一種人白介素2的制備工藝及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及基因工程法制備蛋白領域，具體涉及一種白介素2的制備工藝及其應用。本發明采用基因工程的方法，人工合成表達人IL-2蛋白的重組基因EK-IL2，將該重組基因序列插入載體，轉化宿主細胞，通過發酵工藝的設計，分離、酶切、純化等步驟的組合，最終獲得純化的人IL-2蛋白。獲得的人IL-2蛋白活性好，產量高；人IL-2蛋白的制備工藝簡單、安全，成本低，利于人IL-2蛋白的工業大規模生產。
【專利說明】一種人白介素2的制備工藝及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及基因工程法制備蛋白領域，具體涉及一種白介素2的制備工藝及其應用。
【背景技術】
[0002]1976年Morgan等發現小鼠脾細胞培養上清中含有一種刺激胸腺細胞生長的因子，由于這種因子能促進和維持T細胞長期培養，稱為T細胞生長因子(T cellgrowthfactor, TCGF), 1979 年統一命名為白介素 2 (interleukin2, IL-2)。
[0003]白介素-2是白細胞介素中的一種。其為多細胞來源，主要由活化T細胞產生，是由T淋巴細胞或T淋巴細胞系產生的一類最有力的T細胞生長因子，屬于Thl型細胞因子。白介素-2是具有多向性作用的細胞因子，主要起促進淋巴細胞生長、增殖、分化的作用，在抗腫瘤、抗毒素、免疫調節及感染性疾病的治療中具有重要作用。
[0004]人白細胞介素2 (白介素-2，IL-2)可促進其他細胞因子的分泌以及刺激T細胞在體外的生長。在免疫應答系統中起著極其重要的調節作用，是一種天然的免疫增強佐劑和治療劑；白介素2可以提高人體對病毒、細菌、真菌、原蟲等感染的免疫應答，使細胞毒性T淋巴細胞(CTL)、天然殺傷細胞(NK)、淋巴因子激活的殺傷細胞(LAK)和腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)增殖，并使其殺傷活性增強，進而清除體內腫瘤細胞和病毒感染細胞等；白介素2還可以增加抗體和干擾素(IFN)等細胞因子的分泌，在機體免疫應答中具有非常重要的作用，作為一種免疫增強劑 ，具有抗病毒、抗腫瘤和提高機體免疫功能等作用。
[0005]自1983年人類IL-2基因被首次克隆和測序以來，目前已有幾十個物種的IL-2基因被發現。現有技術已經利用基因重組技術，分別在大腸桿菌、酵母、猴COS細胞和昆蟲細胞中表達了有活性的IL-2，目前人IL-2已經全部采用基因工程的方法生產，并且IL-2融合蛋白也是IL-2研究的熱門方向。
[0006]人們對白介素2的研究已經有30多年的歷史了，白介素2仍然是目前研究最多的細胞因子之一，白細胞介素2的工業化生產也需要隨著IL-2臨床應用及醫藥用途的發展進一步發展和提聞。
【發明內容】
[0007]本發明的目的在于提供一種成本低、產量高，有利于大規模生產的利用基因工程的方法制備人白介素2的生產新工藝。本發明利用基因工程的方法，人工合成表達人IL-2蛋白的重組基因EK-1L2，將該重組基因序列插入表達載體，轉化宿主細胞，通過發酵，分離、酶切、純化等步驟獲得人IL-2蛋白。
[0008]本發明首先公開了一種人IL-2蛋白的制備工藝，具體步驟如下:
[0009]I)重組質粒的構建:合成表達人IL-2蛋白的重組基因EK-1L2，將重組基因EK-1L2片段插入載體，獲得含有人IL-2蛋白表達序列的重組質粒；所述重組基因EK-1L2片段序列5’至3’方向依次含有Kpn I酶的限制性酶切位點序列、腸激酶識別位點序列、人IL-2蛋白基因序列和BamH I酶的限制性酶切位點序列；
[0010]2)基因工程菌的制備:將上一步獲得的重組質粒轉化宿主細胞制備基因工程菌；
[0011]3)外源基因的表達:基因工程菌發酵表達Trx_IL2融合蛋白；
[0012]4)目的蛋白的純化:裂解菌體，收集Trx_IL2融合蛋白，并通過融合蛋白的酶切、純化步驟獲得人IL-2蛋白產品。
[0013]較優的，步驟I)所述腸激酶識別位點的氨基酸序列為:DDDDK (SEQ ID NO:1);所述腸激酶識別位點的核苷酸序列為:5’ -GACGACGACGACAAG-3’ (SEQ ID NO:2)。
[0014]較優的，步驟I)所述人IL-2蛋白的氨基酸序列為:myrmqllsci alslalvtnsaptssstkkt qlqlehllld lqmilnginn yknpkltrml tfkfympkka telkhlqcle eelkpleevlnlaqsknfhl rprdlisnin vivlelkgse ttfmceyade tativefInr witfcqsiis tit (SEQ IDN0:3)。
[0015]更優的，步驟I)所述合成的表達人IL-2蛋白的重組基因EK-1L2的序列如SEQ IDNO:4所示。
[0016]較優的，步驟I)所述載體為pET32a(+)。
[0017]將本發明所述重組基因EK-1L2插入到pET32a(+)的Kpn I酶和BamH I酶的酶切位點之間，與硫氧還蛋白(TrxA)融合表達，表達包含標簽蛋白、腸激酶識別位點和人IL-2蛋白的融合蛋白，便于目的蛋白的分離純化。
[0018]較優的，步驟2)所述宿主細胞為大腸桿菌。
[0019]更優的，所述宿主細胞為大腸桿菌BL21 (DE3)。
[0020]較優的，步驟3)所述基因工程菌的發酵方法如下:
[0021]a.種子的活化:挑取斜面種子，接種于添加了 80~120ug/ml氨芐青酶素的一級種子培養基中，35~38°C，180~300rpm搖瓶培養4~12小時，獲得一級種子液；所述一級種子培養基的組成為=NH4Cl0.8 ~1.2g/L，MgS0480 ~120mg/L, CaCl24.2 ~5.6g/L，NaC18~11.5g/L，蛋白胨12~13g/L，酵母膏4~5.5g/L，乳糖4.5~5.5g/L，其余為水；
[0022]b.種子的擴大培養:取一級種子液，按5~10 %接種量接種于添加了 80~120ug/ml氨芐青酶素的二級種子培養基中，35~38°C，180~250rpm搖瓶培養4~10小時，獲得二級種子液；所述二級種子培養基的組成為:MgS0445~55mg/L，NaC18~12g/L，MnS046.4 ~6.8mg/L, H3BO3L 0 ~2.5mg/L,煙酸 0.3 ~0.5mg/L,維生素 B10.1 ~0.2mg/L,檸檬酸1.5~2.5mg/L,蛋白胨10~15g/L,酵母膏5~10g/L,葡萄糖5~10g/L,甘油2~3g/L，其余為水；
[0023]c.發酵罐發酵:將二種子液按5~8%接種量加入不含葡萄糖的發酵培養基中，35~38°C發酵培養4~8h，控制pH值在7.0~7.2，轉速180~220rpm ;再向培養基中添加葡糖糖，由通氣和攪拌速度控制溶氧在30%以上，35~37°C培養6~8h ;最后加入IPTG至終濃度為0.45~0.55mM，誘導3~5小時收菌；所述發酵培養基的組成為:蛋白胨10~18g/L,酵母膏 12.5 ~20g/L,葡萄糖 3 ~7/L，甘油 2 ~3g/L，KH2P041.5 ~4.5g/L，pH 值
7.0~7.2，其余為水。
[0024]優選的，步驟a為:挑取2~3環斜面種子，接種于添加了 100ug/ml氨芐青酶素的一級種子培養基中，37°C, 250rpm搖瓶培養6小時,獲得一級種子液。
[0025]較優的，所述一級種子培養基的組成為:NH4C1L 0g/L, MgS04100mg/L, CaCl25g/L，NaC110g/L，蛋白胨12.5g/L，酵母膏5g/L，乳糖5g/L，其余為水。
[0026]優選的,步驟b為:取一級種子液,按8%接種量接種于添加了 100ug/ml氨節青酶素的二級種子培養基中，37°C，200rpm搖瓶培養6小時，獲得二級種子液。
[0027]較優的，所述二級種子培養基的組成為:MgS0450mg/L，NaC110g/L, MnS046.6mg/L,H3BO3L 5mg/L,煙酸 0.5mg/L,維生素 B1.lmg/L,梓檬酸 2.0mg/L,蛋白胨 12.5g/L,酵母膏8g/L，葡萄糖7.5g/L，甘油3g/L，其余為水。
[0028]較優的，步驟c為:將二種子液按6%接種量加入不含葡萄糖的發酵培養基中，37°C發酵培養6h，控制pH值在7.0~7.2，轉速200rpm ;再向培養基中添加葡糖糖，由通氣和攪拌速度控制溶氧在40~55%，37°C培養8h ;最后加入IPTG至終濃度為0.5mM,誘導4.0小時收菌
[0029]較優的，所述發酵培養基的組成為:蛋白胨12.5g/L，酵母膏15g/L，葡萄糖5g/L，甘油 3g/L，KH2P043g/L, pH 值 7.0 ~7.2，其余為水。
[0030]較優的，步驟4)所述融合蛋白的酶切、純化步驟具體如下:
[0031]Α.第一步親和層析:Chelating Sepharose F.F.層析柱初步分離Trx_IL2融合蛋白；
[0032]B.酶解融合蛋白:用腸激酶酶切前一步驟獲得的分離的Trx_IL2融合蛋白，獲得酶解液；
[0033]C.第二步親和層析:)(K16/10Chelating Sepharose Fast Flow 鎮離子親和柱,純化前一步驟所得的酶解液，分離得到純化的人IL-2蛋白。
[0034]較佳的，所述步驟A第一步親和層析具體為:先用含25~35mM咪唑、300~600mMNaCl, pH 值 7.5±0.5，25 ~35mM 的 Tris-HCL 緩沖液平衡填充有 Chelating SepharoseF.F.的親和柱；采用菌體裂解處理后得到的上清液配置含有25~35mM咪唑、300~600mMNaCl, pH值7.5±0.5的上樣溶液；上柱:上樣溶液流速為10mL/min，用5~6倍柱床體積的平衡液清洗親和柱，再用含200~250mM咪唑、300~600mM NaCl, pH值7.5±0.5，濃度為20~25mM的Tris-HCL緩沖液洗脫目的蛋白，收集活性蛋白峰流出液。
[0035]更佳的，所述步驟A為:先用含30mM咪唑、500mM NaCl，pH值7.5±0.5，20mM的Tris-HCL緩沖液平衡填充有Chelating Sepharose F.F.的親和柱；采用菌體裂解處理后得到的上清液配置含有30mM咪唑、500mM NaCl, pH值7.5±0.5的上樣溶液；上柱:上樣溶液流速為10mL/min，用5倍柱床體積的平衡液清洗親和柱，再用含250mM咪唑、500mMNaCl，pH值7.5±0.5，濃度為20mM的Tris-HCL緩沖液洗脫目的蛋白，收集活性蛋白峰流出液。
[0036]較佳的，所述步驟B酶解融合蛋白具體為:將第一步收集的活性蛋白峰流出液稀釋5~10倍后，用腸激酶進行處理，獲得酶解液；加入的腸激酶與融合蛋白的質量比為1:500~2000，酶解反應溫度為12~16°C，酶切16~20小時。
[0037]融合蛋白的重量可通過考馬氏亮藍染色法(Bradford法)測定流出液的濃度來進行換算。
[0038]較佳的，所述步驟C親和層析具體為:采用XK16/10Chelating Sepharose FastFlow鎳離子親和柱，上樣緩沖液用18~22mmol/L Tris-HCL，pH值7.5±0.5，洗脫緩沖液為18~22mmol/L Tris-HCL，15~25mM咪唑，pH值7.5±0.5。上柱后，用上樣緩沖液流洗，待流穿風出現并洗至基線后，30min，0-50%梯度洗脫，收集流穿組分，即為純化的IL-2蛋白。
[0039]更佳的，所述步驟C 為:采用 XK16/10Chelating Sepharose Fast Flow 鎳離子親和柱，上樣緩沖液用20mmol/L Tris-HCL, pH值7.5±0.5，洗脫緩沖液為20mmol/LTris-HCL，20mM咪唑，pH值7.5±0.5。上柱后，用上樣緩沖液流洗，待流穿風出現并洗至基線后，30min，0-50%梯度洗脫，收集流穿組分，即為純化的IL-2蛋白。
[0040]本發明基因工程的方法制備的基因工程菌，配合本發明的發酵方法以及純化法，最終獲得的人IL-2蛋白純度可達95%，目標蛋白的回收率在72%左右。
[0041]本發明其次還公開了前述制備工藝制備人IL-2蛋白的應用。
[0042]本發明的有益效果為:采用大腸桿菌作為宿主，表達Trx標簽融合的IL-2蛋白，經腸激酶切除標簽以及一系列純化，最終得到HPLC純度高達95%的人IL-2蛋白，并且制備獲得的人IL-2蛋白活性好，產量高。本發明技術方案簡單、安全，填補了 IL-2蛋白生產工藝的欠缺，利于人IL-2蛋白的工業大規模生產。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0043]圖1:pET_32a(+)載體物理圖譜
[0044]圖2:重組質粒的酶切電泳圖譜
[0045]圖3:融合蛋白Trx_IL2在基因工程菌內表達的SDS-PAGE電泳分析(M:標準蛋白質分子量；1:融合蛋白)
[0046]圖4:融合蛋白Trx_IL2經腸激酶酶切后的SDS-PAGE電泳分析(M:標準蛋白質分子量；1:腸激酶酶切16小時后)
[0047]圖5:純化后的IL-2蛋白的SDS-PAGE電泳分析(M:標準蛋白質分子量；1:純化后的IL-2蛋白)
【具體實施方式】
[0048]本發明利用基因工程的方法，人工合成表達白介素2蛋白的重組基因EK-1L2，將該重組基因序列插入表達載體，轉化宿主細胞，通過發酵工藝，分離純化等步驟獲得白細胞介素2蛋白。
[0049]以下實施例將有助于本領域的普通技術人員進一步理解本發明，但不以任何形式限制本發明的保護范圍。
[0050]實施例1基因工程菌的制備
[0051]1.重組基因EK-1L2的人工合成
[0052]重組基因EK-1L2全序列由上海生工生物工程公司合成，所述重組基因EK-1L2的基因序列包括靠近5’端的腸激酶(EK)識別位點序列(SEQ ID N0:2)、靠近3’端的人IL-2蛋白基因序列(SEQ ID NO:3, GenBank:AAH66255.1)以及重組基因EK-1L2序列兩端的KpnI酶和BamH I酶的酶切位點序列。Kpn I和BamH I酶切位點用于重組質粒的構建；人工合成的重組基因EK-1L2序列如SEQ ID NO:4所示。
[0053]2.重組質粒的構建
[0054]I)表達載體的構建:將人工合成的重組基因EK-1L2片段經Kpn I/BamH I雙酶切后克隆于經Kpn I/BamH I雙酶切的pET32a(+)載體中，進行連接反應，連接反應條件為:T4DNA連接酶(Promega公司)，2~16°C，I~30小時，構建得到連接產物。
[0055]2)連接產物的鑒定:將上一步獲得的重組質粒通過CaCl2法(分子克隆實驗指南，第二版，科學出版社)轉化DH5ci菌，Amp抗性篩選陽性克隆，對陽性克隆進行酶切鑒定，采用Kpn I和BamH I雙酶切，酶切鑒定結果如圖2所示(Mark為分子量標準，I泳道為重組質粒雙酶切產物)，酶切出的大片段和小片段分別與載體及目的片段的大小相符；將酶切片段進行序列分析，結果表明:目的片段中含有的DNA序列與文獻報道的人IL-2基因序列一致，與及實驗設計也完全一致，構建成功的重組質粒為重組質粒pET32a (+)-1L2。
[0056]3.基因工程菌的制備
[0057]I)構建基因工程菌:
[0058]將構建成功的重組質粒pET32a(+)_IL2以CaCl2法(分子克隆實驗指南，第二版，科學出版社)轉化受體菌BL21 (DE3)，篩選陽性克隆。選擇表達相對最高的一株作為融合蛋白表達的工程菌 pET32a(+)-1L2/BL21(DE3)。
[0059]2)鑒定表達產物:
[0060]將經篩選的重組工程菌pET32a(+)-1L2/BL21(DE3)劃線在含100ul/ml氨芐青酶素的LB瓊脂平板上，37°C培養17小時。挑選生長良好的單菌落，接種于LB培養液(含Amp100ug/ml)，37°C培養過夜。將過夜菌以2%接種量接種于50ml LB培養液中(含Amp100ug/ml)，37°C振蕩培養。當OD600達0.6-0.8時，加IPTG至終濃度0.5mM，誘導4小時。菌液經5000rpm，5min離心，去培養基上清，沉淀菌體加入上樣緩沖液，100°C水浴3min，離心后上SDS-PAGE電泳(積層膠4%，分離膠15%)，染色，脫色，掃描分析；SDS_PAGE結果表明:在33KD和45KD之間有明顯表達條帶，與預期相符，融合蛋白占菌體總蛋白的31%左右。
[0061]實施例2發酵表達融合蛋白
[0062]1.培養基
[0063]一級種子培養基=NH4Cll.0g/L，MgS04100mg/L，CaCl25g/L，NaC110g/L，蛋白胨12.5g/L，酵母膏5g/L，乳糖5g/L，其余為水。
[0064]二級種子培養基:MgS0450mg/L，NaC110g/L, MnS046.6mg/L, H3BO3L 5mg/L,煙酸
0.5mg/L,維生素B10.lmg/L,檸檬酸2.0mg/L,蛋白胨12.5g/L,酵母膏8g/L,葡萄糖5g/L,甘油3g/L，其余為水。
[0065]發酵培養基:蛋白胨12.5g/L，酵母膏15g/L，葡萄糖5g/L，甘油3g/L，KH2P043g/L，pH值7.0~7.2，其余為水。
[0066]2.發酵方法
[0067]種子活化:將斜面保存的本發明制備的大腸桿菌工程菌pET32a⑴-1L2/BL21 (DE3)種子挑取兩環接種于一級種子液中(添加100ug/ml氨節青酶素),37°C, 250rpm搖瓶培養6小時,獲得一級種子液。
[0068]種子擴大培養:取一級種子液，按8%接種量接于二級液中(添加100ug/ml氨芐青酶素)，370C，200rpm搖瓶培養6小時，獲得二級種子液。
[0069]30升發酵罐發酵:將二種子液按6%接種量加入裝有發酵培養基的發酵罐(發酵培養基不含葡萄糖)中，37°C發酵培養6h，控制pH值在7.0~7.2，轉速200rpm ;再添加葡糖糖，由通氣及攪拌速度控制溶氧在30 %以上，35~37°C培養8h ;最后加入IPTG至終濃度為0.5mM，誘導4.0小時收菌。
[0070]SDS-PAGE測蛋白表達量(積層膠3%，分離膠10%)，電泳結果見圖3，電泳結果顯示:目的融合蛋白分子量約為37.4KD。
[0071]實施例3目的蛋白的純化
[0072]1.菌體處理
[0073]將發酵培養后的菌體4°C，9000rpm離心25分鐘，棄上清液。用5倍菌體重量的磷酸鹽緩沖液(PH7.0~9.0)懸浮菌體，然后勻漿，破菌，將裂解物于4°C，9000rpm離心40分鐘，取上清液。
[0074]2.分離純化
[0075]Chelating Sepharose F.F.親和層析法:先用含 30mM 咪唑、500mM NaCl, pH 值7.5±0.5，20mM 的 Tris-HCL 緩沖液平衡填充有 Chelating Sepharose F.F.的親和柱；向菌體裂解處理后得到的上清液中加入1.0M咪唑、NaCI固體及Tris-HCL緩沖液，配置含有30mM咪唑、500mM NaCl，pH值7.5±0.5的上樣溶液；上柱:上樣溶液流速為10mL/min，用5倍柱床體積的平衡液清洗親和柱，再用含250mM咪唑、500mM NaCl, pH值7.5±0.5，濃度為20mM的Tris-HCL緩沖液洗脫目的蛋白，收集活性蛋白峰流出液。
[0076]酶解融合蛋白:以腸激酶:融合蛋白質量比為1:1000，向融合蛋白中加入腸激酶進行酶解酶切溫度為16°C，酶切16小時獲得酶解液；并對酶切16小時獲得的酶解液進行SDS-PAGE,電泳結果見圖4。
[0077]進一步純化分離目的蛋白:)(K16/10Chelating Sepharose Fast Flow鎮離子親和柱，上樣緩沖液用 20 mmol/L Tris-HCL，pH值 7.5±0.5，洗脫緩沖液為 20mmol/L Tris-HCL,20mM咪唑，pH值7.5±0.5。上柱后，用上樣緩沖液流洗，待流穿風出現并洗至基線后，30min，0-50%梯度洗脫，收集流穿組分，即為純化后的蛋白IL-2，蛋白的電泳結果見圖5。
[0078]MTT法檢測IL-2蛋白活性，具體方法可參考亞甲基蘭檢測人白介素_2 (rhIL-2)活性，微生物學雜志2000年9月，第20卷第3期；結果表明本發明方法制備的IL-2蛋白可達到90U / mL的生物學活性。
【權利要求】
1.一種人IL-2蛋白的制備工藝，具體步驟如下: O重組質粒的構建:合成表達人IL-2蛋白的重組基因EK-1L2，將重組基因EK-1L2片段插入載體，獲得重組質粒；所述重組基因EK-1L2片段序列5’至3’方向依次含有Kpn I酶的限制性酶切位點序列、腸激酶識別位點序列、人IL-2蛋白基因序列和BamH I酶的限制性酶切位點序列； 2)基因工程菌的制備:將上一步獲得的重組質粒轉化宿主細胞制備基因工程菌； 3)外源基因的表達:基因工程菌發酵表達Trx-1L2融合蛋白； 4)目的蛋白的純化:裂解菌體,收集Trx-1L2融合蛋白，并通過融合蛋白的酶切、純化步驟獲得人IL-2蛋白產品。
2.如權利要求1所述的制備工藝，其特征在于，步驟I)所述人IL-2蛋白表達序列如SEQ ID NO:3 所示。
3.如權利要求1所述的制備工藝，其特征在于，步驟I)所述合成的表達人IL-2蛋白的重組基因EK-1L2的序列如SEQ ID NO:4所示。
4.如權利要求1所述的制備工藝，其特征在于，步驟I)所述載體為pET32a(+)。
5.如權利要求1所述的制備工藝，其特征在于，步驟2)所述宿主細胞為大腸桿菌。
6.如權利要求1所述的制備工藝，其特征在于，步驟3)所述基因工程菌的發酵方法如下: a.種子的活化:挑取斜面種子，接種于添加了80~120ug/ml氨芐青酶素的一級種子培養基中，35~38°C，180~300rpm搖瓶培養4~12小時，獲得一級種子液；所述一級種子培養基的組成為:NH4Cl0.8 ~1.2g/L，MgS0480 ~120mg/L, CaCl24.2 ~5.6g/L，NaC18 ~11.5g/L，蛋白胨12~13g/L，酵母膏4~5.5g/L，乳糖4.5~5.5g/L，其余為水； b.種子的擴大培養:取一級種子液，按5~10%接種量接種于添加了80~120ug/ml氨芐青酶素的二級種子培養基中，35~38°C，180~250rpm搖瓶培養4~10小時，獲得二級種子液；所述二級種子培養基的組成為:MgS0445~55mg/L, NaC18~12g/L, MnS046.4~6.8mg/L, H3BO3L O ~2.5mg/L,煙酸 0.3 ~0.5mg/L,維生素 B1.1 ~0.2mg/L,朽1 樣酸 1.5 ~2.5mg/L,蛋白胨10~15g/L,酵母膏5~10g/L，葡萄糖5~10g/L,甘油2~3g/L，其余為水； c.發酵罐發酵:將二種子液按5~8%接種量加入不含葡萄糖的發酵培養基中，35~38°C發酵培養4~8h，控制pH值在7.0~7.2，轉速180~220rpm ;再向培養基中添加葡糖糖，由通氣和攪拌速度控制溶氧在30%以上，35~37°C培養6~8h ;最后加入IPTG至終濃度為0.45~0.55mM，誘導3~5小時收菌；所述發酵培養基的組成為:蛋白胨10~18g/L,酵母膏 12.5 ~20g/L，葡萄糖 3 ~7/L，甘油 2 ~3g/L，KH2PO4L 5 ~4.5g/L，pH 值 7.0 ~7.2，其余為水。
7.如權利要求1所述的制備工藝，其特征在于，步驟4)所述融合蛋白的酶切、純化步驟具體如下: A.第一步親和層析:ChelatingSepharose F.F.層析柱初步分離Trx_IL2融合蛋白； B.酶解融合蛋白:用腸激酶酶切前一步驟獲得的分離的Trx-1L2融合蛋白，獲得酶解液；
C.第二步親和層析:)(K16/10ChelatingSepharose Fast Flow鎳離子親和柱,純化前一步驟所得的酶解液，分離得到純化的人IL-2蛋白。
8.如權利要求7所述的制備工藝，其特征在于，所述步驟A第一步親和層析具體為:先用含 25 ~35mM 咪唑、300 ~600mM NaCl, pH 值 7.5±0.5，25 ~35mM 的 Tris-HCL 緩沖液平衡填充有Chelating Sepharose RF.的親和柱；采用菌體裂解處理后得到的上清液配置含有25~35mM咪唑、300~600mM NaCl，pH值7.5±0.5的上樣溶液；上柱:上樣溶液流速為10mL/min，用5~6倍柱床體積的平衡液清洗親和柱，再用含200~250mM咪唑、300~600mM NaCl, pH值7.5±0.5，濃度為20~25mM的Tris-HCL緩沖液洗脫目的蛋白，收集活性蛋白峰流出液。
9.如權利要求7所述的制備工藝，其特征在于，所述步驟C親和層析具體為:采用XK16/1Chelating Sepharose Fast Flow 鎮離子親和柱，上樣緩沖液用 18 ~22mmol/LTris-HCL, pH 值 7.5±0.5，洗脫緩沖液為 18 ~22mmol/L Tris-HCL，15 ~25mM 咪唑，pH值7.5 ±0.5。上柱后，用上樣緩沖液流洗，待流穿風出現并洗至基線后，30min, 0-50%梯度洗脫，收集流穿組分，即為純化的IL-2蛋白。
10.權利要求1-9任一權利要求所述制備工藝制備人IL-2蛋白的應用。
【文檔編號】C12N15/26GK104178494SQ201310196174
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2013年5月23日 優先權日:2013年5月23日
【發明者】周正, 潘婷琪 申請人:上海華新生物高技術有限公司