專利名稱：光電化學檢測核酸現場損傷的方法及傳感器的制作方法
技術領域：
本發明涉及檢測技術領域，是通過光電化學方法對化學物質的基因毒 性進行定性定量檢測的一種光電化學檢測核酸現場損傷的方法及傳感器。
背景技術：
隨著我國工業化程度的提高，大量的化學物質進入生態環境。據統計，
已合成的化學物質總計近10萬，而且每年還有新合成化合物IOOO種。這
些物質對人體有潛在的危害，其中一些化合物已經被證實具有致突變、致 癌、致畸變等遺傳毒性。目前評定化合物對機體的毒性作用，主要是通過 細胞和動物實驗方法進行，實驗周期長，人力、物力耗費大，而且無法在 分子水平上準確提供關于化合物結構與毒性關系的信息。核酸損傷的分子
標記物，如DNA加和物和氧化產物，可以通過色譜/質譜等分離-檢測聯用 技術準確測量。這種方法要求對核酸樣品進行復雜的前處理，而且需要復 昂貴的大型儀器。上述這些原因致使絕大部分化學物質沒有毒性測試數 據，國家的環境安全和人民群眾的生活質量受到嚴重威脅。
近年來，隨著分子生物學和分子毒理學的迅速發展，各種新興的分子 生物學技術和生物分子標志物被用于核酸損傷檢測，其中包括單細胞凝膠
電泳技術(即彗星試驗)、DNA加合物測定(免疫法、熒光法和32P-后標記 法)和基因傳感器技術(參考，周啟星等，生態毒理學，科學出版社，2004)。 上面大多數都是細胞試驗，雖然周期從動物試驗的幾個月縮短到幾天，但 時間仍然偏長。而且試驗涉及多個步驟，操作需要專業人員在細胞實驗室 進行，沒有并行性，不適合環境化合物的大規模篩查。基因傳感器技術具 有高通量、高并行性的優勢，不過涉及到復雜的樣品前處理(核酸提取和 標記)、探針設計和嚴格的雜交條件，加上復雜、昂貴的光學檢測儀器， 不禾U于普及、推廣(參考E. F. Nuwaysir等，Molecular Carcinogenesis， 24: 153 (1999))。
因此，有必要研究簡單、快速的遺傳毒性檢測方法和傳感技術，對已 經存在的和新合成的化學物質的毒性進行大規模篩査。
發明內容
本發明的目的是提供一種光電化學檢測核酸現場損傷的方法，該方法 可以定性定量的確定待測分析物的基因毒性。
為達到上述目的，本發明的技術解決方案是 一種光電化學檢測核酸現場損傷的方法，包括
(a) 將可能具有基因毒性的分析物與核酸接觸；
(b) 如果待測分析物需要活化后才表現出基因毒性，則用相應的酶作為 活化劑；
(c) 用光電化學活性分子作為信號指示劑；
(d) 評價所述分析物和核酸之間的結合和/或反應，即在電極存在的情況
下，評價光電信號分子在光的作用下和電極之間電子轉移所產生的電流， 根據核酸和分析物接觸前后光電流響應的不同，對所述分析物的基因毒性 進行定性或定量分析。
所述分析物為單環芳烴、多環芳烴、芳香胺類化合物、N-亞硝胺類化 合物、黃曲霉素或其代謝物。
所述分析物為金屬離子、非金屬離子，包括鎘、鎳、鈷、鐵、銅、 汞、鉛、硒、砷、磷、氯等，或其有機、無機化合物。
所述核酸，為核糖核酸、脫氧核糖核酸或寡核苷酸。
所述電極為二氧化錫電極，所述光電活性分子是金屬與有機配體的絡 合物。所述的金屬為釕或鋨，所述的有機配體為聯吡啶、連吡嗪、聯三 吡啶、菲酚、酞氰染料、取代的聯吡啶、取代的連吡嗪、取代的聯三吡啶 或取代的菲酚。
所述分析物活化，為所有酶參與的可將間接基因毒性物質轉化為直接
基因毒性物質的反應；或所有酶參與的可催化產生H202的反應，H202 和分析物質一起作用，具有基因毒性。
所述將間接基因毒性物質轉化為直接基因毒性物質的酶，為細胞色素 P450、血紅蛋白、肌紅蛋白或辣根過氧化酶；所述可催化產生H202的酶 為氧化酶，包括葡萄糖氧化酶、尿酸氧化酶、D-氨基酸氧化酶、L-氨基酸 氧化酶、L-a-羥基酸氧化酶、單胺氧化酶或黃嘌呤氧化酶。
所述評價分析物和核酸之間的結合和/或反應，為所有改變核酸結構的 結合和/或反應，包括核酸堿基脫落、堿基垸基化、堿基氧化修飾、鏈斷裂、 鏈交聯、嵌入劑嵌入核酸堿基。
所述評價為在電極和再生劑存在的情況下用光將具有光電化學活性 的分子轉化成激發態，并且測定激發分子和電極之間的電子轉移所產生的 電流。電子轉移后產生的處于基態的被氧化或被還原的光電化學活性分子 被再生劑還原或氧化再生，可以被再次激發。核酸現場損傷前后結合光電 信號分子的量不同，產生的光電流也就不同，評價核酸現場損傷前后光電 流的變化。或在電極的情況下用光將具有光電化學活性的分子轉化成激發 態，被激發的物質失去電子后，與核酸堿基進行氧化還原反應，評價核酸 現場損傷前后氧化還原反應所產生的電流的變化。
本發明的第二個目的是提供一種光電化學檢測核酸現場損傷的傳感
器0
光電化學檢測核酸現場損傷的傳感器，包括
(a) 在合適條件下可以與分析物結合或反應的核酸探針；
(b) 具有光電化學活性的信號分子；
(c) 可以將間接基因毒性物質活化的酶；
(d) 適合分析光電信號分子與電極之間的電子轉移所產生的電流的
電極；
(e) 電化學池，該池壁可以讓激發信號分子的光透過；
(f) 發光裝置，該裝置具有能激發信號分子的光源。 所述核酸探針、光電信號分子、酶等組分需組裝于電極表面，不限制
其組裝順序，根據需要還可以組裝上其它組分，如蛋白分子、聚合物、 納米粒子等。
所述組裝方式包括物理吸附法、共價結合法、交聯法、包埋法或層層
自組裝法。
所述發光裝置的光源為中空的陰極燈、氙弧燈、氙汞燈、金屬鹵化 物、發光二極管或激光
本發明的檢測方法，是簡單、快速的遺傳毒性檢測方法，該檢測方法 使用的光電化學核酸傳感器制作簡單、實用。
圖1為不同核苷酸修飾的Sn02/avidin-Ru電極的光電流響應(a) poly—G， (b) ss-DNA， (c) poly—A， (d) ds—DNA， (e) poly—C, (f) poly—U
和(g)無核苷酸修飾；
圖2為修飾電極Sn(Vavidin-Ru/ds-DNA/PDDA/GOx檢測金屬離子基因
毒性的示意圖3為修飾電極Sn02/avidin-Ru/ds-DNA/PDDA/GOx和以下試劑反應 后的光電流響應(a) Fe27葡萄糖，(b) Fe2+， (c)葡萄糖；
圖4為修飾電極Sn(Vavidin-Ru/ds-DNA/Hb檢測有機污染物苯乙烯潛 在基因毒性的示意圖5為修飾電極Sn02/avidin-Ru/ds-DNA/Hb和以下試劑反應后的光 電流響應(a)苯乙烯/雙氧水(b)苯乙烯(c)雙氧水；
圖6為信號分子Ru(bpy)2(dppz)2+對不同核苷酸修飾的Sn02/avidin 電極的光電流響應(a) ds-DNA; (b) ss-DNA; (c) poly-C， (d)無核苷酸；
圖7為修飾電極Sn02/PDDA/GOx/PDDA/ds-DNA檢測金屬離子基因毒性 的示意圖8為修飾電極Sn02/PDDA/G0x/PDDA/ds-DNA和以下試劑反應后的光 電流響應(a)葡萄糖，(b) Fe2+, (c) Fe"/葡萄糖。
具體實施例方式
本發明一種光電化學檢測核酸現場損傷的傳感器，包括電極；其在電 極表面，有序地設置光電信號分子、核酸和酶三個組分。 光電化學檢測核酸現場損傷的傳感器，至少應包括
(a) 在合適條件下可以與分析物結合或反應的核酸探針；
(b) 具有光電化學活性的信號分子；
(c) 可以將間接基因毒性物質活化的酶；
(d) 適合分析光電信號分子與電極之間的電子轉移所產生的電流的
電極；
(e) 電化學池，該池壁可以讓激發信號分子的光透過；
(f) 發光裝置，該裝置具有能激發信號分子的光源。 該核酸探針、光電信號分子、酶等組分需組裝于電極表面，不限制其
組裝順序，根據需要還可以組裝上其它組分，如蛋白分子、聚合物、納 米粒子等。
該核酸探針、光電信號分子、酶的組裝方式包括物理吸附法、共價結 合法、交聯法、包埋法或層層自組裝法。
該發光裝置的光源為中空的陰極燈、氙弧燈、氙汞燈、金屬鹵化物、 發光二極管或激光。 本發明一種光電化學檢測核酸現場損傷的方法，用以評價待檢測物質 的基因毒性；其酶反應將相應的待檢測化合物轉化為活性中間體，導致核 酸損傷，或者酶反應產生雙氧水和待檢測物質一起作用造成核酸損傷，根 據核酸損傷前后傳感器光電流響應的不同，對待檢測樣品的基因毒性進行 定性或定量分析。
當用相應波長的光照射修飾于傳感器上的信號分子時，基態電子會吸 收光能量，從基態躍遷到激發態，激發態電子有很強的活性可以很容易的 失去。例如，從它可以從受激信號分子轉移到具有較低能量的半導體電極 上，形成光電流，信號分子因失去一個電子變為氧化態。核酸的某些堿基
鳥嘌呤、腺嘌呤、8-氧化-鳥嘌呤、8-氧化-腺嘌呤和6-巰基-鳥嘌呤的氧 化還原電位比較低，可以作為還原劑使信號分子再生，從而參與到下一輪 的光電反應中，使光電流增強。然而，完好未損傷的雙鏈DNA的堿基被它 的雙鏈嚴密的保護起來，使其很難參與到氧化還原反應中，因此，未損傷 的ds-DNA的催化增強光電流的能力非常有限。若待檢測物質具有基因毒 性，當與核酸傳感器接觸后，傳感器上的DNA被損傷，它雙螺旋結構遭到 破壞，堿基被不同程度的暴漏出來，使其更加容易的參與光電反應，增強 光電流。這就為檢測化學物質的基因毒性提供了理論基礎。
在這里，核酸分子修飾到半導體電極的最外層，選擇可以識別不同核 酸結構的指示劑作為信號分子，例如二聯吡啶二吡啶并[3，2-a; 2' ,3' -c]吩嗪釕(Ru(bpy)2dppz2+)，分子中的dppz配體可以嵌入到ds-DNA的相 鄰堿基對中，這種和DNA的嵌入作用具有高選擇性和高親和性(結合系數:
K=106-107 M—')。修飾到電極表面的核酸被具有基因毒性的試劑損傷后， 結合信號分子的位點減少，因此電極上信號分子減少，伴隨著光電流的減 弱，基于此可以定性定量的分析待檢測物質的基因毒性。
本發明光電化學檢測核酸現場損傷的方法，可以對下述環境污染物進 行檢測
包括單環芳烴、多環芳烴或其代謝物。金屬離子包括鎘、鎳、鈷、 鐵或銅。
實施例1
信號分子聯吡啶釕的催化光電流。
將琥珀酰胺(NHS)活化的聯吡啶釕信號分子共價標記于抗生素蛋白
avidin上，組合成avidin-Ru。在室溫下將10 u L的avidin-Ru溶液均勻 鋪展在制備好的納米Sn02電極表面，靜止吸附1小時，取出水搖洗5分鐘， 氮氣吹干，得到avidin-Ru修飾的半導體電極，Sn02/avidin-Ru。用同樣 的方法將不同的核苷酸修飾到電極表面，如雙鏈DNA (ds-DNA)、單鏈 DNA (ss-DNA)、聚鳥嘌呤核苷酸(polyG)、聚胸腺嘌呤核苷酸(polyA)、 聚胞嘧啶核苷酸(polyC)、聚尿嘧啶核苷酸(polyU)。再將各種核苷酸修 飾的半導體電極傳感器置于電解池中，在磷酸緩沖液中檢測光電流，所用 電化學工作站為CHI 630A，基于時間模式下進行檢測，光源為473nm的藍 色激光，參比電極為Ag/AgCl，對電極為鉑電極。不同核苷酸修飾電極的 光電流響應見圖1，可以看出，由于鳥嘌呤的還原作用，可以使信號分子 釕的絡合物循環再生，因此，polyG修飾的電極的得到最強的催化光電流，
polyli和polyC由于沒有催化作用，因此沒有表現出增強的光電流；另外， 和ds-DNA相比較，ss-DNA由于具有更加開放式的結構，因此也表現出較 強的催化電流。這說明組裝的核酸傳感器可以區別出不同的核酸結構，這 就為檢測核酸損傷和分析化合物的基因毒性提供了可行性。
實施例2
修飾電極Sn02/avidin-Ru/ds-DNA/PDDA/G0x檢測金屬離子Fe"的基因 毒性。
將avidin-Ru、 ds-DNA、聚二烯丙基二甲基胺鹽酸鹽(PDDA)、葡萄糖 氧化酶(G0x)按實施例1所述方法依次組裝于半導體電極表面，得到修 飾好的傳感器電極:Sn02/avidin-Ru/ds-DNA/PDDA/GOx，見圖2。將修飾 好的傳感器置于lmM FeS04/50mM葡萄糖溶液中，在37°C，反應lh。溶液 中葡萄糖在這里用來和組裝在電極上的葡萄糖氧化酶反應，產生雙氧水， 雙氧水可以和Fe2+發生Fenton反應產生高活性氧，損傷核酸，這是體內金 屬離子展現基因毒性的主要途徑。反應結束后電極取出，水沖洗，氮氣吹 干，置于20mM磷酸緩沖液中檢測光電流，單獨的FeS04和葡萄糖溶液作為 對照，檢測結果見圖3，從圖中可以看出，在Fe27葡萄糖中反應后，光電 流增強了 10倍多，這說明葡萄糖氧化酶修飾電極Sn02/avidin-Ru /ds-DNA/PDDA/GOx可以用來檢測金屬離子的基因毒性。
'實施例3
修飾電極Sn02/avidin-Ru/ds-DNA/Hb用來檢測苯乙烯的潛在基因毒
性。
將avidin-Ru、 ds-DNA、血紅蛋白(hemoglobin, Hb)按實施例l所述
方法依次組裝到半導體電極表面，得到修飾傳感器電極 Sn02/avidin-Ru/ds-DNA/Hb，見圖4。在這里，血紅蛋白可以在雙氧水的
作用下將苯乙烯轉化為具有基因毒性的氧化苯乙烯，造成核酸的損傷，類 似于苯乙烯在人體肝臟內的代謝，這也是大部分有機物的體內核酸損傷途 徑，即在生物體內首先被肝臟中的細胞色素P450酶催化轉化為活性代謝 物，再與核酸的堿基共價結合形成加合物，造成核酸的損傷。制備好的傳 感器電極Sn02/avidin-Ru/ds-DNA/Hb置于2mM H202/2%苯乙烯溶液中，在 37。C下反應3小時，單獨的HA和苯乙烯作為對照，電極取出后，水沖洗， 氮氣吹干，在20raM的磷酸緩沖液中檢測光電流，檢測結果見圖5。從圖中 可以明顯的看出，在H2(V苯乙烯中作用后的傳感器光電流有非常明顯的增 強，這說明血紅蛋白修飾傳感器電極Sn02/avidin-Ru/ds-DNA/Hb可以用來 檢測有機化合物苯乙烯的潛在基因毒性。
實施例4
信號分子二聯吡啶二吡啶并[3， 2-a; 2， ， 3， -c]吩嗪釕(Ru (bpy) 2dpPz2+
對不同核苷酸的光電流響應。
按實施例1所述方法，分別將ds-DNA、ss-DNA和polyC組裝到avidin 封閉的半導體電極上，得到三種核苷酸修飾的電極。將50mM的信號分子 Ru(bpy)2d卯^+溶液均勻鋪展在核苷酸修飾好的電極上，室溫下吸附30分 鐘，電極取出后，水沖洗掉未和核酸結合的信號分子，氮氣吹干，在30mM
的草酸緩存液(pH5.8)中檢測光電流，在這里，草酸用來催化增強光電 流信號。光電流響應見圖6，從圖中可以看出，由于信號分子可以識別單 雙鏈，ds-DNA修飾的電極得到最強的光電流信號，其次是ss-函A和polyC， 這說明信號分子Ru(bpy)2dppz2+可以識別電極表面核酸結構的變化。
實施例5
傳感器電極Sn02/PDDA/GOx/PDDA/ds-DNA用來檢測金屬離子的基因毒性。
按實施例l所述方法，將PDDA、葡萄糖氧化酶、PDDA和ds-DNA依次 修飾到半導體Sn02電極表面，得到組裝好的傳感器電極 Sn02/PDDA/GOx/PDDA/ds-DNA，見圖7。將修飾電極置于lmM FeS04/50mM葡 萄糖試劑中，37T下反應l小時，電極取出，水沖洗，氮氣吹干，將50mM 的信號分子Ru(bpy)2dppz2+溶液均勻鋪展于修飾好的電極表面，反應30分 鐘，水沖洗掉未結合的信號分子，氮氣吹干，置于30mM的草酸緩沖液(pH 5.8)中檢測光電流。單獨的FeSO,或葡萄糖溶液作為對照。光電流響應見 圖8，從圖中可以看出，單獨的FeSO,或葡萄糖溶液處理過的核酸傳感器 的光電流最強，達到500nA，大約是FeS(V葡萄糖中反應過的傳感器的5 倍，這說明，FeS(V葡萄糖造成了傳感器表面核酸的損傷，并被快速、靈 敏的檢測出來，該核酸傳感器可以用來檢測金屬離子Fe2+的基因毒性。
權利要求
1. 一種光電化學檢測核酸現場損傷的方法，其特征在于，包括(a)將待測分析物與核酸接觸；(b)如果待測分析物需要活化后才表現出基因毒性，則用相應的酶作為活化劑；(c)用光電化學活性分子作為信號指示劑；(d)評價所述分析物和核酸之間的結合和/或反應，即在電極存在的情況下，評價光電信號分子在光的作用下和電極之間電子轉移所產生的電流，根據核酸和分析物接觸前后光電流響應的不同，對所述分析物的基因毒性進行定性或定量分析。
2. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述分析物為單環芳烴、多 環芳烴、芳香胺類化合物、N-亞硝胺類化合物、黃曲霉素或其代謝物。
3. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述分析物為金屬離子、非 金屬離子，包括鎘、鎳、鈷、鐵、銅、汞、鉛、硒、砷、磷、氯， 或其有機、無機化合物。
4. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述核酸，為核糖核酸、脫 氧核糖核酸或寡核苷酸。
5. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述電極為二氧化錫電極；光電活性分子是金屬與有機配體的絡合物。
6. 如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述金屬為釕或鋨；有機配 體為聯吡啶、連吡嗪、聯三吡啶、菲酚、酞氰染料、取代的聯吡啶、 取代的連吡嗪、取代的聯三吡啶或取代的菲酚。
7. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述酶能夠將間接基因毒性 物質轉化為直接基因毒性物質，或酶催化產生仏02， ^02和分析物質一 起作用，具有基因毒性。
8. 如權利要求7所述的酶，其特征在于，所述酶，為細胞色素P450、血 紅蛋白、肌紅蛋白、辣根過氧化酶、葡萄糖氧化酶、尿酸氧化酶、D-氨基酸氧化酶、L-氨基酸氧化酶、L-a-羥基酸氧化酶、單胺氧化酶 或黃嘌呤氧化酶。
9. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述分析物和核酸之間的結 合和/或反應，包括核酸堿基脫落、堿基烷基化、堿基氧化修飾、鏈斷 裂、鏈交聯、嵌入劑嵌入核酸堿基。
10. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述評價為在電極存在的情 況下，根據核酸現場損傷前后結合光電信號分子的量不同，評價光電 流信號的變化。
11.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述評價為在電極的情況下 用光將具有光電化學活性的分子轉化成激發態，被激發的物質失去電 子后，與核酸堿基進行氧化還原反應，評價核酸現場損傷前后氧化還 原反應所產生的電流的變化。
12.—種光電化學檢測核酸現場損傷的傳感器，其特征在于，包括(a) 與分析物結合或反應的核酸探針；(b) 具有光電化學活性的信號分子；(C)將間接基因毒性物質活化的酶；(d) 適合分析光電信號分子與電極之間的電子轉移所產生的電流的電 極；(e) 電化學池，該池壁讓激發信號分子的光透過；(f) 發光裝置，該裝置具有能激發信號分子的光源。
13. 如權利要求12所述的光電化學傳感器，其特征在于，所述核酸探針、 光電信號分子、酶組分需組裝于電極表面，不限制其組裝順序，根據 需要還在電極表面組裝上其它組分。
14. 如權利要求13所述的光電化學傳感器，其特征在于，所述其它組分， 為蛋白分子、聚合物、納米粒子。
15. 如權利要求13所述的光電化學傳感器，其特征在于，所述組裝方式包 括物理吸附法、共價結合法、交聯法、包埋法或層層自組裝法。
16. 如權利要求13所述的傳感器，其特征在于，所述發光裝置的光源為 中空的陰極燈、氙弧燈、氙汞燈、金屬鹵化物、發光二極管或激光。
全文摘要
本發明一種光電化學檢測核酸現場損傷的方法及傳感器，提供一種簡單、快速、靈敏的檢測化學物質基因毒性的方法。該方法包括(a)將可能具有基因毒性的分析物與核酸接觸；(b)如果待測分析物需要活化后才表現出基因毒性，則用相應的酶作為活化劑；(c)用光電化學活性分子作為信號指示劑；(d)評價所述分析物和核酸之間的結合和/或反應，即在電極存在的情況下，評價光電信號分子在光的作用下和電極之間電子轉移所產生的電流，根據核酸和分析物接觸前后光電流響應的不同，對所述分析物的基因毒性進行定性或定量分析。本發明方法及傳感器應用于工業化學品的毒性篩查、環境污染物的毒性檢測、合成藥物的毒性測試以及環境毒性學研究等領域。
文檔編號C12Q1/68GK101393146SQ20071012197
公開日2009年3月25日 申請日期2007年9月19日 優先權日2007年9月19日
發明者梁敏敏, 郭良宏 申請人:中國科學院生態環境研究中心