用于測量磷酸修飾酶活性的測定法的制作方法

專利名稱：用于測量磷酸修飾酶活性的測定法的制作方法
技術領域：
本發明涉及對催化磷酸修飾的酶的生物檢測。
背景技術：
蛋白質磷酸化和脫磷酸化通常被細胞用作應對外來刺激的常用信號傳 導機制。進行這些磷酸修飾的蛋白質是被稱為激酶(磷酸化)和磷酸酶(脫磷 酸化)的酶。根據被磷酸化(或脫磷酸化)的氨基酸殘基，激酶和磷酸酶被分
為兩個家族酪氨酸激酶(磷酸酶)和絲氨酸/蘇氨酸激酶(磷酸酶)。其他在 細胞信號傳導通路中重要的酶包括產生環核苷酸(例如環AMP (cAMP)和 環GMP (cGMP))的環化酶和水解環核苷酸形成相應非環單磷酸核苷酸(即 AMP和GMP)的磷酸二酯酶，所述環核苷酸環AMP(cAMP)和環GMP (cGMP)是重要的第二信使。因為它們在調節細胞功能中的重要作用，所有 這些酶是探索和開發新的藥物療法的重要靶分子。
傳統檢測細胞蛋白質磷酸化狀態的方法依賴于放射性"P-正磷酸的摻 入。3力-磷酸化的蛋白質在凝膠上分離，然后用磷光顯像儀觀察。或者， 磷酸化酪氨酸殘基可以通過結合放射性標記抗-磷酸酪氨酸抗體，利用免疫 測定法例如免疫沉淀或者印跡進行檢測。因為這些方法需要檢測放射性同 位素，它們是耗時的，而且由于處理放射性物質時涉及安全問題，它們不 適合進行超高通量篩選(uHTS)。
在最近的方法中，放射性免疫測定法被ELISA (酶聯免疫測定法)取代。
反應后，通過抗-磷酸酪氨酸抗體與例如磷酸化的固定底物的結合來定量磷 酸化程度，所述抗體偶聯有增強酶例如過氧化物酶。
Epps等人(美國專利號6，203，994)描述了針對蛋白質激酶和磷酸酶的
熒光HTS測定法，利用了熒光標記的磷酸化報告分子和特異結合磷酸化報 告分子的抗體。利用熒光偏振法，熒光猝滅法或者熒光關聯鐠法(FCS)檢 測結合。這種方法具有內在缺陷，只有優良類別的抗體(例如克隆PT66、 PY20, Sigma)才能用作磷酸酪氨酸底物。只有少量合適的抗-磷酸絲氨酸 或者抗-磷酸蘇氨酸抗體的實例被報道(例如Bader B.等人，Journal of
Biomolecular Screening, 6， 255 (2001), Panvera kit no. P2886).但是這些 抗體的特性是不僅識別磷酸絲氨酸而且識別相鄰氛基酸為抗原表位。但是
已知激酶作用對底物是非常特異的，底物序列可能差別很大。因此，抗-砩酸絲氨酸抗體不能用作類別試劑。
Perkin Elmer (Wallac)提供了測定酪氨酸激酶的方法，它基于時間分 辨熒光和從銪螯合物到別藻藍蛋白的能量轉移(參見EP 929 810)。由于使 用了抗體，此處該方法也僅限于酪氨酸激酶。
最近，Molecular Device (美國專利號7，070,921)提供表面帶有鎵陽離 子的納米顆粒作為類別結合試劑，所述結合試劑適于檢測激酶和磷酸酶活 性的磷酸化反應，以及檢測環化酶和磷酸二酯酶活性的核苷酸環化和解環 反應。
發明概述
本發明描述基于金屬離子銦(III)和鋯(IV)特異結合磷酸化分子的能力 來檢測催化其底物磷酸修飾的酶活性的測定法。該測定法可用于酶例如磷 酸化或者脫磷酸化多肽分子的激酶和磷酸酶，和用于酶例如環化或者解環 核苷酸分子的環化酶和磷酸二酯酶。
因此，本發明提供用于測定能夠催化底物磷酸修飾以生成產物的酶活 性的方法，所述方法包括在銦(III)離子或者鋯(IV)離子存在的條件下將底
物與酶接觸的步驟，其中銦(ni)離子或者鋯av)離子可以結合底物或者產
物但不能與兩者都結合；檢測銦(in)離子或者鋯(iv)離子和底物或者產物 之間的結合程度；將結合程度和酶活性對應；其中酶選自激酶、磷酸酶、 環化酶和磷酸二酯酶組成的組。
本發明還提供篩選調節酶活性的物質的方法，所述酶催化底物進行磷 酸修飾生成產物，所述方法包括在存在或不存在所述物質，以及存在銦(III)
離子或者鋯(IV)離子的條件下，將底物與酶接觸的步驟，其中銦(III)離子
或者鋯(iv)離子可以結合底物或者產物但不與兩者都結合；檢測銦(ni)離
子或者鋯(IV)離子和底物或者產物之間的結合程度；測定該物質調節結合 程度的能力，所述結合程度與酶活性有關；其中酶選自激酶、磷酸酶、環 化酶和磷酸二酯酶組成的組。
通過考慮下面的發明詳述并結合示范性說明實施方案的附屬實例，將 更容易理解本發明的上述和其他優點和特征以及完成相同內容的方式。
附圖簡述


圖1顯示利用熒光偏振法作為檢測方法的磷酸二酯酶測定結果。(A) 利用不同濃度的鱗酸二酯酶或者(B)不同金屬離子(mP-毫極化單位 (millipolarisation))進行測定。
圖2顯示利用熒光偏振法作為檢測方法的激酶測定法，其使用了未磷 酸化底物和磷酸化產物的滴定。
發明詳述 定義
術語"磷酸修飾"是指向或者從有機分子例如多肽引入(磷酸化)或者 除去(脫磷酸化)磷酸基團，或者形成(環化)或者分解(解環)核苷酸中連接磷 酸基團和核苷的環。常見的環化分別是從ATP和GTP形成cAMP和 cGMP,通過從核苦三磷酸除去2個磷酸基團，將殘留磷酸基團的游離末 端與殘留單磷酸核苷中的糖結合。常見的解環反應是分解環，分別從cAMP 和cGMP形成非環ATP和非環GTP。
術語"底物"是指催化磷酸修飾的酶的作用分子。術語"產物"是指 來自酶-催化的砩酸修飾的產物。
術語"激酶"是指能夠使底物磷酸化的酶。術語"磷酸酶"是指能夠
使底物脫磷酸化的酶。術語"磷酸二酯酶"是指催化環化核苷酸(例如cAMP 和cGMP)的3，-酯鍵水解形成非環單磷酸核苷的酶。術語"環化酶，，是指 催化從核苷三磷酸形成環化核苷酸(例如cAMP和cGMP)的酶。
術語"銦(HI)"可與"In(III)"和"In+3，，互換，是指具有未配對電子 和+3 (正3)電荷的銦離子。銦(III)離子可以在錮鹽例如氯化銦(InCl3)的水性 混合物中形成。術語"鋯(IV)"可與"Zr(IV)"和"Zr+4，，互換，是指具有 未配對電子和+4 (正4)電荷的鋯離子。鋯(IV)離子可以在鋯鹽例如氯化鋯 (ZrCU)的水性混合物中形成。
術語"熒光的"或者"熒光"是指電磁輻射的發射，通常是可見光， 其由物質內原子或者分子電磁輻射的光或者其他形式的激發引起。術語"熒 光響應"是指表征熒光物質的熒光的一個或者多個參數。
術語"熒光強度"是指熒光物質發射的光的數量或者強度。術語"時 間分辨熒光強度"是指閃光激發后樣品的熒光強度監控為時間函數。
術語"焚光猝滅"是指降低給定物質熒光強度的任意方法。很多方法 可以導致猝滅，例如激發態反應，能量轉移，復合物形成和碰撞幹滅。
術語"熒光共振能量轉移"描述了兩個熒光分子間的能量轉移機制。 熒光供體在其特定熒光激發波長被激發。通過遠程偶極-偶極偶聯機制，這 個激發態然后被無放射的轉移到第二個分子，受體。該供體回到電子基態。 術語"時間分辨熒光共振能量轉移"是包括了時間函數的熒光共振能量轉 移的擴展。
術語"熒光偏振"是指來自溶液或者顯樹:樣品的熒光偏振的測量；用 于提供關于分子大小、形狀，和構象，分子各向異性，電子能量轉移，分 子作用，包括染料和輔酶結合，和抗原/抗體反應的信息。
本發明提供檢測催化磷酸修飾的酶的活性的方法。這種酶包括分別磷 酸化和脫磷酸化多肽分子的激酶和磷酸酶，和分別環化和解環化核苷酸分 子的環化酶和磷酸二酯酶。本發明提供的檢測法適合于廣泛用途，包括， 不限于，生命科學研究，檢測開發，藥物開發和高通量篩選。
本發明的方法基于金屬離子，銦(III) (In,或者鋯(IV) (Zr")與磷酸化 多肽的磷酸基團或者非環核苷酸的特異結合。結合是特異的，因為銦(III)離子和鋯(IV)離子不結合未磷酸化的多肽或者環化核苷酸。這些金屬離子的區別性質使它們可用于測定催化磷酸修飾的酶活性的方法中，因為這些 金屬離子只能結合底物或者酶反應的產物，而不能和兩者都結合。對酶例如激酶和磷酸二酯酶來說，In"和Zr"離子將結合產物而不結合底物，而 對磷酸酶和環化酶來說，這些離子將結合底物而不結合產物。通過檢測金 屬離子和底物或者產物(依賴于何種酶)的結合程度，可以測定酶的活性。 這些檢測法還可進一步用于篩選或者鑒定能夠調節激酶、磷酸酶、環化酶 和磷酸二酯酶活性的物質。最后，這些檢測法可用于任意激酶、磷酸酶、 環化酶或者磷酸二酯酶，因為金屬離子和磷g團間結合的發生與多肽的 任何特異氨基酸序列或者核苷酸的任何特異堿基或者核苷無關。
本發明的檢測法包括下列步驟。這些步驟包括(1)在銦(III)離子或者鋯 (IV)離子存在的條件下將底物與酶接觸，(2)檢測顯示銦(IH)離子或者鋯(IV) 離子和底物或者產物之間結合程度的響應；和(3)將該響應與影響磷酸修飾 的酶活性對應。該檢測法還包括在銦(III)離子或者鋯(IV)離子存在條件下 在底物與酶接觸的步驟前和/或期間，將底物和酶與候選物質例如預測的調節劑接觸，通過其對銦(III)離子或者鋯(IV)離子和底物或者產物結合程度 的影響，測定候選物質促進或者抑制酶活性的能力。
將檢測組分例如酶、酶調節劑、底物、產物和銦(III)離子或者鋯(IV)定組合引入有功能的接觸和/或反應性的接觸的方法。優選的方法是在溶液 中混合和/或形成原料溶液，然而也可以使用其他方法，例如將一種或多種 組分例如銦(III)離子或者鋯(IV)離子結合到珠子或者表面，只要在這種結 合后組分保持至少部分功能、特異性、和/或結合親和力。
檢測組分和/或樣品可以在任何能夠提供支持的材料上進行接觸。合適 的基質可以包括孩腺、PCR板、生物芯片、和雜交室，其中，其特征例如 孩沐的孔和微點陣(即生物芯片)位點的特點是可以包含檢測位點。合適的 1描述于下列美國專利申請，在此引入作為參考1997年4月14號提
交的序列號08/840,553;和2000年1月5號提交的序列號09/478,819。這 些徵板可以包括96、 384、 1536個孔，或者其他數量的孔。這些擲妖還可 以包括具有小體積(<50 nL)、升高的底、和/或能夠匹配傳感體積(sensed volume)的截頭圓錐體形狀的孔。
檢測顯示結合程度的響應的步驟通常包括任何完成這種檢測的方法， 包括檢測和/或定量相應參數和/或信號的變化或者發生。該方法尤其可能 包括熒光和/或非熒光方法，和異相和/或均相方法。
熒光檢測法涉及檢測熒光化合物(或者焚光團)發射的光，利用所述光 的性質了解化合物及其環境的性質。典型的熒光檢測法可能涉及(l)將樣品 置于能夠誘導樣品發出熒光的條件下，和(2)測定可檢測的顯示金屬離子和 底物或者產物結合程度的熒光響應。大部分熒光檢測法基于對合適激發光 吸收應答所發射的光。合適的熒光檢測法尤其包括，(l)熒光強度，這涉及 熒光強度的測定，(2)熒光偏振，這涉及對偏振光激發應答所發射的光偏振 的檢測，和(3)熒光共振能量轉移，這涉及熒光供體和合適受體間的能量轉 移的檢測。非熒光檢測法尤其涉及使用除了樣品發射光以外的可檢測響應， 例如吸收、散射、和/或放射性活化。這些和其他焚光和非熒光檢測法描述 于下列材料，在此引入作為參考2001年l月19日提交的美國專利申請 序歹'J號09/765,869; 和Joseph R. Lakowicz, Principles of Fluorescence Spectroscopy(第二版，1999)。
可檢測的熒光響應通常包括熒光信號的變化或者發生，這可以被肉眼 觀察和/或合適的裝置檢測。通常可檢測的響應是熒光特性的變化，例如強 度、偏振、能量轉移、壽命的變化，和/或熒光激發或者發射波長分布的變 化。熒光響應可以只是簡單測定，或者可以被定量。只是簡單測定的響應 通常包括只是確認其存在的響應，而被定量的響應通常包括具有可定量的 (例如，可數值報告的)值例如強度、偏振和/或其他性質的響應。在熒光檢 測法中，利用與實際參與結合底物的檢測組分結合的熒光團可以直接的產 生可檢測的響應，或者利用與其他(例如，報告物或者指示物)組分結合的 熒光基團可以間接的產生可檢測的響應。熒光標記檢測組分的合適方法和
熒光團描述于下列材料，在此引入作為參考Richard P. Haugland， Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (第六版，1996); 2001年3月19日提交的美國專利申請序列號09/813,107;和2001年3月 23曰提交的美國專利申請序列號09/815,932。
異相和均相方法可以通過它們在檢測前是否涉及樣品分離來區分。異 相方法通常需要將結合和未結合的種類進行分離。這種分離可以例如通過 洗滌除去任何未結合種類然后在固相上捕獲結合種類來實現，所述固相是 例如以金屬離子或者其他合適組分標記的珠子或者微板表面。然后通過檢 測捕獲的結合種類的量直接的測定結合程度，和/或通過檢測未捕獲的未結 合種類的量(如果總量已知)間接的測定結合程度。與此相反，均相方法通 常不需要大量分離但要求可檢測的響應例如熒光響應，在沒有分離結合和 未結合種類的情況下，所述熒光響應在一定程度上受結合和未結合種類的 結合或未結合的影響。
意方法。通常通過與另一種響應比較響應的存在和/或強度(例如，來自相 同樣品在不同時間和/或另 一樣品在任意時間的類似檢測)和/或校準標準 (例如，來自校準曲線，預期響應的計算，和/或發光參考材料)進行相關分 析。因此，例如，在環化核苷酸濃度的偏振分析中，通過將從未知樣品測
未知樣品中的環化核苷酸濃度，所述校準曲線在類似條件下通過測定偏振 值作為環化核苷酸濃度的函數產生。
實施例
明。它們不應被理解為限制本發明的范圍，只是為了解釋和說明。 實施例1
利用熒光偏振的磷酸二酯酶檢測
磷酸二酯酶(PDE)反應混合物包含PDE (不同濃度)和50 nM TAMRA-cGMP (TAMRA-6-羧基四甲基羅丹明)，溶于20 jil包含0.1% BSA的10 mMTris (pH=7.2)。在室溫孵育1小時后，向PDE反應混合物 中加入60 jil溶于100 mM NaAc/HAc緩沖液(pH-5，2)的10mM ZrCl4， InCl3或者GaCl3，其中緩沖液中還含有10 mM ZnS04。孵育1小時后， 用Analyst讀數儀(Molecular Devices)測定熒光偏振。實驗結果顯示于圖 1A中。圖1B顯示相似的PDE檢測，其中使用不同的金屬離子鹽。只有 ZrCl4， InCl3和GaCl3能夠顯示熒光信號，提示結合了PDE產物。 實施例2
利用熒光偏振的激酶檢測的實例
不同比例的TAMRA-KNSDLLTSPDVGLLK(底物)(Seq. Id. No.l)和 TAMRA誦KNSDLLTS (P03) PDVGLLK(產物)(Seq.Id.No.2)的混合物被用 于模擬激酶反應混合物。100 mM ZrCl4、 InCl3或者GaCb用100 mM包 含10 mM ZnS04的NaAc/HAc緩沖液(pH-5.2)稀釋。ZrCU和InCl3的稀 釋因子是1:600，而GaCl3的稀釋因子是l:10。將60 jil這些鹽溶液添加到 肽混合物中。孵育1小時后，利用Analyst讀數儀測定熒光偏振。實驗結 果顯示于圖2。
實施例3
異相測定法
當磷酸化(或者脫磷酸化)發生時，In (III)或者Zr (IV)可用于替代在金 屬包被板(Pierce)或者珠子上的Ni(II)，從非磷酸化的分子分離磷酸化的分 子。利用熒光標記的肽或者蛋白質底物，可以進行激酶或者磷酸酶檢測。 被捕獲到包被有In (III)或者Zr (IV)的顆粒、微板或者微流裝置內表面上 的磷酸化肽或蛋白質，可以在洗滌后進行檢測。如果使用可以在單個分子 或者單個細胞水平進行檢測的讀數儀，可以省略洗滌或者分離步驟。如果 用熒光團標記的cAMP或者cGMP作為底物，可以檢測磷酸二酯酶活性。
實施例4
時間分辨熒光能量轉移檢測
為測定激酶、磷酸酶、環化酶或者PDE的活性，可以使用標記有熒光
底物的受體(即Cy5或者熒光素)。當酶反應終止時，可以將標記P(V肽(或 者其他P03-標記分子)的供體(即銪復合物或者鋱復合物)與In (III)或者Zr (IV)鹽溶液一起添加到反應混合物中。當形成P03-金屬復合物時，供體和 受體對可以被In (III)或者Zr (IV)引導至非常接近，這引起熒光能量轉移。 相似的，可以^吏用猝滅劑-綴合的P03-肽(或者其他POr標記的分子) 取代供體綴合物。這里熒光信號變化反映磷酸修飾酶反應中未反應底物的 數量。
序列表
<110>弗 哈夫曼-拉羅切有限公司
<120>用于測量磷酸修飾酶活性的測定法
〈130> 24075 WO
〈150〉 US 60/875268
<151> 2006-12-15
〈160> 2
<170〉 Patentln version 3.4
<210> 1
<211> 15
<212> PRT <213>人工
〈220〉
<223>激酶底物 〈400> 1
Lys Asn Ser Asp Leu Leu Thr Ser Pro Asp Val Gly Leu Leu Lys 15 10 15
〈210> 2
〈211〉 15
〈212> PRT
<213> 人工
〈220〉
<223>激酶產物 <220〉
<221> MOD—RES
<222> (8).. (8) <223>磷酸化
〈400〉 2
Lys Asn Ser Asp Leu Leu Thr Ser Pro Asp Val Gly Leu Leu Lys 15 10 1權利要求
1、用于測定能夠催化底物磷酸修飾以生成產物的酶的活性的方法，所述方法包括以下步驟i)在銦(III)離子或者鋯(IV)離子存在的條件下將底物與酶接觸，其中銦(III)離子或者鋯(IV)離子能夠結合底物或者產物，但不與兩者都結合；ii)檢測銦(III)離子或者鋯(IV)離子和底物或者產物之間的結合程度；和iii)將步驟ii)中的結合程度和酶活性相對應；其中該酶選自激酶、磷酸酶、環化酶和磷酸二酯酶組成的組。
2、 如權利要求l所述的方法，其中底物用熒光部分標記，并且其中步驟ii)包括測量可檢測的熒光響應，所述熒光響應表示銦(III)離子或者鋯(IV) 離子和底物或者產物之間的結合程度。
3、 如權利要求2所述的方法，其中可檢測的熒光響應選自熒光強度、 熒光猝滅、時間分辨熒光強度、熒光共振能量轉移、時間分辨熒光共振能量轉移和熒光偏振組成的組。
4、 如權利要求3所述的方法，其中可檢測的熒光響應是熒光偏振。
5、 篩選調節酶活性的物質的方法，所述酶能夠催化底物磷酸修飾以生成產物，所述方法包括以下步驟i) 在存在或不存在所述物質，以及存在銦(III)離子或者鋯(IV)離子的條件下，將底物與酶接觸，其中銦(III)離子或者鋯(IV)離子可以結合底物或 者產物，但不與兩者都結合；ii) 檢測銦(III)離子或者鋯(IV)離子和底物或者產物之間的結合程度；和iii) 確定該物質調節步驟(ii)中的結合程度的能力，其與酶活性相對應； 其中該酶選自激酶、磷酸酶、環化酶和磷酸二酯酶組成的組。
6、 如權利要求5所述的方法，其中用熒光部分標記底物，并且其中步驟ii)包括測量可檢測的熒光響應，所述熒光響應表示銦(III)離子或者鋯(IV) 離子和底物或者產物之間的結合程度。
7、 如權利要求6所述的方法，其中可檢測的熒光響應選自熒光強度、熒光猝滅、時間分辨熒光強度、熒光共振能量轉移、時間分辨熒光共振能 量轉移和熒光偏振組成的組。
8、如權利要求7所述的方法，其中可檢測的熒光響應是熒光偏振。
全文摘要
本發明涉及用于測量磷酸修飾酶活性的測定法，所述酶例如激酶、磷酸酶、環化酶和磷酸二酯酶。該檢測法還可用于鑒定和篩選調節激酶、磷酸酶、環化酶和磷酸二酯酶活性的物質。
文檔編號C12Q1/42GK101205556SQ20071015967
公開日2008年6月25日 申請日期2007年12月14日 優先權日2006年12月15日
發明者甘清芬 申請人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司