一種nadp磷酸酶活性測定試劑盒及其方法

一種nadp磷酸酶活性測定試劑盒及其方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生命科學領域領域，涉及一種試劑盒，具體涉及一種NADP磷酸酶活性 測定試劑盒及其方法。
【背景技術】
[0002] NADP磷酸酶主要存在于植物組織中，是生物體內唯一催化NADP+降解為NAD+的酶， 與NADK-起調控NAD和NADP之間的平衡。
[0003] 目前已有兩種NADP磷酸酶活性的測定方法，一種是通過乙醇脫氫酶循環測定NAD 變化，另一種是通過孔雀綠定磷法測定NAD變化。通過乙醇脫氫酶循環測定NAD變化的方法 需要嚴格控制反應的溫度和時間，反應條件不易控制，試劑成本較高。孔雀綠定磷法適用于 測定磷濃度在〇. 〇6-2yg范圍內的樣品，若樣品中NADP磷酸酶催化產生的磷含量過高則需要 稀釋后測定。而且測定過程需要做預實驗，以確定樣本中NADP磷酸酶活性產生的無機磷是 否超過了測定范圍，較為繁瑣。

【發明內容】

[0004] 為了克服現有技術的缺陷，本發明旨在提供一種NADP磷酸酶活性測定試劑盒及其 方法，可快速準確的計算出NADP磷酸酶活性。
[0005] 為實現上述技術目的，達到上述技術效果，本發明通過以下技術方案實現： 一種NADP磷酸酶活性測定試劑盒，包括以下試劑： 提取液，1瓶，4 °C保存，由蔗糖、EDTA、牛血清白蛋白和苯甲基磺酰氟溶于Tr i s-HCl緩沖 溶液后配制而成，置于60mL試劑瓶中； 試劑一，液體X 1瓶，4°C保存，由Tris溶于水與冰乙酸的混合液后配制而成，置于30mL 試劑瓶中； 試劑二，粉劑X 5支，-20 °C保存，均由NADP組成，置于lmL離心管中； 試劑三，粉劑X 1瓶，4°C保存，由抗壞血酸組成，置于25mL試劑瓶中； 試劑四，粉劑X 1瓶，4°C保存，由鉬酸銨組成，置于25mL試劑瓶中； 試劑五，液體X 1瓶，室溫保存，由濃硫酸與水混合而成，置于25mL試劑瓶中； 試劑六，10mmol/L標準磷貯備液X 1瓶，4°C保存，由Na2HP〇4 · 12H20溶于水后配制而成， 置于10mL試劑瓶中。
[0006] 進一步的，所述提取液中，Tr iS-HC1緩沖溶液的濃度為50mmo 1/L，pH=7.4，體積為 60mL，鹿糖的質量為5. lg，EDTA的質量為52.6mg，牛血清白蛋白的質量為0.3g，苯甲基磺酰 氟的質量為lmg; 進一步的，所述試劑一中，Tris的質量為0.182g，Tris溶于水后與冰乙酸的混合液的pH =5.5，體積為3〇1^; 進一步的，所述試劑二中，每支離心管內的NADP的質量均為5.5mg; 進一步的，所述試劑三中，抗壞血酸的質量為2.5g; 進一步的，所述試劑四中，鉬酸銨的質量為〇.625g; 進一步的，所述試劑五中，濃硫酸的體積為3.47mL，水的體積為21.53mL; 進一步的，所述試劑六中，Na2HP〇4 · 12H20的質量為35.814mg，水的體積為10mL。
[0007] NADP磷酸酶催化NADP水解生成NAD和無機磷，可通過測定NAD或無機磷的變化來間 接反映 NADP磷酸酶活性的高低。
[0008] 一種基于分光光度法的NADP磷酸酶活性測定方法，包括以下步驟： 步驟1儀器和用品的準備； 準備可見分光光度計、恒溫水浴鍋、臺式離心機、可調式移液器、lmL玻璃比色皿、研缽、 冰和蒸餾水； 步驟2樣本的前處理； 按照組織質量(g):提取液體積(mL)為1: (5~10)的比例，進行冰浴勻漿，再采用離心率 8000g，在4°C下，離心10min，取上清，置冰上待測； 步驟3試劑臨用前的準備； 1)在每支所述試劑二中加入1 mL所述試劑一，充分溶解備用，現配現用； 2 )在所述試劑三中加入25mL蒸餾水，溶解后備用； 3 )在所述試劑四中加入25mL蒸餾水，溶解后備用； 步驟4 0.5ymol/mL標準磷應用液配制： 將所述試劑六進行20倍稀釋，即取0.5mL所述試劑六加入9.5mL蒸餾水，充分混勻； 步驟5定磷試劑的配制； 按水:試劑三:試劑四：試劑五=2:1:1:1的比例配制，配好的定磷試劑應為淺黃色，若無 色則試劑失效，若是藍色則為磷污染，定磷劑現用現配； 步驟6酶促反應；
1) 在第測定管和對照管中均加入300yL的所述試劑一和100yL的所述試劑二，并均在37 °C (哺乳動物)或25°C (其它物種)下預熱5min; 2) 在所述測定管中再加入100此步驟2中前處理過的樣本，在所述對照管中再加入100μ L蒸餾水； 3) 將所述測定管在37°C (哺乳動物)或25°C (其它物種)下準確反應30min，接著沸水浴 5min(蓋緊，以防止水分散失），冷卻后，再采用離心率10000g，常溫下離心5min，最后取上清 液； 步驟7定磷；
1) 在標準管中加入lOOyL的0.5ymol/mL標準磷應用液和lOOOyL的定磷試劑，在空白管 中加入l〇〇yL的蒸餾水和lOOOyL的定磷試劑，在測定管中加入100yL步驟6中提取的上清液 和1 OOOyL的定磷試劑，在對照管中加入1 OOyL步驟6中提取的上清液和1 OOOyL的定磷試劑； 2) 將各管內的物質混勻，在37°C(哺乳動物)或25°C(其它物種)下分別水浴30min; 3) 然后將各管冷卻至室溫，接著將分光光度計的波長調節在660nm處，蒸餾水調零，記 錄各管吸光值； 步驟8根據步驟7中得出的各管吸光值，計算NADP磷酸酶活性； 1) 按組織蛋白濃度計算： 定義:每小時每毫克組織蛋白NADP磷酸酶分解NADP產生Ιμπιο?無機磷的量為一個NADP 磷酸酶活力單位； NADP磷酸酶(U/mg prot) = (C雛fX V總）X (Aji賭-細{蹐）+ (Afi繼-Aset) + (V樣X Cpr) +Τ= 5 X (Α灘遭-細蹐）+ (Afi繼-Aset) + Cpr; 2) 按樣本鮮重計算： 定義:每小時每g組織NADP磷酸酶分解NADP產生Ιμπιο?無機磷的量為一個NADP磷酸酶活 力單位； NADP磷酸酶（U/g鮮重) = (C_1=X V總）X (Α灘證-細贈)+ (Α標體-AsesO X V總+ (WX V樣+ 觸)+T=5 X (A灘遭-細蹐)+ (Afi繼-Aset) + ff; 其中，A表示步驟7中各管的吸光值； C?隹t=0.5μηιο 1/mL，表示標準管的濃度； V總=0.5mL，表示酶促反應的總體積； V樣=0. lmL，表示加入樣本的體積； V：tm=lmL，表示加入提取液的體積； T=0.5h，表示反應時間； Cpr表示樣本蛋白質的濃度，單位為mg/mL; W表示樣本的鮮重，單位為g。
[0009]本發明的有益效果是： 本發明的方法基于分光光度法，并通過鉬酸銨定磷法來間接測定NADP磷酸酶活性，相 比孔雀綠定磷法，測定范圍更廣泛，測定管吸光值和標準管吸光值比對即可計算出NADP磷 酸酶活性，適用于測定不同NADP磷酸酶活性的樣品，因此不需要將樣品進行稀釋。本發明的 試劑盒所用試劑均為常用試劑，成本極低。本發明的試劑盒不僅檢測方便，快速，而且可同 時測定多個樣本，顯色后24小時內，重復性較好。
[0010]上述說明僅是本發明技術方案的概述，為了能夠更清楚了解本發明的技術手段， 并可依照說明書的內容予以實施，以下以本發明的較佳實施例詳細說明。本發明的具體實 施方式由以下實施例詳細給出。
【具體實施方式】
[0011]下面將結合實施例，來詳細說明本發明。
[0012] 實施例1 一種NADP磷酸酶活性測定試劑盒，包括以下試劑： 提取液，1瓶，4°C保存，由5. lg蔗糖、52.6mgEDTA、0.3g牛血清白蛋白和lmg苯甲基磺酰 氟溶于濃度為5〇1111]1〇1/1^!1=7.4，體積為6〇111]^的1'1^8-!1(]1緩沖溶液后配制而成，置于6〇1]11^試 劑瓶中； 試劑一，液體X 1瓶，4°C保存，由0.182gTris溶于少量水后用冰乙酸調節pH=5.5，最后 用水定容至30mL配制而成，置于30mL試劑瓶中； 試劑二，粉劑X 5支，-20 °C保存，均由5.5mgNADP組成，置于lmL離心管中； 試劑三，粉劑X 1瓶，4°C保存，由2.5g抗壞血酸組成，置于25mL試劑瓶中； 試劑四，粉劑X 1瓶，4°C保存，由0.625g鉬酸銨組成，置于25mL試劑瓶中； 試劑五，液體X 1瓶，室溫保存，由3.47mL濃硫酸與21.53mL水混合而成，置于25mL試劑 瓶中； 試劑六，10mm〇l/L標準磷貯備液X 1瓶，4°C保存，由35.814mgNa2HP〇4 · 12H20溶于10mL 水后配制而成，置于10mL試劑瓶中。
[0013] 一種基于分光光度法且利用上述試劑盒測定NADP磷酸酶活性的方法，包括以下步 驟： 步驟1儀器和用品的準備； 準備可見分光光度計、恒溫水浴鍋、臺式離心機、可調式移液器、lmL玻璃比色皿、研缽、 冰和蒸餾水； 步驟2樣本的前處理； 按照組織質量(g):提取液體積(mL)為1: (5~10)的比例(建議稱取約O.lg組織，加入lmL 提取液），進行冰浴勻漿，再采用離心率8000g，在4°C下，離心10min，取上清，置冰上待測； 步驟3試劑臨用前的準備； 1)在每支所述試劑二中加入1 mL所述試劑一，充分溶解備用，現配現用； 2 )在所述試劑三中加入25mL蒸餾水，溶解后備用； 3 )在所述試劑四中加入25mL蒸餾水，溶解后備用； 步驟4 0.5ymol/mL標準磷應用液配制： 將所述試劑六進行20倍稀釋，即取0.5mL所述試劑六加入9.5mL蒸餾水，充分混勻； 步驟5定磷試劑的配制； 按水:試劑三:試劑四：試劑五=2:1:1:1的比例配制，配好的定磷試劑應為淺黃色，若無 色則試劑失效，若是藍色則為磷污染，定磷劑現用現配； 步驟6酶促反應；
1) 在測定管和對照管中均加入300yL的所述試劑一和lOOyL的所述試劑二，并均在37°C (哺乳動物)或25°C (其它物種)下預熱5min; 2) 在所述測定管中再加入100此步驟2中前處理過的樣本，在所述對照管中再加入100μ L蒸餾水； 3) 將所述測定管在37°C (哺乳動物)或25°C (其它物種)下準確反應30min，接著沸水浴 5min(蓋緊，以防止水分散失），冷卻后，再采用離心率lOOOOg，常溫下離心5min，最后取上清 液； 步驟7定磷；
1) 在標準管中加入100yL的0.5ymol/mL標準磷應用液和lOOOyL的定磷試劑，在空白管 中加入l〇〇yL的蒸餾水和lOOOyL的定磷試劑，在測定管中加入100yL步驟6中提取的上清液 和1 OOOyL的定磷試劑，在對照管中加入1 OOyL步驟6中提取的上清液和1 OOOyL的定磷試劑； 2) 將各管內的物質混勻，在37°C(哺乳動物)或25°C(其它物種)下分別水浴30min; 3) 然后將各管冷卻至室溫，接著將分光光度計的波長調節在660nm處，蒸餾水調零，記 錄各管吸光值； 步驟8根據步驟7中得出的各管吸光值，并按組織蛋白濃度，計算NADP磷酸酶活性計 算； 定義:每小時每毫克組織蛋白NADP磷酸酶分解NADP產生Ιμπιο?無機磷的量為一個NADP 磷酸酶