專利名稱：重組人白介素-15的生產方法
技術領域：
本發明涉及基因工程領域。更具體地，本發明提供了一種重組人白細胞 介素一15的編碼序列、重組人白細胞介素一15高表達工程細胞構建方法以及 相應的表達載體的構建。
背景技術：
1994年5月，美國西雅圖I隱unex生物技術研究與開發公司和美國FDA的 生物產品與研究中心分別從非洲綠猴腎上皮細胞系CV-1/EBNA和成人白血病 T細胞系HuT-102的培養上清中發現了一種可溶性細胞因子。它能夠維持T細 胞增殖，并具有許多與白細胞介素2(IL-2)相同的生物學功能。，因子成熟蛋 白的氨基酸序列與GeneBank和EMBL數據庫中的任何蛋白質均不相同，因此將 這一新的細胞因子命名為白細胞介素15(IL-15)。人的許多組織細胞可以表 達IL-15,最佳來源為黏附的外周血單核細胞、上皮細胞和成纖維細胞，而 IL-2主要由活化的T淋巴細胞產生。人IL-15cDNA是以猴IL-15cDNA為探針篩 選細胞系IMTLH的cDNA文庫而獲得，兩者編碼區序列97%相同。人體多種組織 和細胞表達IL-15mRNA，如心、肺、肝、腎，尤以胎盤和骨骼肌以及PBMC最 為豐富，但活化的外周血T細胞卻檢測不到IL-15mRNA。一般認為，人IL-15cDNA包含316bp的5'非編碼區、486bp的開放閱讀框 和400bp的3'非編碼區，編碼161個氨基酸，成熟蛋白由112個氨基酸組成，含 有3個潛在的N-糖基化位點。然而，Meazza等(1996)發現人肺癌細胞系由于剪 接方式不同導致了兩種不同的IL-15mRNA轉錄形式，分析與這兩種niRNA相對 應的cDNA,發現了一個新的較長的IL-15cDNA序列，它比原來已知的 IL-15cDNA長119bp，系位于第二個內含子下游的一個外顯子。這兩種mRNA對 應的蛋白質在引導肽部分不同，原已知的IL-15蛋白的引導肽含49個氨基酸， 新形式的IL-15mRNA對應蛋白的引導肽含21個氨基酸(因增加的119bp中含有 一個起始密碼子，使得原來已知的開放閱讀框發生了變化)，而成熟蛋白的氨 基酸序列相同。0nu等(1997)和Nishimura等(1998)分別在人T淋巴母細胞系 和鼠單核巨噬細胞系中也發現IL-15基因的轉錄存在上述現象。初步研究結 果顯示，這些不同的轉錄形式可能與其蛋白的表達調控有關。是否IL-15基因 也存在不同的轉錄形式目前還不得而知。研究表明，人IL-15的表達受到嚴格調控，但其調控元件及因子仍不太 清楚。IL-15mRNA可表達于多種組織與細胞，但是IL-15蛋白僅在人單核/巨噬 細胞、骨髓基質細胞培養上清以及類風濕關節炎骨膜細胞中檢出。這一方面 可能是由于缺少靈敏的IL-15檢測方法，另一方面可能是IL-15在一般條件下 表達過低。人IL-15mRNA5'非編碼區有10個AUG，這一點嚴重影響了它的翻譯 起始效率；IL-15含48個氨基酸的長信號肽也會影響其表達，因為用IL-2的信 號肽或其他引導蛋白序列替換可以在轉染細胞中將IL-15的表達量提高15 20倍，而用IL-15信號肽替換IL-2信號肽后，轉染細胞中IL-2的表達量將減少 30 50倍；在IL-15cDNA編碼區3'末端添加 一 段人工合成的表位序列 (Artificial印itope tag),也會使IL-15的表達量提高4 5倍。人IL-15受 體由A、 B、 C3個亞基組成，其中A亞基為自身獨有，與IL-2共享的B亞基為發揮 特異性功能所必需，與IL-2、 IL-4、 IL-7和IL-9共享的C亞基主要介導信號傳 遞。人IL-15與IL-2雖然在一級結構上同源性很低，但經過結構模建，發現二 者在三級結構上很相似，都屬于4螺旋的造血因子家族，螺旋為 叩-叩-down-do冊的結構取向，這是其結合相同受體亞基并具有相同生物活 性的分子基礎。IL-2RA為IL-2低親合力受體(Ka:10腦-l)，而IL-15RA為IL-15 高親合力受體(Ka^011M-l)，與B、 C亞基結合后，IL-2RABC成為IL-2的高親合 力受體(Ka=1011M-l),而IL-15RABC對IL-15R的親和力沒有改變 (Ka:1011M-l)。 IL-2RA和IL-15RA具有一定的相似性，二者都是I型膜蛋白，共 同存在保守的蛋白結合基序"Sushi"功能區(即短的同向重復區域)，這個區 域對配基結合很重要，其一級結構上的差異在于后者缺少第二個"Sushi"功 能區(IL-2RA具有兩個"Sushi"功能區)，并且胞漿尾較長。目前，還沒有證 據表明IL-2RA鏈與信號傳遞有關，但推測IL-15RA鏈的長胞漿尾可能對 IL-2RB、 C亞基介導的信號傳送發揮協同和(或)調控作用。IL-15R復合體廣泛的細胞和組織分布是IL-15發揮多種生物學功能的 基礎。哺乳動物IL-15RmRNA與IL-15mRNA—樣，均分布于T細胞、B細胞、巨噬 細胞、活化的血管內皮細胞、胸腺和骨髓基質細胞等，也分布于肝、腎、心、 肺、骨骼肌等組織細胞。人IL-15RA在細胞表面的表達水平是很低的，大部分 表達于細胞內部，正常巨噬細胞、NK細胞和T細胞受到有絲分裂原活化后，其 表達IL-15RA的能力大大增加。應用流式細胞儀對ChlL-15RA的組織分布研究 表明，ConA活化的脾淋巴細胞表達水平較高，巨噬細胞中表達水平較低，從脾 臟、胸腺、法氏囊分離的未激活的淋巴細胞幾乎不表達IL-15RA。雖然人IL-15 和IL-2共享受體亞單位B、 C，但是其作用機制并不完全相同。在與IL-2RBC的 相互作用方面，IL-2作用于raA刺激的外周血淋巴細胞的增殖不受TUll( —株 針對IL-2RB的單抗)的影響，然而TU11卻可部分影響IL-15導致的上述反應。 用MikBl(另一株針對IL-2RB的單抗)得到了同樣的結果。這說明IL-2、 IL-15 分別結合于IL-2RB的不同表位。ChlL-15和ChlL-2是否也存在且共用受體亞 單位B、 C目前還不清楚。人IL-15是一種多功能的細胞因子，包括①維持T細胞株CTLL-2的生長, 誘導細胞毒性T細胞活性，誘導預致敏T細胞的活化、分化，促進腸黏膜淋巴細 胞特別是TCRCD細胞的分化生長，而且與IL-2協同在較低濃度即能導致T細胞 的迅速增殖。②對正常B細胞，在用十四酰佛波乙酸脂(PMA)和抗IgM抗體預活 化后，IL-15可誘導其增殖反應，但對靜息B細胞無此效應。當將IL-15與CD40L 聯合應用時，可使B細胞分泌IgG;對于惡變的B細胞，IL-15不需活化便可誘導 其增殖。③可以誘導NK細胞的分化成熟，增強其殺傷活性，也可顯著增進NK細 胞表達IFN-C和TNF2A;從小鼠骨髓中分離的多向祖細胞用 CSF/IL-l/IL-6/flt3L培養后加IL-15可以分化成NK1. l +表型，不加IL-15則 分化成NKl. 12表型。④能夠刺激正常人外周血單核細胞(PBMC)釋放可溶性 IL-2RA,也可刺激正常靜息的人PBMC增殖。⑤高濃度的IL-15(10 1000ng/mL) 能增加LPS活化的單核巨噬細胞產生促炎癥因子，如IL-1、 IL-6和TNF2A，低濃 度的IL-15(〈1.0ng/mL)能選擇性的抑制促炎癥因子的產生，對抗炎性因子無 影響。⑥抑制淋巴細胞發生凋亡，且可抑制IL一介導的活化誘導的細胞死亡 (Activation2induced celldeath， AICD)。人IL-15的這些生物學特性在調節 機體免疫應答中有重要作用。研究發現，人IL-15對Th2細胞的體內外發育并不重要，相反卻可以顯
著增強T細胞產生IFN-C的能力，與Thl細胞發育有關。就目前白細胞介素15的 研究進展看，除了IL-6是Th2類細胞因子以外，其他因子包括IFN-A、 IFN-C、 IL-1B、 IL-2、 IL-15和IL-18均誘導Thl免疫反應。人IL-15的產生是抗微生 物感染早期免疫應答的一部分，它能在不利于炎癥前期細胞因子(如IL-2等) 表達的環境下持續發揮作用，并通過激活TCRCD細胞填補吞噬系統和TCRAB細 胞特異免疫應答之間的空隙。TCRCD細胞與NK細胞及淋巴因子激活的殺傷細 胞類似，均可裂解靶細胞。近年來在甲狀腺炎患者的甲狀腺內也檢測到了高 濃度IL-15，提示IL-15可能與甲狀腺炎的致病機理有關。國內外對IL-15的表達和純化工作已有報道，但是表達量不高， 一般 占菌體總蛋白的5_10%，或者純化困難，得率低。本發明采用了大腸桿菌表 達系統表達IL-15，通過對人IL-15基因的優化，構建含有優化的人IL-15基 因的表達載體，并獲得了高水平的表達菌株。發明內容本發明的目的就是提供一種優化的重組人IL-15蛋白的編碼序列。 本發明的另一目的就是提供一種高表達重組人IL-15蛋白的工程細胞構 建的方法和用于該方法的表達載體及工程細胞。在本發明的第一方面，就是提供了一種優化的編碼重組人IL-15蛋白的 核苷酸序列，在不改變IL-15的氨基酸序列的情況下，通過基因編碼序列的 優化設計，獲得優化的編碼重組人IL-15蛋白的核苷酸序列。所述的核苷酸序列編碼SEQIDN0.2所示的氨基酸序列，而且所述核苷酸 序列編碼區與SEQIDNO. 1所示核苷酸序列有95%以上相同性。在另一優選例中，所述的核苷酸序列含有SEQIDNO. l所示的核苷酸序列。在本發明的第二方面，提供了一種高表達重組人IL-15蛋白的工程細胞構 建的方法，通過將優化后的人IL-15編碼序列與合適的表達載體連接，轉入 大腸桿菌，篩選獲得高表達工程細胞。在另一優選例中，所述的表達載體是pBV220/IL-15。
在本發明的第三方面，提供了一種工程細胞，其特征在于，整合有上迷 的表達載體。在另一優選例中，所述的工程細胞是大腸桿菌。
無。
具體實施方式
本發明人通過深入而廣泛的研究，通過基因編碼序列的優化設計，將優 化后的人IL-15編碼序列轉入大腸桿菌，從而實現了人IL-15高效表達。在此 基礎上完成了本發明。本發明根據人IL-15天然氨基酸序列，按密碼子偏愛性，在不改變氨基 酸序列的條件下，優化人IL-15基因，然后全基因合成重組人IL-15蛋白的目 的基因序列，將該基因克隆到pUC57中測序驗證。優化后的人IL-15編碼序列與表達載體pBV220連接，轉入大腸桿菌 BL21(DE3)STARTM/plysS，通過施加抗生素篩選出的轉化細胞，再通過小 搖表達篩選獲得高表達工程細胞。在本發明的 一 個實例中，構建了生產重組人IL-15的大腸桿菌 BL21(DE3)STARTM/plysS表達工程細胞，溫度誘導。本發明的優點在于(1)優化后的重組人IL-15蛋白基因非常適合在大腸桿菌中表達，具有 高表達、高穩定的特點。(2)溫度誘導表達，方便，成本低。下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于 說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實 驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊 (NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress， 1989)中所述的條件，或按照 制造廠商所建議的條件。
實施例l表達質粒的構建和高表達工程菌株的獲得表達載體構建方法通過PCR擴增得到目的人IL-15基因，用NcoI+EcoRI 雙酶切(MBI， 2*TangoTM， 37°C ) PCR產物及BL21(DE3)STARTM/plysS質粒(購 自Invitrogen公司)。將兩個片段用T4DNA連接酶進行'連接，連接產物轉化進 入大腸桿菌DH5 a (購自Promega公司)，在含有氨芐青霉素的LB平板上挑選克 隆，小量制備質粒，通過雙酶切/PCR鑒定篩選出陽性克隆。大量擴增確證的 pBV220/IL-15質粒，用Nco I+EcoRI雙酶切鑒定；pBV220/IL-15質粒經測序 驗證后，轉化進入大腸桿菌BL21(DE3)STARTM/plysS (購自Promega公司)， 在含有氨芐青霉素的LB平板上挑選陽性克隆并進行質粒酶切鑒定，小量制備 質粒，通過雙酶切/PCR鑒定篩選出陽性克隆。獲得含有IL-15的重組質粒的工 程菌BL21 (DE3)STARTM/plysS/ pBV220/IL-15 。在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文 獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣 落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
序列表<110〉 上海新生源醫藥研究有限公司 上海新生源生物醫藥有限公司<120>重組人白介素-15的生產方法<160> 2<210> 1<211〉 348<212〉 DNA<213〉 人工序列<221〉 misc—feature<222> (1),. (348)<223>優化的重組人IL-15基因<400> 1aactgggtta acgtgattag tgatctgaat aaaatcgaag acctgatcca gtctatgcac60atcgacgcta ctctgtacac cgaaagcgac gttcacccgt cttgcaaagt aaccgctatg120aagtgcttcc tcctggagct ccaggttatc tctcttgagt ccggtgacgc ttctatccac180gacaccgtag aaaacctgat catcctggct aacaactctt tgtcttctaa cgggaacgta240accgaatctg gttgcaaaga atgcgaggaa ctggaggaaa aaaacatcaa agagttcttg300cagagcttcg tacacatcgt tcagatgttc atcaacactt cttaatag348<210〉 2<211> 114<212〉 PRT<213> 智人<400> 2Asn Trp Val Asn Val lie Ser Asp Leu Lys Lys lie Glu Asp Leu15 10 15lie Gin Ser Met His lie Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp 20 25 30Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu 35 40 45Glu Leu Gin Val lie Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser lie His 5055 60Asp Thr Val Glu Asn Leu lie lie Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser 65 70 75Ser Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu80 85 90Leu Glu Glu Lys Asn lie Lys Glu Phe Leu Gin Ser Phe Val His95 100 105lie Val Gin Met Phe lie Asn Thr Ser110 11權利要求
1.一種高表達重組人白介素-15蛋白的工程細胞構建的方法，其特征在于，它包括步驟a)獲得優化的白介素-15的DNA序列；b)構建合適表達載體；c)轉化宿主細胞，篩選獲得高表達的工程細胞。
2. 如權利要求l所述的方法，其特征在于，步驟(a)中所述的優化的白介素-15 的DNA序列編碼如SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列，其與SEQ ID N0:1所示的DNA 序列有95%以上的同源性。
3. 如權利要求l所.述的方法，其特征在于，步驟(b)中所述的表達載體含有權利 要求1所述的DNA序列。較佳地，所述的表達載體是pBV220/IL-15。
4. 如權利要求l所述的方法，其特征在于，步驟(c)中所述的工程細胞，含有權 利要求3所述的表達載體或權利要求2所述的編碼重組人白介素-15的DNA序列。
全文摘要
本發明提供了一種重組人白細胞介素-15的編碼序列、一種高表達重組人IL-15蛋白的工程細胞構建的方法及相應的表達載體的構建。通過優化人IL-15基因，構建入合適的表達載體，非常適合在大腸桿菌中表達，同時通過篩選獲得高表達重組人白細胞介素-15工程細胞。
文檔編號C12N15/24GK101153283SQ20071014866
公開日2008年4月2日 申請日期2007年8月31日 優先權日2006年8月31日
發明者軍 任, 朱飛云, 郭學彥, 黃陽濱 申請人:上海新生源醫藥研究有限公司;上海新生源生物醫藥有限公司