專利名稱：：基因工程改造的藍細菌及其生產乙醇的用途的制作方法
技術領域：
：本發明涉及生物能源
技術領域：
，具體涉及一種藍細菌集胞藻突變株、篩選藍細菌集胞藻突變株的方法、導入了編碼丙酮酸脫羧酶多核苷酸和/或硝酸鹽誘導的啟動子序列的質粒表達載體、導入了編碼丙酮酸脫羧酶多核苷酸和/或硝酸鹽誘導的啟動子序列的上述集胞藻突變株、以及上述突變株在制備乙醇中的應用。
背景技術：
：自250多年前英國的工業革命以來，人類社會的發展便與能源的使用息息相關。隨著全球經濟的不斷發展，以石油，煤炭和天然氣為主的化石能源的開發和使用問題顯得日益突出其一，石油，煤炭和天然氣等都是不可再生的資源，不久的將來它們會被消耗枯竭；其二，美國等發達國家對進口石油的依賴，使得世界局部地區的動蕩即可產生油價的巨大變化，直接影響到經濟發展、社會穩定、甚至是國家安全；其三，使用傳統化石能源會排放大量二氧化碳等溫室氣體，造成嚴重的環境污染和全球性的氣候變化。所以，現在能源問題和環境問題已成為國際高峰會談最重要的議題。為了保障能源安全，保護環境，走可持續發展的道路，替代能源和可再生能源獲得了各國越來越多的重視。可再生能源中，生物質能的發展最為迅速。生物質(Biomass)主要指的是自然界中的各類植物，包括農作物，通過光合作用將太陽能轉換成化學能蘊涵在植物有機體內。建立在生物質發酵法的燃料乙醇生產，是以谷物、玉米、小麥、薯類、糖蜜等為原料，經發酵、蒸餾制得，將發酵法乙醇進一步脫水后形成變性燃料乙醇。生物質乙醇生產存在許多缺憾之處。首先，它將爭奪消耗眾多的植物資源，使得糧食、飼料的供應出現緊缺。其次，生物質生產乙醇需要考慮原料和乙醇運輸問題，生物質預處理以及固體廢棄物處理等問題。再者，生物質生產乙醇生產過程排放的溫室氣體二氧化碳將加劇全球溫度的升高。為克服上述新能源生產存在的問題，有必要研發新型生物技術用以生產乙醇。對此，加拿大EnnolEnergyInc.申請'的專利(美國專利號6，306，639，2001年；和6，699，696，2004年)以及美國夏威夷大學申請的美國專利("MethodsandCompositionforEthanolProducingCyanobacteria",pending,2007年)均涉及通過基因工程改造的藍細菌生產乙醇。但是加拿大EnnolEnergyInc.專利技術存在如下缺陷a、藍細菌單胞藻Sy"ec/20coccwPCC7942使用咸水培養液，生產線不易清洗，設備和管道易受鹽分腐蝕；b、啟動子為溫度誘導，必須升高溫度以表達乙醇生產基因。這會影響藍細菌單胞藻活性；c、無耐熱耐乙醇性能；d、乙醇生產濃度低；e、乙醇生產基因pdc和adh以質粒形式存在于單胞藻7942中，穩定性不好。需要使用大量抗生素維持單胞藻菌株內質粒的穩定性，因而提高了生產成本。另外，對于美國夏威夷大學專利技術，其存在的問題為-a、藍細菌集胞藻6803的乙醇生產基因表達啟動子為光誘導，夜間或陰天時乙醇生產效率下降；b、無耐熱性能，插入來自Oe"ococcwsoew'的omrA基因或同源基因(丄m"，ZmrCD)提高耐乙醇性能沒有得到實驗數據確認；c、乙醇生產濃度不夠高。
發明內容本發明的發明人為了解決上述問題進行了不懈的研究，結果通過定向進化藍細菌集胞藻6803(購自美國AmericanTypeCultureCollection(ATCC)，ATCCNumber:27184)而獲得其突變株Synechocystisstrictus(簡稱為S.strictus)，該突變株具有較強的耐熱耐乙醇性能。進一歩地，本發明人通過基因工程的手段對該菌株進行操作，最終使得集胞藻突變株能夠集光合作用，二氧化碳收集和乙醇生產三功能于一體，從而完成了本發明。本發明涉及一種藍細菌集胞藻的突變株、篩選這種集胞藻的突變株的方法、導入了編碼丙酮酸脫羧酶多核苷酸和/或硝酸鹽誘導的啟動子序列的質粒表達載體、導入了編碼丙酮酸脫羧酶多核苷酸和/或硝酸鹽誘導的啟動子序列的上述集胞藻突變株、以及上述突變株在制備乙醇中的應用。具體而言，本發明提供如下技術方案1、藍細菌集胞藻，其保藏號為CGMCCNO.2137。2、篩選上述1所述的藍細菌集胞藻的方法，其使用了熱休克的方法。3、藍細菌集胞藻，其為在上述1所述的藍細菌中導入了編碼具有丙酮酸脫羧酶活性的多肽的多核苷酸。4、上述3所述的藍細菌集胞藻，其中所述的多核苷酸為(a)多核苷酸，其含有由序列號1堿基序列組成的多核苷酸；(b)多核苷酸，其含有與序列號1的堿基序列組成的多核苷酸或序列號1的堿基序列的互補堿基序列組成的多核苷酸在嚴格條件下雜交、且編碼具有丙酮酸脫羧酶活性的蛋白質的多核苷酸；或(C)多核苷酸，其為序列號1的堿基序列或其互補堿基序列組成的多核苷酸。5、上述4所述的藍細菌集胞藻，其進一步含有硝酸鹽誘導的啟動子。6、上述5所述的藍細菌集胞藻，其中所述的啟動子為(a)多核苷酸，其含有由序列號2堿基序列組成的多核苷酸；(b)多核苷酸，其含有與序列號2的堿基序列組成的多核苷酸或序列號2的堿基序列的互補堿基序列組成的多核苷酸在嚴格條件下雜交、且編碼具有硝酸鹽誘導的啟動子活性的多核苷酸；或(c)多核苷酸，其為序列號2的堿基序列和/或其互補堿基序列組成的多核苷酸。7、上述3-6任意一項所述的藍細菌集胞藻，其中所述的編碼具有丙酮酸脫羧酶活性的多肽的多核苷酸和/或啟動子是由質粒表達載體所承載。8、上述7所述的藍細菌集胞藻，其中所述的質粒表達載體序列為序列號3所示的序列。9、上述1-8任意一項所述的藍細菌在生產乙醇中的應用。圖1重組質粒pSKBPDC的結構示意圖。圖2重組質粒pPDCNIRA的結構示意圖。圖3在戶外利用光生物反應器觀察乙醇生成率的試驗，其中圖3a為溫度變化曲線，圖3b為細胞濃度和乙醇生產能力。具體實施例方式對于所有能夠生產乙醇的微生物細胞(例如大腸桿菌，酵母菌，運動發酵單孢菌等)而言，已知乙醇生產路徑是從糖酵解途徑的丙酮酸經過乙醛再到末端代謝產物乙醇。丙酮酸到乙醛的反應過程由丙酮酸脫羧酶基因pdc控制，乙醛到乙醇的反應過程由乙醇脫氫酶基因adh控制。藍細菌存在地球已有35億年以上，是地球上最古老的生物之一。它的適應能力非常強，可忍受高溫，冰凍，缺氧，干涸及高鹽度，強輻射等許多惡劣生存條件。由于其基因組中不存在丙酮酸脫羧酶基因pdc，造成野生株集胞藻6803的乙醇生產路徑殘缺，因而不具有乙醇生產能力。本發明采用基因工程的方法，對一種低等水生綠色植物藍細菌(Cyanobacteria，簡稱藍細菌，俗稱藍綠藻或藍藻)進行改造。從而使得藍細菌吸收太陽光中的能量，直接將二氧化碳轉換為乙醇。本發明使用的藍細菌集胞藻Synechocystissp.PCC6803(以下簡稱為"集胞藻6803")是一種非絲狀和非固氮淡水菌株，兼具自養和異養生長能力。集胞藻6803是第一個基因組被完全測序的光自養微生物(Ikeuchietal.,TanpakushitsuKakusanKoso1996,41(16):2579-2583)，這為藻類基因工程的發展奠定了重要基礎。集胞藻6803可以融合外源DNA，通過同源重組把外源DNA整合到染色體DNA上。因為能夠自然轉化，它的基因組可通過重組DNA技術進行精確調節(Aoki"a/.,JMicrobiolMethods2002,49(3):265-74.,Vermaasda/"ProcNatlAcadSciUSA,1986,83(24):9474-9477,Williams,MethodsEnzymol.，1988,167:766—778)。所以，集胞藻6803是一種研究利用植物放氧光合作用的生物和代謝過程的理想系統。它也是藻類基因工程研究中常用的表達系。人們已將解毒酶基因、人源超氧化物歧化酶基因及小鼠金屬硫蛋白基因成功地轉入到集胞藻6803中(孫軍.生物工程進展，1994，14(6):3942)。本發明是利用基因工程技術人工合成丙酮酸脫羧酶pdc和nirA啟動子，將其與高表達質粒載體PSKAIIKS連接，構建出了重組質粒pPDCNIRA，然后將其插入以"熱休克"定向進化而篩選的藍細菌集胞藻突變株51.^7'd"5,從而連通乙醇合成路徑，構建出重組菌株，其中所述的藍細菌集胞藻突變株S.具有很強的耐熱耐乙醇能力。構建出的該重組菌株可以用硝酸鹽誘導，高效地利用太陽光能和二氧化碳生產乙醇，從而使得該集胞藻重組菌株能夠集光合作用，二氧化碳收集和乙醇生產三功能于一體。本發明的發明人通過"定向進化"的方法提高集胞藻6803耐熱耐乙醇能力。使用二氧化碳(co2)作為碳源的大規模燃料乙醇生產需要采用室外封閉式管道藍細菌集胞藻工業用光合生物反應器系統并且在日間采集太陽光滿足藍細菌光合反應的需求。一般集胞藻的生長溫度在3(TC左右，而夏季中午室外溫度可能高達4CTC以上，這對集胞藻的正常生長和燃料乙醇生產能力帶來了不利的影響。例如，野生株集胞藻6803在未加溫度控制的室外光合生物反應器內培養，使用BG-ll培養液。由于日間的高溫很快便使得藍細菌葉綠素全部失活，從而產生"白化"現象，失去生長能力；再者，野生株集胞藻6803加溫度控制的實驗室光合生物反應器內培養，采集50毫升置于小瓶中，放入45。C水浴箱內"熱休克"二小吋后取出。放回30。C搖床培養，三天后藍細菌同樣產生了完全的"白化"現象。燃料乙醇工業生產如果需要增加溫度控制，將會額外增加設備和能源方面的投資。本發明的發明人采用了"定向進化"的方法提高藍細菌耐熱能力，使其能夠在高溫條件下正常生長和生產燃料乙醇，從而避免了溫度控制的需要。藍細菌突變株提高耐熱能力的同時，也會提高耐乙醇能力。由"定向進化"獲得的藍細菌集胞藻突變株除了耐熱能力之外，還具有耐乙醇能力。使用藍細菌生產燃料乙醇的一大問題是當乙醇在培養液中積累到一定的濃度(例如5%濃度)，就會阻礙藍細菌的生長。當乙醇濃度繼續增加，藍細菌可能開始死亡。提高藍細菌集胞藻耐乙醇能力成為燃料乙醇生產的一個關鍵因素。最新研究結果表明，溫度升高，乙醇濃度增加等外界不利因素，對細胞會產生類似的應力，都會使得細胞內熱休克蛋白高度表達(Royetal.,JOURNALOFBACTERIOLOGY,180(15):39974001,1998;Glatzetal,ActaBiologicaSzegediensis.46(3-4):53,2002)。同時，研究結果表明也表明，耐熱耐乙醇具有交互性(Micheletal.,1986)。當大腸桿菌，酵母菌和藍細菌的抗熱能力增加時，它們的抗乙醇能力也同時增力B(Horvathetal.,Biochemistry,95:3513—3518，1998)。在野生株藍細菌和"定向進化"藍細菌菌株中加入5%乙醇進行培養，三天后發現野生株藍細菌集胞藻6803出現"白化"，而"定向進化"的集胞藻突變株未受影響。本發明將通過上述定向進化而篩選的藍細菌集胞藻突變株命名為藍細菌集胞藻6)，te"erj's加ecte/"/s(簡稱為6:"/7'"^)，該微生物于2007年8月22日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC，地址北京市朝陽區大屯路中國科學院微生物研究所)進行了保藏，保藏編號為CGMCCNO.2137)。本發明釆用分子克隆技術將人工合成的丙酮酸脫羧酶基因pdc(序列號1)和可用硝酸鹽誘導的nirA啟動子(序列號2)與藍細菌集胞藻6803的同源高表達質粒載體PSKAIIKS連接,構建出了重組質粒pPDCNIRA，再轉入上述藍細菌集胞藻突變株，從而構建出重組菌株，該工程菌可以用硝酸鹽誘導，高效地利用太陽光能和二氧化碳生產乙醇。本發明采用化學誘導的nirA啟動子(不受溫度，光照影響)達到穩定高效的乙醇生產基因表達，提高乙醇生產效率；而且本發明采用"熱休克"定向進化獲取具有耐熱耐乙醇性能的藍細菌集胞藻突變株。另夕卜，相比而言，EnnolEnergyInc.和夏威夷大學的實驗數據均產生自實驗室內光生化反應器，而本發明人除了用實驗室內光生化反應器外，還使用戶外實驗裝置獲得了比它們更高的乙醇生產結果。為獲得生產乙醇的本發明的藍細菌集胞藻，可將編碼具有丙酮酸脫羧酶活性的多肽的多核苷酸導入上述所獲得的藍細菌集胞藻突變株，只要導入的多核苷酸能夠編碼具有丙酮酸脫羧酶活性的多肽就能夠實現本發明的目的，這樣的多核苷酸優選為序列號l所示的序列。另一方面，本領域的普通技術人員應當理解的是，本發明所使用的酮酸脫羧酶基因和可用硝酸鹽誘導的啟動子序列并不限于序列號l和序列號2所述的序列，編碼具有酮酸脫羧酶活性的蛋白質的其它多核苷酸或核酸以及其它的可被硝酸鹽誘導的啟動子序列均可用于本發明。例如，本發明所述的丙酮酸脫羧酶基因以及可用硝酸鹽誘導的啟動子序列也包含如下多核苷酸，其含有與序列號l或序列號2堿基序列的互補堿基序列組成的多核苷酸在嚴格條件下雜交、且具有丙酮酸脫羧酶活性或硝酸鹽誘導的啟動子活性的多核苷酸，或者其含有與序列號1或序列號2堿基序列組成的多核苷酸在嚴格條件下雜交、且具有丙酮酸脫羧酶活性或硝酸鹽誘導的化學啟動子活性的多核苷酸。此處的"在嚴格條件下雜交的多核苷酸"，是指由序列號1或序列號2的堿基序列的互補堿基序列組成的多核苷酸的全部或一部分為探針，通過使用菌落雜交法、噬菌斑雜交法或Southern雜交法等得到的多核苷酸(例如DNA)。雜交方法，例如可禾U用MolecularCloning3rdEd.、CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons1987-1997等中所述的方法。對于本說明書中所述的"嚴格條件"，例如為5XSSC、5XDenhardt溶液、0.5%SDS、50%甲酰胺、32。C的條件；或者，例如為5XSSC、5XDenhardt溶液、0.5%SDS、50%甲酰胺、42。C的條件；或者，例如，為5XSSC、5XDenhardt溶液、0.5%SDS、50%甲酰胺、50。C的條件。在上述條件中，越提高溫度，越能期待高效地獲得具有高同源性的多核苷酸(例如DNA)。影響雜交嚴格性的因素可為溫度、探針濃度、探針長度、離子強度、時間、鹽濃度等多種因素，本領域技術人員通過適宜選擇這些因素，可實現同樣的嚴格條件。還需要注意的是，本文所述的乙醇不僅僅指燃料乙醇，其它用途的乙醇也包含在本發明之內。以下，通過實施例詳細敘述本發明，但本發明不限于以下實施例。實施例1具體操作野生株集胞藻6803接種在光合生物反應器組內(由一個改裝搖床內置6個150ML搖瓶組成，工作液為50ML)，且由BG-ll培養液培養，搖床內置光源，反應器表面光強度約為200Einstein/m2/s。搖床溫度調控在低于30°C，速度為200RPM。5天后放入熱水浴箱內加溫熱休克。然后放回30。C光合生物反應器內，待產生了完全的"白化"現象后(約3天)，離心分離集胞藻6803細胞，倒掉上清液，使用新鮮BG-11培養液培養"白化"的集胞藻6803細胞。適應了熱休克的集胞藻細胞將會重新生成葉綠素，進而恢復光合作用和生長能力。同時，細胞的代謝機理會發生緩變，集胞藻突變株將能適應溫度的升高。本發明人花費了一年的時間反復進行上述藍細菌集胞藻細胞熱休克-白化-復蘇的"定向進化"過程，逐漸增加溫度(從35。C升到47°C)和熱休克時間(從30分鐘升到4小時)。最后得到了本發明保藏的集胞藻突變株，其能在夏季室外高溫條件(>45。C)下正常生長。實施例2:丙酮酸脫羧酶基因pdc和nirA啟動子設計由生物信息學的方法，很容易獲得丙酮酸脫羧酶基因pdc和nirA啟動子的序列(本發明的發明人使用日本KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes提供的搜索引擎http://www.kegg.com/獲得丙酮酸脫羧酶基因pdc和nirA啟動子的序列)。Pdc(序列號1)和nirA(序列號2)可以依次用人工合成的方法獲得(Roy,etal.EuropeanJournalofBiochemistry.191(3):647-652，1990;Shabalina,etal.NucleicAcidsRes.34:2428-2437，2006;Satyaetal.ProcIEEEComputSocBioinformConf.2:294-305，2003;Kim，etal.Gene.199:293-301，1997)。將上述獲得的序列用Sanger方法(F.Sanger,Science,214,1215，1981)進行分析，以確認堿基序列。實施例3:pdc基因轉化集胞藻突變株根據藍細菌集胞藻6803內源質粒PSBAIIKS中氨卡青霉素抗性基因、和果聚糖蔗糖酶基因^cfi的位置和序列，為轉化丙酮酸脫羧酶基因pdc設計了一對PCR引物P1(序列號4)和P2(序列號5):P1(5端引物)5，誦GGAGTAAGCATATGAGTTATACTG國3，NdelP2(3'端引物)5,-GGATCTCGACTCTAGAGGATCC-3,BamHI其中引物Pl設計了一個NdeI酶切位點，其序列為CAITATG，引物P2設計了一個BamHI酶切位點，其序列為GGATCIC。以常規PCR擴增法擴增后得1410bp的pdcDNA片段P。PCR反應物在0.5mL無菌離心管中依次加入去離子水3610XTaq酶緩沖液5fxl;4XdNTP(2.5mmol/L)5pl;Pl引物l^il;P2引物1^1;模板(即人工合成的pdc)Taq酶(3U/fi1)lfil。共50pl。PCR反應熱循環參數首先94'C預變性5分鐘.；接著94"C變性30秒.；50。C復性45秒.；72。C延伸50秒；35個循環；72。C再延伸5分鐘.；4'C終止。反應結束后，取2.5^1PCR擴增產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳(2XTAE,100V電壓，40分鐘)，在電泳圖譜上出現一條約1410bp亮帶，表明要擴增的是預期要轉化的pdc基因片段。電泳回收1410bp片段。根據引物中的酶切位點，用限制性內切酶Ndel和BamHI同時雙酶切片段P和載體PSBAIIKS，然后用T4DNA連接酶連接，連接物轉化受體菌co//C600，通過Amp篩選獲得重組質粒pSKBPDC，該質粒大小為5.58kb(圖1)。如圖1所示，人工合成的丙酮酸脫羧酶基因pdc被插入啟動子psbAII的下游，即原來aphX和sacB基因的位置。利用自然轉化將整合表達載體導入集胞藻突變株S.Wn'"M，并通過單交換同源重組使人工合成的丙酮酸脫羧酶基因pdc整合到集胞藻突變株51.Wn'"w染色體上。轉化后，先將含藍細菌集胞藻突變株S.WnW^細胞的BG-ll培養液涂布在復蓋在不含氨芐青霉素(Amp)的BG-11固體培養基上的Millipore濾膜上培養20小時，然后轉移濾膜至含氨芐青霉素濃度為15pg/ml的BG-ll固體培養基上進行篩選培養。一周后，濾膜上出現抗Amp的綠色單藻落，即為轉化集胞藻菌株。重復BG-ll固體培養基培養并逐步提高氨節青霉素濃度，可篩選得到遺傳性狀穩定的轉基因集胞藻突變株S.Wn'"w。為了證明外源基因已整合到集胞藻突變株51.WW"^染色體上，從而整個乙醇合成路徑(丙酮酸—乙醛—乙醇)已被連通，使用希夫試劑(Schiff，sreagent)測試乙醛的生成。野生株集胞藻6803沒有pdc基因，不能催化丙酮酸—乙醛反應，希夫試劑加在BG-ll固體培養基上的野生株集胞藻6803菌落時，沒有顏色變化。然而，希夫試劑加在BG-ll固體培養基上的轉基因集胞藻突變株S.^7'"^菌落時，菌落及周邊變成暗紅色。表明集胞藻產出的乙醛與希夫試劑發生反應。實施例4:nirA啟動子轉化集胞藻本發明人進一歩用硝酸鹽誘導nirA啟動子置換pSKBPDC中的psbAII啟動子，從而變光誘導為化學誘導。nirA啟動子引物設計如下Tl(序列號6)(5'端引物)5，—GAGAGAGAGCTGCAGAGCGTTCCAGTGGATATT-3'PstlT2(序列號7)(3'端引物)5，-ATTATATATATCATATGTTCATCTGCCTACAAAGCAGC-3'Ndel其中引物Tl設計了一個PstI酶切位點，其序列為CTGCA1G，引物T2設計了一個NdeI酶切位點，其序列為CA1TATG。以常規PCR擴增法擴增后得528bp的nirA片段T。PCR反應物在0.5mL無菌離心管中依次加入去離子水3610XTaq酶緩沖液5|il;4XdNTP(2.5mmol/L)5jxl;Pl弓l物P2引物liil;模板(即人工合成的nirA啟動子)l)til;Taq酶(3U/iul)1^1。總共50pl。PCR反應條件與擴增1410bp的pdcDNA片段P相同。反應結束后，取2.5^1PCR擴增產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳(2XTAE，100V電壓，40分鐘)，在電泳圖譜上出現一條約528bp亮帶，表明要擴增的是預期要轉化的nirA啟動子片段。電泳回收528bp片段。根據引物中的酶切位點，用限制性內切酶Pstl和Ndel同時雙酶切片段T和載體質粒pSKBPDC，然后用T4DNA連接酶連接，連接物轉化受體菌五.co//C600，以Amp篩選，獲得重組質粒pPDCNIRA(圖2)，該質粒大小為5.96kb。利用自然轉化將整合表達載體導入集胞藻突變株S.欲/c加。轉化后，先將含藍細菌集胞藻S.細胞的BG-ll培養液涂布在不含氨芐青霉素(Amp)的BG-ll固體培養基上的Millipore濾膜上，并培養20小時，然后轉移濾膜至含氨芐青霉素濃度為5)Lig/ml的BG-ll固體培養基上進行篩選培養。一周至10天后，濾膜上出現抗Amp的綠色單藻落，即為轉化集胞藻菌株。重復BG-ll固體培養基培養并逐步提高氨芐青霉素濃度(至濃度為15|ag/ml),可篩選得到遺傳性狀穩定的集胞藻突變株S.WW^^工程菌。挑取生長好的不同藻落接種到6個150ML搖瓶組成，BG-ll培養液工作液位為50ML的光合生物反應器組培養，搖床內置光源，反應器表面光強度約為200Einstein/m2/s。搖床溫度調控在低于30°C，速度為200RPM。5天后，從6個反應器各取lml懸浮液，離心得上清液。用酶反應試劑(R-Biopharm,Inc.,Marshall,MI,USA)測乙醇的生成濃度。經比較得乙醇高產集胞藻突變株S.欲&加菌株。實施例5:實驗室內光生物反應器培養觀察乙醇生成率液體培養實施例4中獲得的集胞藻突變株S.^7'"M工程菌不但能確定外源基因已經得到高效表達，而且還提供優化生物反應過程的可能性。本實驗室內光生物反應器為1升(CelliGenPlus,NewBrunswickScientificInc.,Edison,NJ,USA)。該系統自帶溫度，pH，轉速，溶氧等測量和控制器。在此基礎上，加裝可調節光源，使反應器外壁光強達1000Einstein/m2/8。并設計計算機采樣和控制系統，軟件則用LabVIEW6.0(NationalInstrumentsCorp.,Austin,TX,USA)編程。在此系統中，硝酸鹽誘導乙醇合成是在集胞藻工程菌細胞光學密度達OD730=0.5時開始的。結果，藍細菌集胞藻工程菌生產的乙醇濃度可達14mM。實施例6:利用戶外光生物反應器觀察乙醇生成率在戶外使用10升光生物反應器懸浮培養實施例4中獲得的藍細菌集胞藻突變株S.Wr/"附工程菌。用控制pH的方式控制二氧化碳的加入量。溫度不加控制。該自制反應器由玻璃制成，上升管中加置內件可以有效地促進氣泡的分散，改善氣液兩相的混合，強化二氧化碳傳遞過程。圖5a為溫度變化曲線，圖5b為細胞濃度和乙醇生產能力。硝酸鹽誘導乙醇合成是在集胞藻工程菌細胞光學密度達0073。=0.5時開始的。結果乙醇濃度可達50mM，比室內光生物反應器結果提高了約5倍。為了更清楚地理解本發明，將本發明與另外兩個同類相關發明進行了對比，結果如下<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>序列表<110〉黃娟<120〉基因工程改造的藍細菌及其生產乙醇的用途〈130〉PIF072427C〈160〉7〈170>Patentlnversion3.1<210〉1<211〉1766〈212>DNA〈213〉人工序列〈220><223>首先根據生物信息學的方法獲取序列信息然后人工合成的序列〈400〉1atgagttatactgtcggtacctatttagcgg解cggcttgtccagattggtctcaagcat60cacttcgcagtcgcgggcgactacaacctcgtccttcttgacaacctgct120aacatggagcaggtttattgctgtaacgaactgaactgcggtttcagtgcagaaggttat180gctcgtgcca卿gcgcagcagcagccgtcgttacctacagcgtcggtgcgctttccgca240tttgatgctatcggtggcgcctatgcagaaaaccttccggttatcctgatctccggtgct300ccg朋c朋caatgatcacgctgctggtcacgtgttgcatcacgctcttgg360tatcactatcggccaagaacatcacggccgcagctgaagcgatttacacc420ccagaagaagctccggctaaaatcgatcacctgctcttcgtgag^g犯g■ccggtttatctcgaaatcgcttgca^cattgcttccatgccctgcgccgctcctggaccg540gcaagcgcattgttcaatgscgaagccagcgacga已gcttctttgaatgc3gcggttg皿600gaaaccctgaaattcatcgccaaccgcgacaaagttgccgtcctcgtcggcagcaagctg660cgcgcagctggtgctga卿agctgctgtcaaatttgctgatgctctcggtggcgcagtt720gctaccatggctgctgcaaaaagcttcttcccagaagaaaacccgcattacatxggtacc780tcatggggtgaagtcagctatccgggcgtttga犯gaagccgatgcggtt840atcgctctggctcctgtcttcaacgactactccaccactggttggacggatattcctgat900tggttctcgctgaaccgcgttctgtcgtcgttaacggcgttcgcttcccc960agcgttcatctgaaagactatctgacccgtttggctcaga33gtttCC33gaaaaccggt1020gctttggacttcttcaaatccctcaatgcaggtgaactgaagaaagccgctccggctgat1080ccgagtgctccgttggtcaaCgC3g3a3tCgcccgtcaggtcgaagctcttctgaccccg1140aacacgacggttattgctgaaaccggtgactcttggttcaatgctcagcgcatgaagctc1200ccgaacggtgCtCgCgttg￡Latatgaaatgcagtggggtcacatcggttggtccgttcct1260gccgccttcggttatgccgtcggtgctccggaacgtcgcaacatcctcatggttggtgat1320ggttccttccagctgacggctcaggaagtcgctcagatggttcgcctgaaactgccggtt1380atcatcttctctatggttacaccatcgaagttatgatccatgatggtccg1440tcaagaactgggattatgccggtctgatggaagtgttcaacggtaacggt1500ggttatgacagcggtgctggtaaaggcctgaaggctaaaaccggtggcgaactggcagaa1560gctatcaaggttgctctggcaaacaccgacggcccaaccctgatcgaatgcttcatcggt1620cgtgaagactgcactgaagaattggtcaaatggggtaagcgcgttgctgccgccaacagc1680cgtaagcctgttaac33gctcctctagtttttggggatcaattcgagctcggtacccaaa1740ctagtatgtagggtgaggtt1766〈210〉2<211〉528〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉<223〉啟動子〈400〉2g卿g卿gctgc卿gcgttccagtggatatttgctgggggttaatgaaacattgtggc60ggaacccagggacaatgtgaccaaaaaattcagggatatcaataagtattaggtatatgg120atcataattgtatgcccgactattgcttaaactgactgaccactgaccttaagagtaatg180gcgtgc皿ggcccagtgatcaatttcattatttttcattatttcatctccattgtccctg240gtgtcgcccctctacacagcccagaactatggtaaaggcgcacgaaaaac300cgccaggtaaactcttctcaacccccaaaacgccctctgtttacccattccctctcagct360caatgattacttaatgtttgttctgcgcaaacttcttgcagaacatgcat420aagttgtagtttctgttaccaattgcgaatcgagaactgcctaatctgcc480gagtatgcaagctgctttgtaggcagatgaacatatgatatatataat528〈210〉3<211>5962<212〉DNA〈213〉pPDCNIRA轉化質粒<400〉3tcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggta60tcagctcactca卿gcggtaatacggttatCC￡LC3gaatcaggggataacgcagga卿120aacatgtgagcaaaaggccagcaaa已ggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcg180tttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctc卿tcagagg240tggcgaaacccgacsggacta^33gataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtg300cgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcggga360agcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgc420tccaagctgggctgtgtgcaCg33CCCCCCgttcagcccgaccgctgcgccttatccggt■aactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccact540ggtaacaggattagcagagcgagg城gtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtgg600cctaactacggctacactag^ga^cagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagtt660accttcggaa認gagttggtagctcttgatccggcaaacaa3cc3ccgctggtagcggt720ggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaa犯aaaggatctcaagaagatcct780ttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttg840gtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaa11aaaaatgaagtttt■aaatcaatcta^gtatatatgagtaaacttggtctgacagttaccaatgcttaatcagt960gaggcacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtc1020gtgtagataactacgatacgg眺ggcttaccatxtggccccagtgctgcaatgataccg1080cgagacccacgctcaccggctccagatttatcagcaataaaccagccagccggaagggcc1140gtggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgttgccgg1200gaagct卿gtaagtagttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctaca1260ggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatggcttcattcagctccggttcccaacga1320tc卿gcgagttacatgatcccccatgttgcggttagctccttcggtcct1380ccgatcgttgtcagaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggttatggcagcactg1440cataattctcttactgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtactca1500accaagtcattctgagaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaata1560cgggataataccgcgccacatagcagaacttcatcattggaaaacgttct1620tcggggcgaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccact1680cgtgcacccaactgatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaaa1740aaaatgccgcaaaaa^gggaat犯gggcgacacggaaatgttgaiatactc1800atactcttcctttttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcgga1860<formula>formulaseeoriginaldocumentpage18</formula>ggtttattgctgaactgcggtttcagtgcagaaggttatgctcgtgccaa3660aggcgcagcagcagccgtcgttacctacagcgtcggtgcgctttccgcatttgatgctat3720cggtggcgcctatgcagaaaaccttccggttatcctgatctccggtgctccgaaca^caa3780tgatcacgctgctggtcacgtgttgcatcacgctcttggcaa^ccgsct3tc3ctatca3840gttggaaatggccaagaacatcacggccgcagctgaagcgatttacaccccagaagaagc3900tccggctaaaatcgatcacgtgatt33aactgctcttcgtcggtttatct3960cgaaatcgcttgcaacattgcttccatgccctgcgccgctcctggaccggcaagcgcatt4020gttcaatgacgaagccagcgacgaagcttctttgaatgcagcggttgaaga^accctgaa4080attcatcgccaaccgcgacaaagttgccgtcctcgtcggcagcaagctgcgcgcagctgg4140tgctgaagaaaatttgctgatgctctcggtggcgcagttgctaccatggc4200tgctgcaa已aagcttcttccc3g33g3aaacccgcattacatcggtacctcatggggtga4260agtcagctatccgggcgttg朋aagacgatgaaagaagccgatgcggttatcgctctggc4320tcctgtcttcaacgactactccaccactggttggacggatattcctgatc4380ggttxtcgctgaaccgcgttctgtcgtcgttaacggcgttcgcttccccagcgttcatct4440g333g3ctatctgacccgtttggctcagaaagtttccaagaaaaccggtgctttggactt4500cttcaaatccctcaatgcaggtgaactgaagaaagccgctccggctgatccgagtgctcc4560gttggtcaacgcagaaatcgcccgtcaggtcgaagctcttctgaccccgaacacgacggt4620tattgctgaaaccggtgetctcttggttcaatgctcagcgcatgaagctccCg33CggtgC4680tcgcgttgaaagtggggtcacatcggttggtccgttcctgccgccttcgg4740ttatgccgtcggtgctccggaacgtcgcaacatcctcatggttggtgatggttccttcca4800gctgacggctctcagatggttcgcctgaaactgccggttatcatcttctt4860gatcaataactatggttacaccatcg已已gttatgatccatgatggtccgt4920ca已gaactgggattatgccggtctgatggaggt認ggtggttatgacag4980cggtgctggtaaaggcctg3aggctaaaacCggtggCg33ctggc卿agctatcaaggt5040tgctctggcaaacaccgacggcccaaccctgatcgaatgcttcatcggtcgtga卿ctg5100cactgaagaattggtcaaatggggt卿cgcgttgctgccgccaacagccgt犯gcctgt5160taacaagctcctctagtttttggggat固ttcgagctcggtscccaaactagtstgtsg5220ggtg鄉ttatagcttaattccttggtgtaatgccaactgaataatctgc5280ctccttcaatggggggtgctttttgcttgactgagt已atcttctgattgctgatcttgat5340tgccatcgatcgccggggagtccggggcagttaccattagagagtctaga5400atcttcgatagaggaattatggggga卿acctgtgccggcggataaagca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技術領域：
，具體涉及一種藍細菌集胞藻突變株、篩選這種集胞藻突變株的方法、導入了編碼丙酮酸脫羧酶多核苷酸和/或硝酸鹽誘導的啟動子序列的質粒表達載體、導入了編碼丙酮酸脫羧酶多核苷酸和/或硝酸鹽誘導的啟動子序列的上述集胞藻突變株、以及上述突變株在制備乙醇中的應用。文檔編號C12P7/06GK101372669SQ20071014278公開日2009年2月25日申請日期2007年8月23日優先權日2007年8月23日發明者娟黃申請人:娟黃