利要求8所述的試劑盒，其特征在于，所述的引物是權利要求2所述的引物。10.權利要求1所述的DNA分子的用途，其特征在于，用于鑒定新吉富羅非魚。全文摘要本發明屬于遺傳育種學和水產養殖學領域，公開了可特異性鑒定新吉富羅非魚群的分子標記，本發明還公開了鑒定方法以及試劑盒。本發明的分子標記可有效地應用于判別和鑒定新吉富羅非魚群，以及應用于新吉富羅非魚選育世代的縱向追溯和不同羅非魚品系的橫向比較。文檔編號C12N15/11GK101397583SQ20071004640公開日2009年4月1日申請日期2007年9月26日優先權日2007年9月26日發明者唐首杰,李思發,蔡完其申請人:李思發