專利名稱：一種生產生物酶制劑和酵母飼料蛋白的方法
技術領域：
本發明屬于生物工程領域，具體地，本發明涉及一種生產生物酶制劑和酵母 飼料蛋白的方法。
背景技術：
隨著經濟的飛速發展和技術的不斷進步，自20世紀60年代以來，味精生產 量逐年上升,目前我國已經成為味精的生產和消費大國。味精產量的不斷提高，味 精工業廢水對環境造成的污染問題日趨突出。而這些廢水的主要來源是在味精提 取過程中產生的離子交換尾液(簡稱離交尾液)。味精廢水的離交尾液中COD (化 學需氧量)、硫酸根和氨氮的含量非常高。因此味精廢水的處理成為制約味精生 產企業發展的重大難題。
近年來，國內外眾多專家對味精廢水的治理進行了大量研究，主要方法包括 物化處理、厭氧生物處理和好氧生物處理法。物化處理法COD去除率僅達30 40 %。厭氧生物處理雖然運行費用較低，但在厭氧環境下，高濃度氨氮和硫酸根對 甲烷菌具有較強的毒害和抑制作用，因此一般要采用預先脫硫脫銨、稀釋進水等
措施，從而增加處理成本。好氧生物處理在處理高濃度有機廢水時易產生污泥膨 脹，因此也必須將廢水大量稀釋。目前一些味精廠利用離交尾液生產詞料酵母(通 常是熱帶假絲酵母和產朊假絲酵母)，這種方法能夠去除40% 60n/。的COD，而 且產生的菌體能夠作為飼料蛋白得到利用。但飼料酵母法要求經常性地進行菌種 培養和比較嚴格的無菌條件，同時利用該法生產的細胞培養液中細胞干物質較低， 約20 30g/L，這樣在后提取過程中需要消耗大量的熱能和電能，使得生產成本居高不下，而且由于上述酵母不能夠利用銨基氮因而生產的酵母蛋白產品仍含有較 高的銨基氮，對產品的質量影響較大。因此尋求一種較理想的解決方案是擺在科 研人員面前的一項重大課題。
磷是動物生長、繁殖、骨骼礦化及代謝所必需的礦物元素之一。作為動物飼 料主要成分的植物性飼料中雖含有相當數量的總磷，但其中50% 70%是以植酸 磷(六磷酸肌醇)的形式存在，單胃動物缺乏分解植酸磷所必需的酶，故磷的利用 率僅有0 % 40 %，從而造成磷源浪費、飼料成本增加和動物生產性能的降低。同 時，植酸磷不能被動物有效利用，而直接排出體外還會造成嚴重的土壤和水源的 磷污染。另外，植酸磷在動物胃腸道的消化吸收過程中，還會與多種金屬離子和 蛋白質螯合成相應的不溶性復合物，影響這些營養元素的有效利用。
植酸酶可使植酸磷降解成肌醇和磷酸，其對單胃動物的飼喂效果己得到了廣 泛的確證。它可使植物性飼料中磷的利用率提高60%，糞便中磷的排出量減少40 %，從而減少飼料中無機磷的添加量，它還可降低植酸鹽的抗營養作用，因此對提 高畜牧生產效益及降低其對環境的污染有重要意義。植酸酶廣泛存在于微生物、 麥芽、種子等中，但含量低，難以獲得大量產品，價格昂貴，從而一直限制著植 酸酶的推廣利用。通過基因工程的手段，已經實現了在生物反應器中高效表達植 酸酶基因，從而大幅度降低了植酸酶生產的成本。
畢赤酵母本身具有很好的安全性，自20世紀70年代起建立的以巴斯德畢赤 酵母作為單細胞蛋白生產菌的高密度發酵方法己經成熟，干細胞產量可高達100g/ L。同時，利用基因工程構建的重組酵母中也不帶任何抗藥性標記，所以重組酵母 本身作為飼料蛋白是安全的
發明內容
為了解決氨基酸生產過程中離交尾液的污染和再利用問題，本發明的發 明人提出并完成了本發明。
本發明的目的是提供一種生產生物酶制劑和酵母飼料蛋白的方法。
根據本發明的方法以表達所述生物酶的重組畢赤酵母為出發菌株，以氨基酸 生產離子交換尾液為基礎發酵培養基，經種子培養、液體深層發酵和離心分離制 得所述的生物酶制劑和酵母飼料蛋白。本領域普通技術人員可以根據實際的研究 和生產需求，將某特定酶的編碼基因導入畢赤酵母中，從而構建重組畢赤酵母。 巴斯德畢赤酵母是近十年來發展起來的較為完善的，被廣泛用來表達外源蛋白的 甲醇營養型酵母菌。在高效表達載體中最常用的啟動子是A0X1啟動子，它的甲 醇誘導性很強，使在它控制下的外源基因能得到較高的表達。PGAP(三磷酸甘油醛 脫氫酶啟動子)是最近在巴斯德畢赤酵母中克隆到的一個組成型啟動子，由于該 組成型啟動子不需甲醇誘導，發酵工藝更為簡單，而同時其產量很高，所以成為代 替PA0X1的最有潛力的啟動子。根據本發明的方法，可以將大腸桿菌的植酸酶 appA克隆到PGAP啟動子上，在流加葡萄糖的情況下可以組成性高效表達植酸酶， 來源于大腸桿菌的植酸酶appA具有優良的酶學性質和較高的比活。
根據本發明的方法，其中，所述酶為能在畢赤酵母中組成性表達的酶，優 選植酸酶、木聚糖酶、葡聚糖酶、纖維素酶、淀粉酶或半乳糖苷酶、更優選 來源于大腸桿菌的植酸酶appA。
根據本發明的方法，其中，所述氨基酸為可用離子交換方法提取的氨基酸， 優選谷氨酸或賴氨酸。
根據本發明的方法，其中，在所述種子培養步驟中
所用種子培養基配方1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖；培養條件培養時間為20~24小時，溫度30'C，搖床轉速為250rpm。 根據本發明的方法，其中，在所述液體深層發酵步驟中
所用發酵培養基配方氨基酸生產離子交換尾液300 kg/噸、KH2P04 5 kg/ 噸、CaS04 l.Okg/噸、MgS04 8kg/噸、用KOH調pH值5.0，培養過程中連續流 加50%的葡萄糖，流加量為2 10ml/L/h;
發酵培養條件在5L發酵罐中，發酵時間60 64小時，溫度30'C，通風量 1.5 2.0wm，攪拌轉速1000 rpm ， pH值用氨水維持在5.0，發酵過程溶氧不低于 20%。
本發明提出了一種處理工業廢水的方法，氨基酸生產過程中的離子交換尾液 通過液體深層發酵生產飼料用酶制劑和酵母飼料蛋白，利用重組畢赤酵母在富含 銨基氮的離子交換尾液中快速生長，并可以大幅度降低發酵液中銨基氮離子，提 升酵母蛋白產品的品質。根據本發明的方法，不僅減少了工業廢水的處理成本， 降低了對環境的污染，而且還將工業廢水變廢為寶，生產出較高價值的產品；用 該工業廢水經液體深層發酵可制備植酸酶，酶活達到3025 u/ml，可添加到飼料中。 植酸酶可使飼料中的植酸磷降解成肌醇和磷酸，提高植物性詞料中磷的利用率， 減少動物糞便中磷的排出量，從而減少飼料中無機磷的添加量，因此對提高畜牧
生產效益及降低其對環境的污染有重要意義。
圖1為發酵過程培養曲線。
具體實施例方式
培養基成份
種子培養基(YPD): 1%酵母提取物(進口)， 2%蛋白胨(進口)， 2%葡萄糖發酵培養基離子交換尾液300 kg/噸、KH2P04 5 kg/噸、CaS04 1.0 kg/噸、 MgSO48kg/噸、用KOH調pH值5.0。
PTM1成份
硫酸銅6.0g/L，碘化鉀0.18 g/L，硫酸錳10 g/L，鉬酸鈉0.2 g/L，硼
酸0.02 g/L，氯化鈷0.5 g/L，氯化鋅20 g/L，硫酸亞鐵65 g/L，硫酸5.0 mL/L(以
上成份配制后單獨高壓滅菌)，生物素0.2g/L(過濾滅菌)。
1、 種子液制備
從斜面上刮取兩環菌種，置于裝有50 ml種子培養基的250 ml三角瓶中進行 種子培養。條件為培養時間24小時，溫度30 °C，搖床轉速250 rpm。再以10% 接種量接入裝有200 ml種子培養基的1000 ml三角瓶中進行發酵培養。條件為培 養時間24小時，溫度3(TC，搖床轉速250rpm。此時菌液的0D值應達到12(以上)。
2、 發酵生產
在5L發酵罐內裝3.0 L發酵培養基滅菌后，按每升培養基加入4.37mL PTM1 ， 5 10%接種種子液，溫度30。C，通風量為1.6 0L/L/min， 1000卬m攪拌培養，培養過 程中連續流加50% (w/v)葡萄糖(每升中含12mLPTMl)，流加量為2 8mL/h/L， pH用氨水維持在5.0，溶氧維持在20%以上。培養結束時，酶活可以達到3025 U/mL，菌體干重達到120-130 g/L (如圖1所示)。
3、 植酸酶活性測定的原理與定義
植酸酶在一定溫度和pH條件下，水解底物植酸鈉，生成正磷酸和肌醇衍生物， 在酸性溶液中，用釩鉬酸銨處理會生成黃色的(NH4)3P04NH4V03 '16MoCb復合 物，在波長415nm下進行比色測定。樣品在底物濃度為5.0mmol/L、溫度37。C、 pH值5.0的條件下，每分鐘從植 酸鈉中釋放l^mol無機磷，即為一個植酸酶活性單位，以U表示。
權利要求
1、一種生產生物酶制劑和酵母飼料蛋白的方法，其特征在于，所述方法以表達所述生物酶的重組畢赤酵母為出發菌株，以氨基酸生產離子交換尾液為基礎發酵培養基，經種子培養、液體深層發酵和離心分離制得所述生物酶制劑和酵母飼料蛋白。
2、 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述酶為能在畢赤酵母中組成性表達的酶。
3、 根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述酶為植酸酶、木聚 糖酶、葡聚糖酶、纖維素酶、淀粉酶或半乳糖苷酶。
4、 根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述酶為來源于大腸桿菌 的植酸酶appA。
5、 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述氨基酸為可用離子 交換方法提取的氨基酸。
6、 根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述氨基酸為谷氨酸或 賴氨酸。
7、 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，在所述種子培養步驟中 所用種子培養基配方1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖；培養條件培養時間為20-24小時，溫度3(TC，搖床轉速為250rpm。
8、 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，在所述液體深層發酵步驟中所用發酵培養基配方氨基酸生產離子交換尾液300 kg/噸、KH2P04 5 kg/ 噸、CaS04 l.Okg/噸、MgS04 8kg/噸、用KOH調pH值5.0，培養過程中連續流 加50%的葡萄糖，流加量為2 10ml/L/h;發酵培養條件在5L發酵罐中，發酵時間60-64小時，溫度30'C，通風量 1.5 2.0vvm，攪拌轉速1000 rpm , pH值用氨水維持在5.0，發酵過程溶氧不低于 20%。
全文摘要
本發明屬于生物工程領域，具體地，本發明涉及一種生產生物酶制劑和酵母飼料蛋白的方法。根據本發明的方法以表達所述生物酶的重組畢赤酵母為出發菌株，以氨基酸生產離子交換尾液為基礎發酵培養基，經種子培養、液體深層發酵和離心分離制得所述含生物酶制劑和酵母飼料蛋白。根據本發明的方法，不僅減少了工業廢水的處理成本，降低了對環境的污染，而且還將工業廢水變廢為寶，生產出較高價值的產品。植酸酶可使飼料中的植酸磷降解成肌醇和磷酸，提高植物性飼料中磷的利用率，減少動物糞便中磷的排出量，從而減少飼料中無機磷的添加量，因此對提高畜牧生產效益及降低其對環境的污染有重要意義。
文檔編號C12N1/19GK101298596SQ20071009895
公開日2008年11月5日 申請日期2007年4月30日 優先權日2007年4月30日
發明者史秀云, 斌 姚, 昆 孟, 楊培龍, 柏映國, 王亞茹, 石鵬軍, 羅會穎, 袁鐵錚, 黃火清 申請人:中國農業科學院飼料研究所