中藥組合物聯合抗生素在制備抑制炎癥因子藥物方面的應用的制作方法

本發明涉及醫藥技術領域，更具體地，涉及一種中藥組合物聯合抗生素在制備抑制炎癥因子藥物方面的應用。

技術背景

研究發現，感染和炎癥發生時，患者體內血漿內毒素、血漿一氧化氮、血漿腫瘤壞死因子大量產生，水平高于正常值。腫瘤壞死因子(TNF-α)是活化單核-巨噬細胞產生的一種重要細胞因子，在感染性疾病和炎癥方面，能刺激血管內皮細胞表達黏附分子、刺激單核-巨噬細胞和其他細胞分泌趨化性細胞因子，引起白細胞在炎癥部位聚集，促進炎癥反應，過度反應的過量TNF-α，則產生劇烈免疫反應，呈現毒性作用，對機體造成損害。一氧化氮(nitricoxide，NO)由巨噬細胞分泌，能和超氧陰離子反應形成過氧亞硝酸陰離子(peroxynitrite，ONOO-)，它再分解為毒性更大的OH-和NO2，后者進入靶細胞或鄰近細胞，引起細胞毒作用或損傷組織。內毒素(LPS):淋巴細胞作為機體重要的免疫細胞，其可能是通過Toll樣受體4(Toll-likereceptor4，TLR4)及核因子κB(NuclearFactorKappaB，NF-κB)途徑，合成并釋放包括TNF-α及IL-6在內的多種促炎因子，加強炎癥反應，使得促炎/抑炎失衡，導致炎癥反應擴大化及免疫紊亂。在上述反應途徑中，TLR4為內毒素有效成分脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)的特異性配體，可以與LPS結合，啟動炎癥反應，而NF-κB作為TLR4反應鏈下游的主要因子，可以與多種促炎因子的基因啟動序列相結合，合成和釋放相應的炎癥因子。

目前未見中藥組合物與抗生素聯合應用于制備抑制炎癥因子的相關技術報道。

技術實現要素：

本發明要解決的技術問題是填補現有中藥組合物聯合阿奇霉素的應用技術不足，提供一種中藥組合物聯合抗生素在制備抑制炎癥因子藥物方面的應用。

本發明的目的通過以下技術方案予以實現：

提供中藥組合物聯合抗生素在制備抑制炎癥因子藥物方面的應用，所述炎癥因子包括血漿內毒素、血漿一氧化氮和/或血漿腫瘤壞死因子；所述抗生素為阿奇霉素；所述中藥組合物的活性成分由千斤拔、穿心蓮、金櫻根、功勞木、單面針、雞血藤和黨參組成。

優選地，所述中藥組合物聯合阿奇霉素可以很好地應用于制備治療慢性盆腔炎、子宮炎癥和/或卵巢炎癥的藥物方面。

優選地，所述中藥組合物中，黨參、穿心蓮和單面針的摻入量各為藥材總重量的9％；金櫻根、雞血藤、功勞木和千斤拔的摻入量各為藥材總重量的16％。

優選地，所述應用是將中藥組合物聯合阿奇霉素應用于制備靶向抑制血漿內毒素、血漿一氧化氮和血漿腫瘤壞死因子藥物方面。

本發明的有益效果是：

阿奇霉素適用于敏感細菌所引起的感染，包括支氣管炎、肺炎等下呼吸道感染，皮膚和軟組織感染，急性中耳炎，鼻竇炎、咽炎、扁桃體炎等上呼吸道感染。本發明將其與由千斤拔、穿心蓮、金櫻根、功勞木、單面針、雞血藤和黨參組成七味藥組成的中藥組合物聯合應用，在抑制炎癥因子方面具有良好的應用效果，并通過大量動物實驗證明中藥組合物和阿奇霉素發揮協同作用，實現靶向治療感染和炎癥，為中藥組合物和阿奇霉素的新領域聯合應用提供了有力技術支持。

附圖說明

圖1藥物聯合治療前后血漿內毒素變化情況。

圖2藥物聯合治療前后血漿一氧化氮變化情況。

圖3藥物聯合治療前后血漿腫瘤壞死因子變化情況。

圖4檢測NO用的NaNO₂標準液的稀釋步驟示意圖。

具體實施方式

下面結合具體實施例進一步說明本發明。下述實施例僅用于示例性說明，不能理解為對本發明的限制。除非特別說明，下述實施例中使用的原料為常規市購或商業途徑獲得的原料，除非特別說明，下述實施例中使用的方法和設備為本領域常規使用的方法和設備。

實施例1

1.實驗菌種：金黃色葡萄球菌(ATCC25923)，大腸埃希菌(ATCC25922)購買于中國國家菌種庫。受試菌株凍干粉用無菌M-H(B)培養基混懸后均勻鋪于無菌M-H(A)平板表面，35℃孵育過夜復活，18h后平板表面生長出菌苔，選取其中長勢良好的單一菌團，重新涂抹于M-H(A)斜面，相同條件下孵育18h，密封，4℃條件下冷藏保存；試驗前一天取斜面菌涂抹于M-H(A)平板，35℃孵育過夜，即可使用。所有操作均在超凈工作臺完成。

2.菌液制備方法

方法一：(高濃度菌液制備)

挑3～4個單菌落于40毫升的M-H(B)培養基中。受試菌隔夜增菌培養16小時(37℃，水浴搖床振搖16小時)，次日取出原菌液用全波長多功能讀數議測OD值(細菌生長飽和期)；取20mL，分裝于離心管中，每管2mL，離心10000-15000rpm/min，10分鐘，棄取上清液之中的M-H(B)，用2mL生理鹽水混勻后，再離心15000rpm/min，10分鐘，棄取上清液中的生理鹽水，收集細菌細胞菌體2mL。將相同方法培養的金色葡萄球菌和大腸埃希菌按1：1混合即獲得4mL混合菌液。將該菌液為100菌液濃度，用生理鹽水進行10倍稀釋，稀釋至0.1×100，0.01×100，備用(共3個劑量)。

方法二：(低濃度菌液制備)

挑單一菌落(包括金色葡萄球菌和大腸埃希菌)于2毫升的生理鹽水中，分別配制成為0.5麥氏濃度(約1×108CFU·mL^－1)細菌混懸液，將金色葡萄球菌和大腸埃希菌混懸液混合，即得到混合菌液4mL。將該菌液設置成為10A菌液濃度，用生理鹽水進行對倍稀釋，稀釋至0.5×10^A，0.25×10^A，備用(共3個劑量)。

3.藥品與試劑：M-H(A)培養基(OXOID公司，生產批號：CM0337A)；M-H(B)培養基(OXOID公司，生產批號：CM0405B)；烏拉坦溶液(20％)；生理鹽水(四川科倫藥液股份有限公司，生產批號：M12012004)；其他試劑和耗材均由成都雅榮生化設備經營部購買提供。

4.儀器：電熱恒溫培養箱(上海一恒科技有限公司，BPH-9162)；優普系列超純水機(成都超純科技有限公司，UpK-1-10T)；微量加樣器(EppendorfResearch，10、100、100uL)；空氣浴振蕩器(哈爾濱市東聯電子技術開發，HZQ-C)；自動電熱壓力蒸汽滅菌鍋(上海申安醫療器械廠，LDZX-40BI)；全波長多功能讀數議(美國Thermo)；菌落計數儀。

5.LPS(內毒素)、NO(一氧化氮)的檢測方法

參照試劑盒使用說明書，進行相關檢測。

(1)LPS

1、加樣：分別設標準孔、待測樣品孔、空白孔。設標準孔5孔，依次加入50μL不同濃度的標準品(見試劑準備2)。空白孔加50μL(見試劑準備第二步最后一管)，余孔加待測樣品50μL，然后立即每孔加檢測溶液A工作液50μL，輕輕振動，混勻，注意不要有氣泡，酶標板加上覆膜，37℃溫育1小時。

2、棄去孔內液體，每孔用350μL的洗滌液洗滌，浸泡1-2分鐘，吸去(不可觸及板壁)或甩掉酶標板內的液體，在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標板朝下用力拍幾次(也可輕拍將孔內液體拍干)，重復洗板3次。最后一次洗滌后，要把孔內的洗滌液完全甩干。自動洗板機亦可。

3、每孔加檢測溶液B工作液(臨用前配制)100μL，加上覆膜，37℃溫育30分鐘。

4、棄去孔內液體，甩干，洗板5次，方法同步驟2。

5、每孔加底物溶液90μL，酶標板加上覆膜，37℃避光顯色(反應時間控制在15-25分鐘，不要超過30分鐘。當標準孔的后面3孔有明顯的梯度藍色，前3孔梯度不明顯時，即可終止)。

6、每孔加終止溶液50μL，終止反應，此時藍色立轉黃色。終止液的加入順序應盡量與底物溶液的加入順序相同。如出現顏色不勻一，請輕輕晃動酶標板以使溶液混合均勻。

7、在確保酶標板底無水滴及孔內無氣泡后，立即用酶標儀在450nm波長測量各孔的光密度(O.D.值)。

(4)NO檢測

1、NaNO₂標準液的稀釋：

取試管7支，依次標號1～7。用滴定管1號依次向2～7號試管加入雙蒸水1ml，用滴定管2號向1號試管加入NaNO₂標準液2ml，再用滴定管2號從1號試管吸出1ml液體加入2號試管，混勻，再吸出1ml液體加入3號試管，混勻。重復此步驟。當從6號試管吸出1ml液體時棄去。稀釋步驟見圖4。

2、用滴定管3號依次向1～7號試管加入1％磺胺0.5ml。

3、用滴定管4號依次向1～7號試管加入0.1％N-1-萘基乙二胺鹽酸0.5ml。

4、依次混勻1～7號試管內液體，于常溫下孵育20分鐘。

5、用7號試管內液體作為對照組，用分光光度計分別測定1～6號試管內液體的吸光度值并記錄。

6、用滴定管滴加液體時應注意每一只滴定管只能用于每一種試劑，切忌混用。

6.模型制備

具體操作方法：大鼠稱重標記，腹部常規消毒，20％烏拉坦0.5mL/100g腹腔注射麻醉，用1mL注射器抽取預先制備的混合菌液，左手持鼠尾提起大鼠，用10mL注射器磨去針頭尖，于陰道底部的子宮頸分叉處小心進入一側宮腔內，針頭在宮腔內來回抽拉2次以機械性損傷子宮內膜組織，然后朝卵巢方向推注菌液0.1mL，同樣操作步驟將0.1mL菌液注入另一側子宮，注射完畢后，倒置大鼠5min，以防菌液漏出。分別于24h，48h觀察記錄各組大鼠感染情況，以大鼠無死亡，于造模后24h、72h、96h后分別陰道刮片，進行菌落培養，選擇菌落計數≥30，≤100的感染菌量作為最佳感染菌量。將該菌量作為體內感染的菌量。受試大鼠感染菌量為：

表1

所有實驗動物于造模后24h、72h和96h，麻醉，常規消毒腹部，用無菌棉簽伸入宮口，來回抽拉2次后，將棉簽放入含2mL生理鹽水的試管中，獲得含測試品混懸液，取出棉簽，再用新的無菌棉簽充分蘸取混合液均勻涂抹于無菌M-H(A)平板表面，35℃孵育過夜，18h后進行菌落計數。240h犧牲動物，觀察子宮感染情況。各組典型鼠感染菌落計數，結果如下表2：

表2受試大鼠感染菌量

所有實驗動物于造模后24h、72h和96h，麻醉，常規消毒腹部，用無菌落計數結果顯示，3組鼠所感染菌量符合實驗要求。同時，解剖后可見子宮等直觀可見炎性充血與炎性水腫。

7.試驗過程

模型及分組150只大鼠(雌性SPF級SD大鼠，220g±20g，由四川省醫學科學院實驗動物研究所購得，實驗動物生產許可證號：SCXK(川)2008-24)。16只用于空白，另行飼養。其余均采用造模方法麻醉后注射混合菌液。觀察5日，每日均隨機抽取6只及空白組2只麻醉后采集陰道分泌物用于細菌涂片。5日后存活大鼠隨機分為3組，即model、AZM、AZMDG(分別表示不予治療的模型組、單獨使用阿奇霉素組、阿奇霉素中藥組合物合并組)。

Model：不予治療的模型組。

AZM：阿奇霉素治療模型組。

AZMDG：阿奇霉素+以千斤拔、穿心蓮、金櫻根、功勞木、單面針、雞血藤、黨參按照婦科千金片配方中的比例和方法制得組合物聯合治療模型組。

1.受試劑量

(1)AZM劑量：本實施例對阿奇霉素(AZM)的可選受試劑量進行了分析和確定，目的為選擇一個試用后作用強度適中、時長適中的受試劑量，同時明確同中藥合并用藥時的時程長度。預試60、30、20、10mg/kg.d三天，發現原設定劑量過高，最終采用10mg/kg.d。

(2)受試藥物劑量：

根據研究結果，原設定中藥組合物的劑量為2.058g/kg.d，但預試發現，此劑量采用最大給容積配制的給藥液為稀漿狀，無法通過灌胃針頭。調整本發明中藥組合物AMZDG為1.41g/kg.d。

2.給藥時間

除空白和模型外，造模后第六日開始給予相應藥物。AZM與各中藥分別給予，相差時間約2小時。所有給藥組在8點左右均先給予相應劑量的AZM，兩個小時后開始給予相應的中藥生理鹽水水混物。

3.樣本收集

第1日給予AZM兩小時后，經尾靜脈采集各組大鼠末梢靜脈血。從第二日始各給藥組大鼠每日兩次采血，于給予阿奇前和給予中藥前各經尾靜脈采集一次，每次采集血量約0.3mL，取樣時間誤差約30min。于給藥第2、4、6、8日給予AZM兩小時后，各組麻醉后犧牲約2～4只大鼠，采集下腔動脈抗凝全血。

4.送樣測試

所有時間點0.3mL及末次全血，取約0.2mL血漿用于末次抗凝全血送檢血細胞計數、血流變。末次血漿用于檢測LPS、TNF-α、NO。

實驗結果見圖1至圖3所示。結果顯示，實驗動物造模后，3種炎癥因子水平與正常組比較均明顯升高，給予不同的藥物組合治療后，各系數都降低，趨向于回復正常水平。各治療組之間的治療效果比較，血漿內毒素：AZMDG>AZM；血漿一氧化氮：AZMDG>AZM。

以上結果表明，表明慢性盆腔炎模型大鼠血漿內毒素、血漿一氧化氮由于感染和炎癥的發生，導致這兩種炎癥因子大量產生，使其水平高于正常值；在給予藥物治療后，炎癥因子水平均趨于恢復正常水平，藥物之間的作于強度為：AZMDG>>AZM。

實施例2試驗研究

1.研究對象：選擇門診自愿2014年6月至2015年2月，因月經失調、陰道不規則出血、下腹墜痛或白帶增多，經過診斷為盆腔炎患者30例，年齡35～52歲。

2.所有患者在治療前均常規檢查血常規、肝和腎功能，取末次血漿用于檢測LPS、NO。LPS、NO明顯升高患者給予本發明中藥組合物(以千斤拔、穿心蓮、金櫻根、功勞木、單面針、雞血藤、黨參按照婦科千金片配方中的比例和方法制得組合物，湯劑或片劑)和阿奇霉素(參照阿奇霉素規定劑量)，阿奇霉素與本發明中藥組合物分開服用，相差時間約2小時。連續服藥2周。治療期間每周復診1次，復查血常規、LPS、NO指標、肝和腎功能，了解用藥后不良反應及月經情況。無失訪病例。

3.臨床癥狀：有陰道出血者均在用藥后3～5天內血止，下腹墜痛或白帶增多情況消失或減輕，檢測LPS、NO回復正常水平。

統計結果顯示，30例中，顯效10例，占33.3％；有效16例，53.4％；無效4例，占13.3％；總有效率為86.7％。