具有選擇性殺傷腫瘤新生血管內皮細胞作用的融合蛋白與應用的制作方法

專利名稱：具有選擇性殺傷腫瘤新生血管內皮細胞作用的融合蛋白與應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及融合蛋白及其編碼基因與應用，特別是涉及具有選擇性殺傷腫瘤新生血管內皮細胞作用的融合蛋白及其編碼基因，以及該融合蛋白的表達方法和在制備抗腫瘤藥物中的應用。
背景技術：
癌癥是嚴重威脅人類健康的重大疾病之一。全球新增腫瘤病例每年都在1000萬以上，死亡達700多萬人，目前，全球腫瘤患者已逾4000萬人。據衛生部統計，我國腫瘤發病率呈總體上升趨勢，近年來，每年新增腫瘤病人200萬，死亡130多萬，目前，全國腫瘤患者總數估計約達450萬人。
由于傳統腫瘤治療方法(手術切除和放、化療)的腫瘤靶向性差，毒副作用大，因而腫瘤靶向藥物已成為未來抗癌藥物發展的重要趨勢。特異性抗腫瘤新生血管生成是腫瘤靶向治療的熱點領域。研究表明，腫瘤生長必須依賴其周圍新生血管的形成，只要能破壞腫瘤新生血管，腫瘤就會因為無法獲得足夠的營養而停止生長，并迅速萎縮、凋亡、壞死，最終被機體消除。因此，腫瘤的抗血管治療提供了針對腫瘤發生、發展過程中多個環節的全新治療思路，具有良好的應用前景。
血管內皮生長因子(Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF)是1989年Ferrara等首先在牛垂體濾泡星狀細胞體外培養液中純化出來的糖類蛋白質，對血管形成具有特異性，并具有促進血管內皮細胞增殖、血管生成、增加血管通透性、加快血液流動等功能。VEGF及其受體家族，尤其是II型受體(F1k1/KDR)，與腫瘤的生長、浸潤和轉移關系密切，是近年來抗癌藥物設計的重要靶標。人類VEGF由于mRNA的不同剪接產生7種不同的VEGF分子，即VEGF121、VEGF145、VEGF148、VEGF165、VEGF183、VEGF189及VEGF206。其中，VEGF121是最為常見的VEGF，它包含121個氨基酸殘基，與其它成員不同的是，它能與II型VEGF受體(F1k1/KDR)以高親和力特異結合，而與I型VEGF受體(Flt1)基本不結合。已證實，F1k1/KDR受體具有酪氨酸激酶活性，在多種惡性腫瘤組織的血管內皮細胞表面過度表達，而在相鄰正常組織的血管內皮細胞幾乎無法檢測出。
核糖體失活蛋白(ribosome-inactivating protein，RIP)是廣泛存在于植物界的一類毒蛋白，是真核生物蛋白合成的抑制劑。它通過RNA N-糖苷酶作用于哺乳動物核糖體大亞基上的28S rRNA，并產生脫腺嘌呤作用，從而破壞核糖體的結構，抑制蛋白質的翻譯；同時RIP還參與細胞凋亡的調節，具有巨大的藥用潛力。
根據RIP一級結構的不同，可將其分成兩類I型和II型。I型RIP由一條肽鏈組成；II型RIP由兩條多肽鏈組成，分別稱為A鏈和B鏈，兩條鏈通過二硫鍵相連。A鏈和I型RIP都具有RNA N-糖苷酶活性，能使核糖體失活。絲瓜籽核糖體失活蛋白是I型RIP的典型代表，II型RIP主要包括蓖麻毒蛋白、相思子蛋白和香樟毒蛋白等。I型RIP特別適合做細胞毒性治療藥物的彈頭部分，即可將RIP連接到單克隆抗體或者腫瘤抗原的配體上，將RIP帶到靶細胞內，選擇性地殺死腫瘤細胞，因而具有較高的療效和較低的毒性。
本發明的發明人從絲瓜籽中獲得了一種核糖體失活蛋白，名稱為Luffinα，其氨基酸殘基序列如序列表中的SEQ ID NO1所示，其編碼序列可如序列表中的SEQ IDNO2所示。

發明內容
本發明的目的是提供一種具有II型VEGF受體特異性，可選擇性殺傷腫瘤新生血管內皮細胞作用的融合蛋白。
本發明所提供的融合蛋白，命名為VEGF121/LuffinKDEL，是通過連接肽在絲瓜籽的核糖體失活蛋白Luffinα的氨基端(N端)連接VEGF121的融合蛋白。
所述連接肽的選擇是多種多樣的，其氨基酸殘基序列可如序列表中的SEQ ID NO3所示的等具有兩性分子特征的多肽，能通過破壞靶細胞的溶酶體膜而促進游離的毒素分子在靶細胞的釋放，從而增強毒素的殺傷作用。
所述連接肽也可替換為其類似物，這些類似物與所述連接肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導的遺傳變異體。誘導變異體可以通過各種技術得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其它已知的分子生物學技術。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸的類似物。
具體來講，所述連接肽的氨基酸殘基可進行以下改變(殘基號取代后的氨基酸殘基)4 Gly；5 Ser；6 Lys，Ala；7 Lys，Ala，D-Ile，Arg.Leu，Val，His，Net；8 Lys，Ala，Trp，Arg，His；9 D-Lys，Ala，Arg，His；10 D-Phe，Ala，Lys，Trp，Leu，Ile，Val，Met；11 D-Leu，Lys，Ala，Ile，Val，Met；12 Lys，D-His，Ala，Arg，Ile，Val，Net；13 Ala，Lys，D-Scr，Trp，Met，Ile，Arg，His，Thr，Leu，Val；14 Lys，D-Ala，Trp，Arg，His，Leu，Ile，Val；15 D-Lys，Lys Ala，Trp，Arg，His，Leu，Ile，Val；16 D-Lys，Ars，His；17 D-Phe，Lys，Trp，Arg，His；18 Ala，Lys，Trp，Met，Arg，His，Phe，Leu，Ile，Val；19 Ala，D-Lys，Arg，His；20 Lys，Trp，D-Ala，Arg，His，Phe；21 Ala，Lys，D-Phe，Ile，Val，Met，Leu；22 Ala，Lys，D-Val，Trp，Arg，His，Met，Leu；23 Ala，Lys，TrP，Arg，His，Leu，Met；24 Ala，Lys，D-Glu，Gly，Arg，His，Leu，Ile，Phe，Asn；25 D-Ile，Ala，Lys，Trp，Leu，Phe，Val，Het；26 Lys，Pro，Ala，His，Leu，Arg，Ile，Phe；27 Lys，Ala，D-Asn，Gln，Arg，His；28 D-Ser，Lys，Ala，Thr，Gly，Leu，Ile，Gln，Asn；32 Gly；33 Ser。
具體來講，所述具有選擇性殺傷腫瘤新生血管內皮細胞作用的融合蛋白，是下述氨基酸殘基序列之一1)序列表中的SEQ ID NO4；2)將序列表中SEQ ID NO4的氨基酸殘基序列經過一至十個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有選擇性殺傷腫瘤新生血管內皮細胞作用的蛋白質。
序列表中的SEQ ID NO4由405個氨基酸殘基組成，自氨基端第1-122位氨基酸殘基為VEGF121，自氨基端第123-157位氨基酸殘基為連接肽序列，自氨基端第158-405位氨基酸殘基為絲瓜籽的核糖體失活蛋白。
編碼上述具有選擇性殺傷腫瘤新生血管內皮細胞作用的融合蛋白的基因(VEGF121/LuffinKDEL)，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID NO5的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID NO4的DNA序列；3)與序列表中SEQ ID NO5限定的核苷酸序列具有90％以上同源性且具有選擇性殺傷腫瘤新生血管內皮細胞作用的核苷酸序列；4)在高嚴謹條件下可與序列表中的SEQ ID NO5限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
所述高嚴謹條件為雜交后用含0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液在65℃下洗膜。
序列表中的SEQ ID NO5由1215個堿基組成，其編碼序列為自5’端第1-1215位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID NO4的氨基酸殘基序列的蛋白質，自5’端第1-366位堿基為VEGF121的編碼序列，自5’端第367-471位堿基為連接肽的編碼序列，自5’端第472-1215位堿基為絲瓜籽核糖體失活蛋白的編碼序列。
為獲得更高的特異性，增加本發明融合毒素蛋白VEGF121/LuffinKDEL在其靶\點--內質網的濃度，所述融合毒素蛋白中絲瓜籽核糖體失活蛋白的C端還連接有內質網定位信號，所述內質網定位信號的氨基酸殘基序列如序列表中的SEQ ID NO6所示。
具體來講，所述連接有內質網定位信號的具有選擇性殺傷腫瘤新生血管內皮細胞作用的融合蛋白，是下述氨基酸殘基序列之一1)序列表中的SEQ ID NO7；2)將序列表中SEQ ID NO7的氨基酸殘基序列經過一至十個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有選擇性殺傷腫瘤新生血管內皮細胞作用的蛋白質。
序列表中的SEQ ID NO7由409個氨基酸殘基組成，自氨基端第1-122位氨基酸殘基為VEGF121，自氨基端第123-157位氨基酸殘基為連接肽序列，自氨基端第158-405位氨基酸殘基為絲瓜籽的核糖體失活蛋白，自氨基端第406-409位氨基酸殘基為內質網定位信號。
編碼上述具有選擇性殺傷腫瘤新生血管內皮細胞作用的融合蛋白的基因(VEGF121/LuffinKDEL)，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID NO8的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID NO7的DNA序列；3)與序列表中SEQ ID NO8限定的核苷酸序列具有90％以上同源性且具有選擇性殺傷腫瘤新生血管內皮細胞作用的核苷酸序列；4)在高嚴謹條件下可與序列表中的SEQ ID NO8限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
所述高嚴謹條件為雜交后用含0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液在65℃下洗膜。
序列表中的SEQ ID NO8由1227個堿基組成，其編碼序列為自5’端第1-1227位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID NO7的氨基酸殘基序列的蛋白質，自5’端第1-366位堿基為VEGF121的編碼序列，自5’端第367-471位堿基為連接肽的編碼序列，自5’端第372-1215位堿基為絲瓜籽核糖體失活蛋白的編碼序列，自5’端第1215-1227位堿基為內質網定位信號的編碼序列。
所述VEGF121/LuffinKDEL的片段、衍生物和類似物也是本發明要保護的，是指保持本發明的VEGF121/LuffinKDEL相同生物學功能或活性的多肽。本發明的多肽片段、衍生物或類似物可定義為1)由一個或多個保守或非保守氨基酸殘基(優選為保守性氨基酸殘基)所取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是，也可以不是由遺傳密碼編碼的；2)在一個或多個氨基酸殘基中具有取代基團的多肽；3)成熟多肽與另一個化合物融合所形成的多肽；4)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如用來純化此多肽的序列，或是抗體片段或其它抗原配體序列的融合蛋白)，或是將編碼另一個多肽的核酸序列(或其部分)與本發明的核酸序列(或其部分)融合就可以獲得融合多肽的編碼序列，再使該融合多肽的編碼序列獲得表達，就可產生融合多肽。所述產生融合多肽的技術為本領域內公知的，包括連接編碼多肽的編碼序列，從而使它們在同一個讀碼框中，并且使融合多肽的表達受控于相同的啟動子和終止子。
所述VEGF121/LuffinKDEL的類似物與VEGF121/LuffinKDEL的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導的遺傳變異體。誘導變異體可以通過各種技術得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其它已知的分子生物學技術。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸的類似物。應理解，本發明融合蛋白的氨基酸殘基序列并不限于上述例舉的具有代表性的序列。
所述VEGF121/LuffinKDEL融合蛋白還可為經過修飾的，或經修飾提高了其抗蛋白水解性能或優化了溶解性能的VEGF121/LuffinKDEL多肽。修飾(通常不改變一級結構)形式包括1)體內或體外的多肽的化學衍生形式，如乙酰化或羧基化；2)糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進一步加工步驟中進行糖基化修飾而產生的多肽，這種修飾可以通過將多肽暴露于進行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成；3)具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸、磷酸絲氨酸、磷酸蘇氨酸)的序列。
編碼本發明VEGF121/LuffinKDEL的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA或人工合成DNA，可以是單鏈的或是雙鏈的，也可以是編碼鏈或非編碼鏈。
本發明還提供了所述融合蛋白多核苷酸的變異體，其編碼與VEGF121/LuffinKDEL有相同的氨基酸序列的多肽或多肽片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發生的等位變異體或非天然發生的變異體，還可包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領域所知的，等位變異體是一個多核苷酸的替換形式，它可能是一個或多個核苷酸的取代、缺失或插入，但不會從實質上改變其編碼的多肽的功能。
含有本發明基因VEGF121/LuffinKDEL的表達載體、轉基因細胞系及宿主菌均屬于本發明的保護范圍。
擴增VEGF121/LuffinKDEL中任一片段的引物對也在本發明的保護范圍之內。
本發明的另一個目的是提供一種表達上述具有選擇性殺傷腫瘤新生血管內皮細胞作用的融合蛋白VEGF121/LuffinKDEL的方法。
本發明所提供的融合蛋白VEGF121/LuffinKDEL的表達方法，是將所述融合蛋白VEGF121/LuffinKDEL基因、該基因變異體或含有融合蛋白VEGF121/LuffinKDEL基因的重組表達載體轉化或轉導宿主細胞，培養宿主細胞，從培養基或細胞中分離純化蛋白，得到融合蛋白VEGF121/LuffinKDEL。
所述具有選擇性殺傷腫瘤新生血管內皮細胞作用的融合蛋白VEGF121/LuffinKDEL基因可插入到重組表達載體中。構建所述重組表達載體的出發載體，可為任意一種指本領域熟知的可進行外源基因表達的細菌質粒、噬菌體、酵母質粒、植物細胞病毒、哺乳動物細胞病毒如腺病毒、逆轉錄病毒或其它載體。所述載體包括但不限于在細菌中表達的基于T7啟動子的表達載體(AH Rosenberg，et al.Vectors for selectiveexpression of cloned DNAs by T7 RNA polymerase.Gene.1987，56(1)125-135)；在哺乳動物細胞中表達的pMSXND表達載體(SJ Lee and D Nathans.Proliferinsecreted by cultured cells binds to mannose 6-phosphate receptors.J.Biol.Chem.1988；2633521-3527)和在昆蟲細胞中表達的來源于桿狀病毒的載體。總之，只要能在宿主體內復制和穩定，任何質粒和載體都可以用。表達載體的一個重要特征是通常含有復制點、啟動子、標記基因和翻譯控制元件。
以pET-30a(+)為出發載體，構建的含有所述具有選擇性殺傷腫瘤新生血管內皮細胞作用的融合蛋白基因VEGF121/LuffinKDEL的重組表達載體為pET-30a(+)-VEGF121/LuffinKDEL。
可采用本領域技術人員熟知的方法構建含有所述具有選擇性殺傷腫瘤新生血管內皮細胞作用的融合蛋白基因VEGF121/LuffinKDEL的重組表達載體，如體外重組DNA技術，DNA合成技術和體內重組技術等(Sambrook，et al Molecular cloing，aLaboratory Manual.Cold spring harbor laboratory.New York，1989)。所述所述具有選擇性殺傷腫瘤新生血管內皮細胞作用的融合蛋白基因VEGF121/LuffinKDEL基因的DNA序列可以有效連接到表達載體中的適當啟動子上，以指導mRNA的合成。所述啟動子可為大腸桿菌的lac或trp啟動子、噬菌體啟動子、反轉錄病毒和其它一些已知的可控制基因在原核或真核細胞或其病毒中表達的啟動子。表達載體還包括翻譯起始用的核糖體結合位點和轉錄終止子。
此外，表達載體還可包含一個或多個選擇性標記基因，以提供用于選擇轉化的宿主細胞的表型形狀，如真核細胞培養用的二氫葉酸還原酶基因、新霉素抗性基因以及綠色熒光蛋白(GFP)基因或用于大腸桿菌的四環素或氨芐青霉素抗性基因等。
所述宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；低等真核細胞，如酵母細胞；高等真核細胞，如哺乳動物細胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌；鼠傷寒沙門氏菌的細菌細胞；真核細胞如酵母、植物細胞；果蠅S2或Sf9等昆蟲細胞；CHO、COS、293細胞或Bowes黑色素瘤細胞等動物細胞。
本發明的多核苷酸在高等真核細胞中表達時，如果在載體中插入增強子序列，將會使轉錄得到增強。增強子是DNA的順式作用因子，長度通常為10-300個堿基對，作用于啟動子以增強基因的轉錄。如在復制起始點晚期一側的長度約為100-270個堿基對的SV40增強子、在復制起始點晚期一側的多瘤增強子或腺病毒增強子等。
可用本領域技術人員熟知的常規技術，將重組DNA轉化宿主細胞，培養轉化子，誘導表達目的蛋白，并對重組蛋白進分離純化。
培養含有本發明具有選擇性殺傷腫瘤新生血管內皮細胞作用的融合蛋白VEGF121/LuffinKDEL編碼基因的宿主細胞的培養基和培養條件，均可為培養出發宿主的培養基和培養條件。
所述融合蛋白VEGF121/LuffinKDEL及其編碼基因可用于制備抗腫瘤藥物，因而本發明還提供了一種抗腫瘤藥物。
本發明所提供的抗腫瘤藥物，它的活性成分為上述具有選擇性殺傷腫瘤新生血管內皮細胞作用的融合蛋白VEGF121/LuffinKDEL或其編碼基因。
所述具有選擇性殺傷腫瘤新生血管內皮細胞作用的融合蛋白VEGF121/LuffinKDEL基因可存在于真核表達載體中。
需要的時候，在上述藥物中還可以加入一種或多種藥學上可接受的載體。所述載體包括藥學領域常規的稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑、吸收促進劑、表面活性劑和吸附載體等。
本發明的藥物可以制成注射液或凍干粉劑等多種形式。上述各種劑型的藥物均可以按照藥學領域的常規方法制備。
上述蛋白藥物和基因藥物的用量可采用藥學領域中蛋白藥物和基因藥物的常規劑量，并可根據實際情況調整。荷瘤裸鼠試驗結果表明，本發明的融合蛋白VEGF121/LuffinKDEL在注射劑量為15mg/kg體重時，即可發揮選擇性殺傷腫瘤新生血管內皮細胞的作用，并可明顯延緩腫瘤的生長。
本發明提供了一種融合蛋白毒素VEGF121/LuffinKDEL及其編碼基因。該蛋白是利用VEGF121與惡性腫瘤高表達的VEGF受體F1k1/KDR高度特異結合的特點，與來源于絲瓜籽的核糖體失活蛋白Luffinα通過連接肽連接而成的融合蛋白毒素。血管內皮細胞生長因子VEGF121作為運載工具，可使該融合毒素與血管內皮細胞生長因子受體F1k1/KDR特異結合并內化進入血管內皮細胞，然后絲瓜籽核糖體失活蛋白Luffinα發揮其毒素效應，選擇性地進入并殺傷腫瘤新生血管內皮細胞，進而破壞腫瘤組織的新生血管，切斷腫瘤血液供應，達到抑制腫瘤的目的。此外，該蛋白的表達條件簡單，易于純化，可進行大規模工業化生產，因而，可以該融合蛋白為活性成分制備成抗腫瘤藥物。本發明將在醫學及生物制藥領域發揮重要作用。
下面結合具體實施例對本發明做進一步詳細說明。


圖1為在大腸桿菌中表達的VEGF121-LuffinKDEL的10％變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測結果圖2為大腸桿菌中表達并經純化的VEGF121-LuffinKDEL的10％變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測結果圖3為對照組和試驗組給藥后不同時間的腫瘤生長曲線具體實施方式
下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規方法，具體步驟可參見《Molecular CloningA Laboratory Manual》(Sambrook，J.，Russell，David W.，Molecular CloningA Laboratory Manual，3rdedition，2001，NY，Cold SpringHarbor)。所用引物合成及測序工作均由北京奧科生物技術有限公司完成。
實施例1、具有選擇性殺傷腫瘤新生血管內皮細胞作用的融合蛋白VEGF121/LuffinKDEL編碼基因的獲得一、人血管內皮細胞生長因子VEGF121編碼基因的獲得1、從人肝癌組織中提取總RNA利用Invitrogen公司的Trizol試劑提取人肝癌組織的總RNA，方法為取100mg人肝癌組織(取自解放軍總醫院)放入無菌玻璃研磨器，加入1mL Trizol試劑，冰浴條件下迅速研磨，吸取上清至無RNA酶的離心管中，4℃、12000g離心10min，吸取上清，加入0.2mL氯仿/1mL Trizol，充分混勻后靜置2-3min，然后將水相移至新的離心管中，加入等體積的異丙醇，顛倒混勻后，室溫沉淀10min，然后4℃、7500g離心5min，重復漂洗一次，去除異丙醇后室溫干燥5-10min，加入DEPC水溶解RNA沉淀。
2、RT-PCR擴增人血管內皮細胞生長因子VEGF121基因用Invitogen公司的Superscript II反轉錄酶并按照試劑盒的說明書，以步驟1獲得的肝癌總RNA為模板反轉錄合成其cDNA，然后再取5ul反轉錄合成的cDNA為模板，在引物VEGF121F(上游引物)5’-ATACATATggCTCCgATggCAgAAggTggCggg和VEGF121R(下游引物)5’-AAATTTACCAATTCCCAgAAAgCCACCgCCCCgCCTCggCTTgTCACATTTTTC(帶單下劃線堿基為連接肽(序列表中SEQ ID NO3)部分編碼序列)的引導下PCR擴增VEGF121基因，50ul PCR反應體系為10×PCR緩沖液(含15mM MgSO4)5ul，上、下游特異性引物各50pmol，10mM dNTPs 1ul，pyrobest聚合酶(購白TaKaRa公司)1U，補水至50ul。PCR反應條件為先94℃ 30sec，55℃ 40sec，72℃1min，共25個循環；然后72℃延伸7分鐘。反應結束后，對PCR擴增產物進行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果獲得了長度為400bp的DNA片段，與預期大小一致。回收并純化該目的片段，將其連接入載體pMD 18-T(TaKaRa公司)中，再將連接產物轉化大腸桿菌(E.coli)DH5α感受態細胞，篩選陽性克隆，提質粒，得到含有目的基因的重組質粒，命名為pMD 18-VEGF121，對其進行測序，測序結果表明獲得了序列正確的人血管內皮細胞生長因子VEGF121基因。
二、絲瓜籽核糖體失活蛋白luffin a基因的獲得1、絲瓜籽總RNA的提取將北京產絲瓜籽置于預冷的研缽中，加入液氮迅速研磨成粉末狀，加入TRIzol試劑(Invitrogen公司)，4℃、120,000rpm離心10分鐘，取上清，加入200ul氯仿/1mL TRIzol，劇烈振搖15-30秒，室溫放置3分鐘，再4℃、120,000rpm離心15分鐘，取上層水相溶液，加入等體積異丙醇，混勻后室溫放置10分鐘，4℃120,000rpm離心10分鐘，棄上清，加入預冷的75％乙醇(用DEPC水配制)洗滌，放置至沉淀透明后，加入適量的無核酸酶的水溶解沉淀，得到絲瓜籽總RNA，-70℃保存備用。
2、反轉錄PCR擴增luffin α基因用Superscript II反轉錄酶(Invitogen公司)并參照說明書，取1ug步驟1獲得的絲瓜籽總RNA作模板，反轉錄合成其cDNA。結束后，取5ul反轉錄產物作模板，在上游引物Luffin-linker(F1)5’-ggAgAgATAATgAATTCAggCggTggCTTTCTgggATCCgCTgATgTgAggTTCAgTTTg(帶單下劃線堿基為連接肽(序列表中SEQ ID NO3)部分編碼序列)和下游引物LuffinKDEL/NotI5’-gAgTgCggCCgCTCATTA CgCAACATTTTgTTTgTAATT(帶單下劃線堿基為限制性內切酶Not I識別位點，方框內堿基為內質網定位信號(序列表中SEQ ID NO6)編碼序列)的引導下，PCR擴增絲瓜籽核糖體失活蛋白luffin α基因，PCR擴增體系為10×PCR緩沖液5ul，25mM MgSO46ul，上、下游引物各50pmol，10mM dNTPs 1ul，pyrobest聚合酶1U，補水至反應體系為50ul。PCR反應條件為先94℃ 30sec，55℃40sec，72℃ 1min，共25個循環；然后72℃延伸7分鐘。反應結束后，對PCR產物進行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，擴增片段大小約為800bp，與預期結果相符。
三、具有選擇性殺傷腫瘤新生血管內皮細胞作用的融合蛋白VEGF121/LuffinKDEL編碼基因的擴增以步驟二的PCR擴增產物為模板，在上游引物Luffin/MAG(F2)5’-ggCggTggCTTTCTgggAATTggTAAATTTTTgCACTCAgCAAAAAAATTTggAAAAgCTTTTgTgggAgAgATAATgAATTCA和下游引物LuffinKDEL/NotI5’-gAgTgCggCCgCTCATTA CgCAACATTTTgTTTgTAATT(帶單下劃線堿基為Not I識別位點，方框內堿基為內質網定位信號(序列表中SEQ ID NO6)編碼序列)的引導下進行PCR擴增，PCR反應條件為94℃ 23min，94℃ 30sec，55℃ 40sec，72℃ 60sec，共25個循環。再以此PCR擴增產物和步驟一獲得的VEGF121基因為模板，用接頭一延伸PCR的方法構建其融合基因，擴增引物為VEGF121F和LuffinKDEL/NotI，PCR反應條件為先94℃ 3min，94℃ 30sec，70℃ 10min；然后94℃ 40sec，55℃ 60sec，72℃ 90sec，共25個循環。反應結束后，對PCR產物進行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測。結果擴增片段大小約為1250bp，與預期結果相符。回收并純化該目的片段，將其用限制性內切酶Nde I和Not I進行雙酶切后與經相同酶雙酶切的載體pET30a(Novagen公司)連接，再將連接產物轉化大腸桿菌(E.coli) DH5 α感受態細胞，篩選陽性克隆，提質粒，得到含有目的基因的重組質粒，命名為pET30a-VEGF121-LuffinKDEL，對其進行測序，測序結果表明獲得了序列正確的通過連接肽連接的VEGF121和絲瓜籽核糖體失活蛋白Luffinα融合蛋白的編碼基因，將該基因命名為VEGF121-LuffinKDEL，具有序列表中SEQ ID N08的核苷酸序列，由1227個堿基組成，其編碼序列為自5’端第1-1227位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID N07的氨基酸殘基序列的蛋白質，自5’端第1-366位堿基為VEGF121的編碼序列，自5’端第367-471位堿基為連接肽的編碼序列，自5’端第472-1215位堿基為絲瓜籽核糖體失活蛋白Luffin α的編碼序列，自5’端第1215-1227位堿基為內質網定位信號的編碼序列。
實施例2、VEGF121-LuffinKDEL融合蛋白毒素在大腸桿菌中的表達和純化取10mL過夜培養的工程菌接種到1000mL含25ug/mL卡那霉素的LB液體培養基中，37℃培養至OD＝0.4-0.6，然后加入IPTG至終濃度為1mM，同時以未加IPTG的為對照，繼續誘導培養5小時。培養結束后，取500ul菌液，10000g離心2分鐘收集菌體，加入50ul上樣緩沖液，100℃變性5分鐘，12000g離心1分鐘，取10ul進行10％變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，檢測結果如圖1所示(泳道1為蛋白質分子量標準，泳道2為誘導前的菌體蛋白，泳道3為誘導后的菌體蛋白)，經IPTG誘導表達后，獲得了分子量為45Kd的重組蛋白，與預期結果一致。
離心收集菌體，將菌體溶于30mL 10mM Tris·HCl(pH6.5)中，加入溶菌酶(購自SIGMA公司)至終濃度1mg/mL，蛋白酶抑制劑PMSF(購自SIGMA公司)至終濃度100ug/mL，室溫放置30分鐘，冰浴，超聲破碎10分鐘，離心，收集沉淀，將沉淀溶于6M鹽酸胍中，按照Ni-NTA樹脂的操作說明純化蛋白，對所純化的蛋白進行10％變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，電泳完成后，考馬斯亮藍染色，脫色，檢測結果如圖2所示(泳道1為蛋白質分子量標準，泳道2為純化后的融合蛋白)，表明經純化獲得了純度較高的目的蛋白，將純化蛋白于-20℃保存。
實施例3、抑瘤實驗取5周齡Balb/c裸鼠，雌性，體重為18-20g，隨機分為2組，每組5只。體外培養A375細胞，每只裸鼠注射5×105人黑色素瘤A375癌細胞，以接種腫瘤當天為第一天，第三天給藥，劑量為15mg VEGF121-LuffinKDEL/kg體重，以注射相同體積的生理鹽水(saline)為對照。在不同時間測量對照組和試驗組(VEGF121-LuffinKDEL)小鼠腫瘤的大小。對結果數據進行一個重復測量的兩因素設計的方差分析，結果較對照組(saline)，VEGF121-LuffinKDEL組的P＜0.05，表明兩組間的差別具有顯著統計學意義。根據每組小鼠腫瘤大小的平均值繪出對照組(saline)和試驗組(VEGF121-LuffinKDEL)給藥后不同時間的腫瘤生長曲線，生長曲線如圖3所示，表明本發明的融合蛋白VEGF121-LuffinKDEL對腫瘤的生長具有顯著的抑制作用。
序列表<160>8<210>1<211>277<212>PRT<213>葫蘆科植物絲瓜(Luffa cylindrica)<400>1Met Lys Arg Phe Thr Val Leu Ile Leu Ala Ile Phe Leu Ala Ala Ser1 5 10 15Thr Val Glu Ala Asp Val Ser Phe Ser Leu Ser Gly Ser Ser Ser Thr20 25 30Ser Tyr Ser Lys Phe Ile Gly Asp Leu Arg Lys Ala Leu Pro Ser Asn35 40 45Gly Thr Val Tyr Asn Ile Thr Leu Leu Leu Ser Ser Ala Ser Gly Ala50 55 60Ser Arg Tyr Thr Leu Met Thr Leu Ser Asn Tyr Asp Gly Lys Ala Ile65 70 75 80Thr Val Ala Val Asp Val Thr Asn Val Tyr Ile Met Gly Tyr Leu Val85 90 95Asn Ser Thr Ser Tyr Phe Phe Asn Glu Ser Asp Ala Lys Leu Ala Ser100 105 110Gln Tyr Val Phe Lys Gly Ser Thr Ile Val Thr Leu Pro Tyr Ser Gly115 120 125Asn Tyr Glu Lys Leu Gln Thr Ala Ala Gly Lys Ile Arg Glu Lys Ile130 135 140Pro Leu Gly Phe Pro Ala Leu Asp Ser Ala Ile Thr Thr Leu Phe His145 150 155 160Tyr Asp Ser Thr Ala Ala Ala Ala Ala Phe Leu Val Ile Ile Gln Thr165 170 175
Thr Ala Glu Ala Ser Arg Phe Lys Tyr Ile Glu Gly Gln Ile Ile Glu180 185 190Arg Ile Ser Lys Asn Gln Val Pro Ser Leu Ala Thr Ile Ser Leu Glu195 200 205Ash Glu Trp Ser Ala Leu Ser Lys Gln Ile Gln Leu Ala Gln Thr Ash210 215 220Asn Gly Thr Phe Lys Thr Pro Val Val Ile Thr Asp Asp Lys Gly Gln225 230 235240Arg Val Glu Ile Thr Asn Val Thr Ser Lys Val Val Thr Lys Asn Ile245 250 255Gln Leu Leu Leu Asn Tyr Lys Gln Asn Val Ala Ala Phe Asp Glu Asp260 265 270Ile Pro Ala Lys His275<210>2<211>831<212>DNA<213>葫蘆科植物絲瓜(Luffa cylindrica)<400>2atgaagagat ttacagtgct aattctcgcc atcttccttg cagcttcaac tgttgaagcc 60gatgtgagct tcagtttgtc aggttcttcc tccacatctt atagcaagtt catcggagat120ctgaggaaag cacttccatc taatgggaca gtctacaaca taactctctt actctcctct180gcttcgggcg caagccgcta cactctcatg acactctcca attacgacgg caaagccatc240acggttgctg tagatgtaac caacgtttac attatgggct atctcgtcaa ttcaacatcc300tacttcttca acgagtctga tgctaaatta gcttctcaat acgtattcaa aggcagtacc360atcgtcacgc ttccatattc tggcaattac gaaaagcttc aaactgctgc aggcaagata420agagagaaga ttccacttgg attcccagct ttggacagtg cgattaccac cttgtttcat480tacgactcca cggctgctgc tgcggcattc ctcgtaatca ttcagaccac tgctgaggct540tccagattca agtatatcga gggacagatt attgagagaa tttcgaaaaa ccaggtgccg600agtctggcga ctataagttt agaaaacgaa tggtctgctc tctccaaaca aattcagttg660
gcacagacga ataacggaac gtttaaaact cccgttgtga taacggacga taaaggccaa720cgagttgaaa taaccaacgt tacgtcgaaa gttgtaacca agaacatcca attgcttcta780aattacaaac aaaatgttgc ggcttttgac gaggatattc ctgcaaaaca c 831<210>3<211>35<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
<400>3Gly Gly Gly Phe Leu Gly Ile Gly Lys Phe Leu His Ser Ala Lys Lys1 5 10 15Phe Gly Lys Ala Phe Val Gly Glu Ile Met Asn Ser Gly Gly Gly Phe20 25 30Leu Gly Ser35<210>4<211>405<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
<400>4Met Ala Pro Met Ala Glu Gly Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val1 5 10 15Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr
20 25 30Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe35 40 45Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp50 55 60Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln65 70 75 80Ile Met Arg Ile Lys Pro His Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser85 90 95Phe Leu Gln His Asn Lys Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala100 105 110Arg Gln Glu Lys Cys Asp Lys Pro Arg Arg Gly Gly Gly Phe Leu Gly115 120 125Ile Gly Lys Phe Leu His Ser Ala Lys Lys Phe Gly Lys Ala Phe Val130 135 140Gly Glu Ile Met Asn Ser Gly Gly Gly Phe Leu Gly Ser Ala Asp Val145 150 155 160Arg Phe Ser Leu Ser Gly Ser Ser Ser Thr Ser Tyr Ser Lys Phe Ile165 170 175Gly Asp Leu Arg Lys Ala Leu Pro Ser Asn Gly Thr Val Tyr Asn Ile180 185 190Thr Leu Leu Leu Ser Ser Ala Ser Gly Ala Ser Arg Tyr Thr Leu Met195 200 205Thr Leu Ser Asn Tyr Asp Gly Lys Ala Ile Thr Val Ala Val Asp Val210 215 220Thr Asn Val Tyr Ile Met Gly Tyr Leu Val Asn Ser Thr Ser Tyr Phe225 230 235 240Phe Asn Glu Ser Asp Ala Lys Leu Ala Ser Gln Tyr Val Phe Lys Gly245 250 255Ser Thr Ile Val Thr Leu Pro Tyr Ser Gly Asn Tyr Glu Lys Leu Gln260 265 270Thr Ala Ala Gly Lys Ile Arg Glu Lys Ile Pro Leu Gly Phe Pro Ala
275 280 285Leu Asp Ser Ala Ile Thr Thr Leu Phe His Tyr Asp Ser Thr Ala Ala290 295 300Ala Ala Ala Phe Leu Val Ile Ile Gln Thr Thr Ala Glu Ala Ser Arg305 310 315 320Phe Lys Tyr Ile Glu Gly Gln Ile Ile Glu Arg Ile Ser Lys Asn Gln325 330 335Val Pro Ser Leu Ala Thr Ile Ser Leu Glu Asn Glu Trp Ser Ala Leu340 345 350Ser Lys Gln Ile Gln Leu Ala Gln Thr Asn Asn Gly Thr Phe Lys Thr355 360 365Pro Val Val Ile Thr Asp Asp Lys Gly Gln Arg Val Glu Ile Thr Asn370 375 380Val Thr Ser Lys Val Val Thr Lys Asn Ile Gln Leu Leu Leu Asn Tyr385 390 395 400Lys Gln Asn Val Ala405<210>5<211>1215<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>5atggctccga tggcagaagg aggagggcag aatcatcacg aagtggtgaa gttcatggat 60gtctatcagc gcagctactg ccatccaatc gagaccctgg tggacatctt ccaggagtac120cctgatgaga tcgagtacat cttcaagcca tcctgtgtgc ccctgatgcg atgcgggggc180tgctgcaatg acgagggcct ggagtgtgtg cccactgagg agtccaacat caccatgcag240attatgcgga tcaaacctca ccaaggccag cacataggag agatgagctt cctacagcac300
aacaaatgtg aatgcagacc aaagaaagat agagcaagac aagaaaaatg tgacaagccg360aggcggggcg gtggctttct gggaattggt aaatttttgc actcagcaaa aaaatttgga420aaagcttttg tgggagagat aatgaattca ggcggtggct ttctgggatc cgctgatgtg480aggttcagtt tgtcaggttc ttcctccaca tcttatagca agttcatcgg agatctgagg540aaagcacttc catctaatgg gacagtctac aacataactc tcttactctc ctctgcttcg600ggcgcaagcc gctacactct catgacactc tccaattacg acggcaaagc catcacggtt660gctgtagatg taaccaacgt ttacattatg ggctatctcg tcaattcaac atcctacttc720ttcaacgagt ctgatgctaa attagcttct caatacgtat tcaaaggcag taccatcgtc780acgcttccat attctggcaa ttacgaaaag cttcaaactg ctgcaggcaa gataagagag840aagattccac ttggattccc agctttggac agtgcgatta ccaccttgtt tcattacgac900tccacggctg ctgctgcggc attcctcgta atcattcaga ccactgctga ggcttccaga960ttcaagtata tcgagggaca gattattgag agaatttcga aaaaccaggt gccgagtctg 1020gcgactataa gtttagaaaa cgaatggtct gctctctcca aacaaattca gttggcacag 1080acgaataacg gaacgtttaa aactcccgtt gtgataacgg acgataaagg ccaacgagtt 1140gaaataacca acgttacgtc gaaagttgta accaagaaca tccaattgct tctaaattac 1200aaacaaaatg ttgcg1215<210>6<211>4<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
<400>6Lys Asp Glu Leu1<210>7<211>409<212>PRT
<213>人工序列<220>
<223>
<400>7Met Ala Pro Met Ala Glu Gly Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val1 5 10 15Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr20 25 30Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe35 40 45Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp50 55 60Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln65 70 75 80Ile Met Arg Ile Lys Pro His Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser85 90 95Phe Leu Gln His Asn Lys Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala100 105 110Arg Gln Glu Lys Cys Asp Lys Pro Arg Arg Gly Gly Gly Phe Leu Gly115 120 125Ile Gly Lys Phe Leu His Ser Ala Lys Lys Phe Gly Lys Ala Phe Val130 135 140Gly Glu Ile Met Asn Ser Gly Gly Gly Phe Leu Gly Ser Ala Asp Val145 150 155 160Arg Phe Ser Leu Ser Gly Ser Ser Ser Thr Ser Tyr Ser Lys Phe Ile165 170 175Gly Asp Leu Arg Lys Ala Leu Pro Ser Asn Gly Thr Val Tyr Asn Ile180 185 190Thr Leu Leu Leu Ser Ser Ala Ser Gly Ala Ser Arg Tyr Thr Leu Met195 200 205
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<220>
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<400>8atggcaccga tggcagaagg aggagggcag aatcatcacg aagtggtgaa gttcatggat 60gtctatcagc gcagctactg ccatccaatc gagaccctgg tggacatctt ccaggagtac120cctgatgaga tcgagtacat cttcaagcca tcctgtgtgc ccctgatgcg atgcgggggc180tgctgcaatg acgagggcct ggagtgtgtg cccactgagg agtccaacat caccatgcag240attatgcgga tcaaacctca ccaaggccag cacataggag agatgagctt cctacagcac300aacaaatgtg aatgcagacc aaagaaagat agagcaagac aagaaaaatg tgacaagccg360aggcggggcg gtggctttct gggaattggt aaatttttgc actcagcaaa aaaatttgga420aaagcttttg tgggagagat aatgaattca ggcggtggct ttctgggatc cgctgatgtg480aggttcagtt tgtcaggttc ttcctccaca tcttatagca agttcatcgg agatctgagg540aaagcacttc catctaatgg gacagtctac aacataactc tcttactctc ctctgcttcg600ggcgcaagcc gctacactct catgacactc tccaattacg acggcaaagc catcacggtt660gctgtagatg taaccaacgt ttacattatg ggctatctcg tcaattcaac atcctacttc720ttcaacgagt ctgatgctaa attagcttct caatacgtat tcaaaggcag taccatcgtc780acgcttccat attctggcaa ttacgaaaag cttcaaactg ctgcaggcaa gataagagag840aagattccac ttggattccc agctttggac agtgcgatta ccaccttgtt tcattacgac900tccacggctg ctgctgcggc attcctcgta atcattcaga ccactgctga ggcttccaga960ttcaagtata tcgagggaca gattattgag agaatttcga aaaaccaggt gccgagtctg 1020gcgactataa gtttagaaaa cgaatggtct gctctctcca aacaaattca gttggcacag 1080acgaataacg gaacgtttaa aactcccgtt gtgataacgg acgataaagg ccaacgagtt 1140gaaataacca acgttacgtc gaaagttgta accaagaaca tccaattgct tctaaattac 1200aaacaaaatg ttgcgaaaga tgaactg 122權利要求
1.具有選擇性殺傷腫瘤新生血管內皮細胞作用的融合蛋白，是通過連接肽在絲瓜籽的核糖體失活蛋白Luffinα的氨基端連接VEGF121的融合蛋白。
2.根據權利要求1所述的融合蛋白，其特征在于所述連接肽的氨基酸殘基序列如序列表中的SEQ ID NO3所示。
3.根據權利要求2所述的融合蛋白，其特征在于所述融合蛋白是下述氨基酸殘基序列之一1)序列表中的SEQ ID NO4；2)將序列表中SEQ ID NO4的氨基酸殘基序列經過一至十個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有選擇性殺傷腫瘤新生血管內皮細胞作用的蛋白質。
4.根據權利要求1或2或3所述的融合蛋白，其特征在于所述融合蛋白還包含有內質網定位信號，所述內質網定位信號的氨基酸殘基序列如序列表中的SEQ IDNO6所示。
5.根據權利要求4所述的融合蛋白，其特征在于所述融合蛋白是下述氨基酸殘基序列之一1)序列表中的SEQ ID NO7；2)將序列表中SEQ ID NO7的氨基酸殘基序列經過一至十個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有選擇性殺傷腫瘤新生血管內皮細胞作用的蛋白質。
6.編碼權利要求1或2或3或4或5所述的具有選擇性殺傷腫瘤新生血管內皮細胞作用的融合蛋白的基因。
7.根據權利要求6所述的基因，其特征在于所述基因是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID NO5的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID NO4的DNA序列；3)與序列表中SEQ ID NO5限定的核苷酸序列具有90％以上同源性且具有選擇性殺傷腫瘤新生血管內皮細胞作用的核苷酸序列；4)在高嚴謹條件下可與序列表中的SEQ ID NO5限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。5)序列表中SEQ ID NO8的DNA序列；6)編碼序列表中SEQ ID NO7的DNA序列；7)與序列表中SEQ ID NO8限定的核苷酸序列具有90％以上同源性且具有選擇性殺傷腫瘤新生血管內皮細胞作用的核苷酸序列；8)在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID NO8限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
8.含有權利要求6或7所述具有選擇性殺傷腫瘤新生血管內皮細胞作用的融合蛋白基因的表達載體、轉基因細胞系和宿主菌。
9.一種權利要求1-5任一項所述具有選擇性殺傷腫瘤新生血管內皮細胞作用的融合蛋白的表達方法，是將權利要求6或7或8所述具有選擇性殺傷腫瘤新生血管內皮細胞作用的融合蛋白基因、該基因變異體或含有所述具有選擇性殺傷腫瘤新生血管內皮細胞作用的融合蛋白基因的重組表達載體轉化或轉導宿主細胞，培養宿主細胞，從培養基或細胞中分離純化蛋白，得到具有選擇性殺傷腫瘤新生血管內皮細胞作用的融合蛋白；所述含有具有選擇性殺傷腫瘤新生血管內皮細胞作用的融合蛋白的沖述重組表達載體為pET30a(+)-VEGF121/LuffinKDEL。
10.權利要求1-5任一項所述的具有選擇性殺傷腫瘤新生血管內皮細胞作用的融合蛋白或權利要求6-7任一項所述的具有選擇性殺傷腫瘤新生血管內皮細胞作用的融合蛋白基因在制備抗腫瘤藥物中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種具有選擇性殺傷腫瘤新生血管內皮細胞作用的融合蛋白與應用。該融合蛋白是通過連接肽在絲瓜籽的核糖體失活蛋白Luffinα的氨基端連接VEGF
文檔編號C12N15/62GK101070349SQ20071009948
公開日2007年11月14日 申請日期2007年5月22日 優先權日2007年5月22日
發明者孫紅琰, 周滿祥, 申云飛 申請人:山西康寶生物制品股份有限公司, 周滿祥, 孫紅琰 被以下專利引用 (2),