奇異變形桿菌的核酸標識序列及檢測方法

專利名稱：：奇異變形桿菌的核酸標識序列及檢測方法
技術領域：
：本發明涉及奇異變形桿菌特異的核酸標識序列及檢測方法與應用，特別是涉及奇異變形桿菌特異的核酸標識序列及奇異變形桿菌的定性、定量PCR檢測和在制備奇異變形桿菌的定性、定量PCR檢測試劑盒中的應用。
背景技術：
：變形桿菌(尸rote"s存在于水、土壤、腐敗的有機物以及人和動物的腸道中，為條件致病菌，常引起繼發感染，如慢性中耳炎、創傷感染等，也可引起膀胱炎、嬰兒腹瀉和食物中毒等病癥(CokerC,PooreCA，LiXeta丄PathogenesisofProteusmirabilisurinarytractinfection[J].MicrobesInfect,2000,2:1497-1505.;MobleyHL，andBelasR.SwarmingandpathogenicityofProteusmirabilisintheurinarytract[J]TrendsMicrobiol,1995，3:280-284.)。變形桿菌屬包括普通變形桿菌、奇異變形桿菌、莫根變形桿菌、雷極變形桿菌和無恒變形桿菌，其中普通變形桿菌和奇異變形桿菌與臨床關系較密切。奇異變形桿菌是一種常見的可引起食物中毒的病原菌，它引起的食物中毒多呈胃腸炎或過敏反應的癥狀，主要表現為惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉、頭暈、頭痛及發熱等(MobleyHL，IslandMD，MassadG.VirulencedeterminantsofuropathogenicEscherichiacoliandProteusmirabilis[J].KidneyIntSuppl，1994，47:S129-S136.)，嚴重時還可弓l起敗血癥，并有一定的病死率(WatarmkimakornC，PerniSC.Proteusmirabilisbacteremia:areviewof176casesduring1980-1992[J].ScandJInfectDis，1994,26:361-367.)。近年來，臨床上由奇異變形桿菌引起的食物中毒發生率顯著提高，嚴重威脅到人們的健康。但是，有關奇異變形桿菌的檢測方法還比較落后，國內外專門開展該菌檢測方法研究的報道也較少(SchneiderR,LockatellCV，JohnsonDs丄DetectionandmutationofaluxS-encodedautoinducerinProteusmirabilis[J].Microbiology,2002，148:773-782.;TakeuchiH，YamamotoS，TeraiAs丄DetectionofProteusmirabilisureasegeneinurinarycalculibypolymerasechainreaction[J].IntJUrol，1996，3:202-206.)。目前，奇異變形桿菌的檢測主要依靠實驗室分離和生化鑒定，但是此類方法存在檢測周期長、步驟煩瑣等缺點，難于進行推廣應用。基于細菌特異的標識序列或抗原的檢測能夠快速特異地檢測和分析病原菌，但是，這類檢測方法的前提是知道病原特異的核酸序列。迄今為止，有關奇異變形桿菌的序列信息還很少，也沒有能夠用于鑒定的特異核酸序列。PCR技術作為新型的基因檢測手段，具有快速、準確、特異性強等特點，已成為細菌檢測方法發展的必然趨勢。PCR技術自1989年開始應用以來，不僅在分子生物學領域成為常規的方法和手段，而且在遺傳性疾病的診斷、病原體的檢測、法醫學標本的鑒定等多方面得到了廣泛的應用。并且該項技術不斷得到改進。1996年，美國AppliedBiosysteras公司推出了實日寸熒光定量PCR(real-timefluorescentquantificationPCR，real-timeFQPCR)技術，該技術是在常規PCR基礎上加入熒光標記來進行定量，不僅實現了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規PCR相比，它具有特異性更強、無污染、自動化程度高等特點。該技術是將DM探針連接熒光試劑，待此DNA探針與PCR產物結合后，通過檢測熒光光量，并用計算機軟件進行輔助分析，進行量化計算，靈敏度為O.1%。定量PCR不僅可以應用在基礎研究、臨床檢測，還可以在海關及食品衛生檢疫方面發揮重要的作用。實時熒光定量PCR技術，是指在PCR反應體系中加入一對引物的同時加入一個特異性熒光探針(TaqMan探針)，探針只與模板特異結合，其結合位點位于兩條引物之間，利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程。目前常用的Taqman熒光探針為寡核苷酸，其5'端標記有報告熒光基團(R印orter，R)，如FAM、VIC等，3'端標記有淬滅熒光基團(Quencher,Q)，如TAMRA等。探針完整時，報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收，故檢測不到熒光；在PCR擴增過程中，Taq酶的5，一3'外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監測系統可接收到熒光信號。在PCR擴增過程中，每經過一個PCR循環，熒光信號也和目的片段一樣，有一個同步指數增長的過程，每個循環結束后檢測一次熒光強度，信號強度代表模板DNA的拷貝數，整個反應結束后，便可得到一條工作曲線，根據該曲線可對未知模板進行定量分析。
發明內容本發明的目的是提供奇異變形桿菌的特異核酸標識序列。本發明所提供的奇異變形桿菌的特異核酸標識序列，來源于奇異變形桿菌(尸r"e^/zi'^ra力i7i's)，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQIDNO:1的DNA序列；2)與序列表中SEQIDNO:1限定的DNA序列的全部或部分具有90。/。以上同源性且為奇異變形桿菌特異的核苷酸序列；3)在高嚴謹條件下可與序列表中SEQIDNO:1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。所述高嚴謹條件可為用0.1XSSPE(或0.1XSSC)，0.1%SDS的溶液，在65。C下雜交并洗膜。序列表中的SEQIDNO:1由510個堿基組成。含有本發明奇異變形桿菌特異核酸標識序列的載體及宿主菌均屬于本發明的保護范圍。擴增本發明奇異變形桿菌特異核酸標識序列中任一片段的引物對也在本發明的保護范圍之內。本發明的第二個目的是提供一種篩選上述奇異變形桿菌特異核酸標識序列的方法。本發明所提供的篩選上述奇異變形桿菌特異核酸標識序列的方法，可包括以下步驟1)構建奇異變形桿菌的基因組文庫；2)隨機測定基因組文庫中克隆插入片段的序列，再將其與GenBank數據庫中的序列進行比對，根據序列的相似性，得到奇異變形桿菌的特異性序列；3)根據步驟2)獲得的特異性序列分別設計PCR擴增引物，再分別以不同的奇異變形桿菌臨床分離株及其相近菌株的基因組DNA為模板進行PCR擴增，根據所述特異性序列在奇異變形桿菌臨床分離株及其相近菌株中的分布情況，得到所述奇異變形桿菌的特異標識序列。上述篩選方法也能用于篩選其它細菌的特異核酸標識，其它通過這種方法篩選得到的核酸標識序列也在本發明的保護范圍之內。根據上述奇異變形桿菌特異的核酸序列，可得到用于對奇異變形桿菌進行定性、定量PCR檢測的引物和探針。本發明所提供的用于對奇異變形桿菌進行普通定性PCR檢測的引物，其上游引物可具有序列表中SEQIDNO:2的核苷酸序列，下游引物可具有序列表中SEQIDNO:3的核苷酸序列。將上游引物命名為PRM0007-F，序列表中的SEQIDNO:2由17個堿基組成；將下游引物命名為PRM0007-R，序列表中的SEQIDNO:3由19個堿基組成。上述引物適用于奇異變形桿菌的常規PCR檢測技術中，其檢測的對象是本發明奇異變形桿菌特異的核酸序列，即以待測樣品的基因組DNA為模板，在上述引物的引導下進行PCR擴增，若擴增產物中有408bp大小的條帶，則表明樣品中含有奇異變形桿菌。本發明的另一個目的是提供用于對奇異變形桿菌進行SYBRGreenI實時熒光定量PCR檢測的試劑盒。本發明所提供的用于對奇異變形桿菌進行SYBRGreenI實時熒光定量PCR檢測的試劑盒，包括用于對奇異變形桿菌進行SYBRGreenI實時熒光定量PCR檢測的引物，其上游引物具有序列表中SEQIDNO:4的核苷酸序列，下游引物具有序列表中SEQIDNO:5的核苷酸序列。將上游引物命名為PRM0007-F1，序列表中的SEQIDNO:4由19個堿基組成；將下游引物命名為P賜0007-Rl，序列表中的SEQIDNO:5由22個堿基組成。基于SYBRGreenI熒光染料的實時熒光PCR反應的特異性評定是通過分析PCR產物的熔鏈曲線來實現的，不同的PCR產物其熔鏈曲線也不同。可將實時定量PCR產物從5(TC緩慢而均勻地升溫至95"C，溫度每升高0.2"C讀一次熒光值，每兩次讀值間隔ls，由實時熒光定量PCR儀自動繪制溶解曲線。最后，根據標準溶解曲線得到待測樣品的起始拷貝數。本發明還提供了一種檢測奇異變形桿菌的TaqMan探針實時熒光定量PCR試劑盒。本發明所提供的檢測奇異變形桿菌的TaqMan探針實時熒光定量PCR試劑盒，可包括所述用于對奇異變形桿菌進行定性、定量檢測的TaqMan探針和引物，所述TaqMan探針具有序列表中SEQIDNO:6的核苷酸序列；所述引物的上游引物具有序列表中SEQIDNO:7的核苷酸序列，下游引物具有序列表中SEQIDNO:8的核苷酸序列。所述TaqMan探針的5，端標記有報告熒光基團，如FAM或VIC等；3，端標記有淬滅熒光基團，如TAMRA、T細TA或MGB等。本發明提供了奇異變形桿菌特異的核酸標識序列。本發明的奇異變形桿菌特異的核酸標識序列是從奇異變形桿菌基因組文庫中篩選得到的，具有較高的保守性和特異性，可用于奇異變形桿菌的定性、定量分子檢測(包括普通PCR、定量PCR、芯片和雜交等檢測方法)和奇異變形桿菌的定性、定量PCR檢測試劑盒(包括普通PCR、SYBRGreenI實時熒光定量PCR和TaqMan實時熒光定量PCR等檢測試劑盒)的制備中，從而為奇異變形桿菌所致疾病的分子診斷和病原分析奠定了基礎，應用前景廣闊。下面結合具體實施例對本發明做進一步詳細說明。圖1為用限制性內切酶^MAI對奇異變形桿菌的基因組DNA分別酶切消化15、30和60min后的酶切產物的1%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果圖2為隨機挑取的20個克隆中插入片段的PCR擴增產物的2%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果圖3為奇異變形桿菌基因組文庫中插入片段大小的分布情況的統計結果圖4為Taqman探針法定量PCR的標準曲線具體實施方式下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規方法，具體步驟可參見《MolecularCloning:ALaboratoryManual》(Sambrook，J.，Russell，DavidW.，MolecularCloning:ALaboratoryManual,3rdedition,2001，NY，ColdSpringHarbor)。所用引物合成及測序工作均由上海英俊生物技術有限公司完成。實施例l、奇異變形桿菌特異的核酸標識序列的篩選用下述方法篩選奇異變形桿菌特異的核酸標識序列，具體過程包括以下步驟-一、奇異變形桿菌基因組文庫的構建1、奇異變形桿菌基因組DNA的提取將于甘油中保存的奇異變形桿菌(菌株號82009，購自中國藥品生物制品檢定所)劃線接種于LB平板，在37'C下培養24h，挑取長出的單菌落，將其接種于5mLLB液體培養基中，待細菌生長至對數生長中期(0De。。值為0.8)，離心收集菌體，用基因組提取試劑盒(購自Promega公司)并參照試劑盒說明書提取菌體的基因組DNA，再將提取的基因組DNA用50ixl無菌水溶解，最后用NanoDrop核酸蛋白測定儀測定基因組DNA的濃度，測定結果為320ug/mL。2、奇異變形桿菌基因組DNA和pUC19質粒的酶切用限制性內切酶^iAAI對步驟1提取的奇異變形桿菌的基因組DNA進行部分酶切消化，酶切體系為10X酶切緩沖液5ul，^wJAI1U(購自TaKaRa公司)，奇異變形桿菌基因組DNA2ug，加水補充反應體系至50nl。然后將酶切反應體系于37r分別放置15、30和60min。酶切結束后，將經不同時間酶切的酶切產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結果如圖l所示(泳道M為MarkerIIIDNA分子量標準(購自天根生物技術有限公司)，泳道l-3分別為酶切15、30和60min的酶切產物)，以酶切片段大小均勻分布于0.2-2kb之間為最佳酶切條件，由圖l可以看出，酶切30min時的效果相對較好，因此將部分酶切消化的時間定為30min。將奇異變形桿菌基因組DNA用上述酶切體系酶切消化30min后，用DNA膠回收及純化試劑盒(購自Promega公司)并參照試劑盒說明書回收并純化0.2-2kb范圍內的DNA片段。將質粒pUC19(購自TaKaRa公司)用限制性內切酶^sMlI(購自TaKaRa公司)進行完全消化后，回收并純化經5ay^I消化的質粒pUC19，將其用堿性磷酸酶(購自TaKaRa公司)進行去磷酸化處理，以防止載體的自身連接，50ul去磷酸化反應體系為10X酶切緩沖液5ul，堿性磷酸酶2ul，線性pUC19質粒DNAl"g，加水補充反應體系至50ul，反應條件為37'C處理2小時，反應結束后，得到線性化的質粒pUC19。3、奇異變形桿菌基因組文庫的獲得及庫容量的測定將步驟2回收并純化的經^MAI酶切消化30min的奇異變形桿菌的基因組DNA片段與步驟2獲得的pUC19線性質粒按10:l的比例混合，用T4DNA連接酶(購自NEB公司)在16"C下連接過夜(8-16小時)。反應結束后，取部分連接產物用CaCl2法轉化大腸桿菌JM109感受態細胞(購自Tiangen公司)，然后將轉化子與lmLSOB培養基(購自生工公司)，混合，在37"C下復蘇lh。復蘇后，取100ul復蘇產物，IO倍系列稀釋，將系列稀釋產物分別涂于含有50ng/mL氨芐青霉素的LB抗性平板上，在37'C下培養16h后，用能夠清晰觀察到單克隆的稀釋度計數，根據計數結果推算基因組文庫的庫容量，結果用本發明方法構建的奇異變形桿菌基因組文庫的庫容量為l.lX105cfu。將其余復蘇產物加入30%(V/V)的甘油，分裝后于-2(TC保存。二、奇異變形桿菌基因組文庫的分析1、檢測奇異變形桿菌基因組文庫中插入片段大小的分布情況取步驟一構建的保存于甘油中的奇異變形桿菌基因組文庫50wl，加入150ulLB，混勻后涂布于含50ug/mL氨節青霉素的LB抗性平板上，在37'C下培養16h后，然后隨機挑取在抗性平板上長出的100個單克隆，分別煮沸變性后作為模板，用位于pUC19質粒多克隆位點兩側的測序引物(引物序列為pUC19-F:5'-TGTAAAACGACGGCCAGTG-3'和pUC19-R:5'-CAGGAAACAGCTATGACC-3，)進行PCR擴增，然后對PCR擴增產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，根據PCR擴增結果分析含插入片段的克隆的比例以及插入片段大小的分布情況。其中20個單克隆的PCR擴增產物的檢測結果如圖2所示(泳道M為MarkerIIIDNA分子量標準(購自Tiangen公司)，泳道1-20分別為20個單克隆的PCR擴增產物)，由圖2可以看出，插入片段大小分布不均一，然后對插入片段大小的分布情況進行統計，結果如圖3所示，所分析的100個克隆中有91%的克隆都含有插入片段，以200-500bp的小片段為主(占70%)，插入片段大小在500-800bp之間的克隆占18%，而插入片段大小大于800bp的克隆只占3X。2、插入片段的測序及同源性比對根據步驟1獲得的奇異變形桿菌基因組文庫中插入片段大小的分布情況，選擇插入片段大于500bp的14個克隆(編號為PRMOOOl-PRM0014)，將其分別接種于5mLLB液體培養基中，在37"C下培養過夜后，送測序公司進行序列測定，在去除測定序列中的載體序列后，得到了插入片段的核苷酸序列，其中，PRM0007具有序列表中SEQIDNO:l的核苷酸序列，序列表中的SEQIDNO:1由510個堿基組成。然后，將測定的插入片段核苷酸序列與GenBank數據庫中的序列進行BLAST比對，以確定序列的特異性，同源性比對結果如表1所示，僅有5個序列與其它細菌的序列有一定相似性，另外9個序列在GenBank數據庫中沒有找到相似的序列。表1插入片段核苷酸序列的同源性比對結果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>注"一"表示沒有發現相似序列。3、奇異變形桿菌特異的核酸標識序列的獲得與驗證根據步驟2的序列比對結果，從中選取了ll條相對特異的序列，對應于表l中的PRM0001-PRM0011，并根據這些序列分別設計PCR擴增引物，其中擴增PRM0007的引物如下PRM0007-F(上游引物)5，-ACGGAATGAAAGGAGTC-3，PRM0007-R(下游引物):5，-CACCAGCAAGAATAGAACA-3，;然后，分別以從食物中毒標本中分離的30株奇異變形桿菌(分離方法參見王勇等，解放軍預防醫學雜志，2007，25(2):94-97)的基因組DNA為模板，分別在上述ll對引物的引導下，用PCR的方法驗證11條序列的保守性，同時用與奇異變形桿菌相近的一些菌株(王勇等，解放軍預防醫學雜志，2007，25(2):94-97)的基因組DNA為模板，用相同的PCR方法驗證上述11條序列的特異性。序列的保守性檢測結果如表2所示，由表2可以看出，序列PRM0007的保守性最強，在所分析的30株奇異變形桿菌中的26株中都有分布。這些序列均具有較高的特異性，在所檢測的其它細菌中沒有分布。表2各序列在分離株中的分布情況片<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>上述檢測結果表明，序列PRM0007優選為本發明的奇異變形桿菌特異核酸標識序列，可用于奇異變形桿菌的定性、定量分子檢測(包括普通PCR、定量PCR、芯片和雜交等檢測方法)中。實施例2、奇異變形桿菌的普通PCR檢測用實施例1獲得的根據奇異變形桿菌的特異核酸標識序列PRM0007設計的普通PCR檢測引物PRM0007-F(上游引物)5，-ACGGAATGAAAGGAGTC-3，(序列表中序列2)和PRM0007-R(下游引物)5，-CACCAGCAAGAATAGAACA-3，(序列表中序列3)對奇異變形桿菌標準菌株(奇異變形桿菌82009，購自中國藥品生物制品檢定所)和其它菌株(王勇等，解放軍預防醫學雜志，2007，25(2):94-97)進行PCR檢測，具體檢測方法如下以各待測菌株的基因組DNA為模板，在引物PRM0007-F和PRM0007-R的引導下進行PCR擴增，PCR反應體系(25ti1)為:1XPCR緩沖液(包括lOraMTris'HClpH8.3，50mMKCl，1.5mMKCl)2.1，200uMdNTPs，上、下游引物各0.2nM，模板2yl，lUTaqDNA聚合酶。PCR循環參數為先94。C變性5min;然后94°C45s，52°C45s，72°C60s，共32個循環；最后72。C延伸10min。反應結束后，對PCR擴增產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果奇異變形桿菌82009菌株可擴增出408bpDNA條帶(PRM0007的自5'端第80-487位堿基)，其余菌株均未擴增出該DNA條帶，與預期結果相符。上述檢測結果表明根據奇異變形桿菌的特異核酸標識序列PRM0007設計的引物PRM0007-F和PRM0007-R可用于奇異變形桿菌的定性PCR檢測，并可進一步研制出含有該引物對的奇異變形桿菌的定性PCR試劑盒。實施例3、奇異變形桿菌的SYBRGreenI實時熒光定量PCR檢測根據實施例1獲得的奇異變形桿菌的特異核酸標識序列PRM0007設計SYBRGreenI實時熒光定量PCR檢測引物PRM0007-Fl(上游引物)5，-ATGAATACCGTGCCCAAGA-3，(序列表中序列4)和PRM0007-Rl(下游引物):5，-CACCAGCAAGAATAGAACAAGA-3，(序列表中序列5)對待測菌株(奇異變形桿菌，菌株號82009，購自中國藥品生物制品檢定所)和其它菌株(王勇等，解放軍預防醫學雜志，2007，25(2):94-97)進行SYBRGreenI定量PCR檢測，具體檢測方法如下以待測菌株的基因組DNA為模板，在引物PRM0007-F和PRM0007-R的引導下用實時熒光定量PCR儀Lightcycler2.0進行PCR擴增，SYBRGreenI實時熒光定量PCR反應體系(20ul)為2ulIOXPCR緩沖液，2u1MgCl"25畫l/L)，0.4ylTaqDNA聚合酶(5U/iil)，llUSYBRGreen1(1:1000，購自羅氏公司)，0.2u1dNTPs(10mmol/L)，上、下游引物(10咖ol/L)各0.15u1，9.7ulH20，2ul模板。反應條件為①預變性95°C，3min;②擴增95°C，2s;56°C，8s;72°C，lis;在72。C時熒光信號收集方式設為"SINGLE";儀器檢測通道選擇F1，共50個循環；③熔解曲線95°C，0s;50°C，30s;95°C，0s(溫度變化速率為0.20°C/s);冷卻4(TC，0s。反應條件中未標注的溫度變化速率均為20.0(TC/s。SY服GreenI實時熒光定量PCR反應系統敏感性測試及線性標準曲線繪制提取陽性質粒pUC19-PRM0007(從文庫中PRM0007號克隆中提取出來的質粒pUC19-PRM0007，該質粒是在pUC19的BamHI位點克隆了PRM0007片段)，用Nanodrop核酸蛋白微量分析儀(Nanodrop公司)定量后10倍系列稀釋，分別取每個稀釋度的稀釋液2ii1作為PCR模板，使每20ji1反應體系中含有模板拷貝數分別為10°、101、102、103、104、105、106、107、108，其余反應體系及反應條件同上，同時設立以水和空載質粒為模板(即靶基因拷貝為0)的對照反應。結果在101至108DNA拷貝/每反應范圍內，Ct值(C代表cycle,T代表threshold;CT值指熒光信號達到設定的閾值所經歷的循環數)和DNA拷貝數呈線性關系。所建立的SYBRGreenI實時熒光定量PCR反應系統的檢測最低限度可達10拷貝/反應。利用該方法，能夠對10i至l(fDNA拷貝范圍內的模板進行準確定量。同樣，以其它細菌的DNA(同特異性篩選用模板)為模板時，沒有擴增產物，表明該方法是特異的。上述檢測結果表明，用本發明引物對建立的基于SYBRGreenI雙鏈嵌合染料的實時熒光定量PCR檢測方法具有敏感性高、特異性強和線性檢測范圍廣的特點，可進一步制備出含有該引物對的奇異變形桿菌的SY服GreenI實時熒光定量PCR檢測試劑盒。實施例4、奇異變形桿菌的TaqMan探針實時熒光定量PCR檢測根據實施例1獲得的奇異變形桿菌的特異核酸標識序列PRM0007設計TaqMan探針及TaqMan探針實時熒光定量PCR檢測引物，其中，TaqMan探針P0007P:5，-ACAACAATAGCGGCACGAGTGACC-3'(序列表中序列6，5'端標記報告熒光基團FAM，3，端標記淬滅熒光基團Eclipse,并將探針的3，端進行磷酸化處理。)，TaqMan探針實時熒光定量PCR檢測引物為P0007-F(上游引物)5,-TCAACAATTTCAAAGGAGGGA-3，(序列表中序列7)和P0007-R(下游引物):5，-TTATATTGCAGGTGCTGATGT-3，(序列表中序列8)。用上述探針及引物對待測菌株(奇異變形桿菌，菌株號82009，購自中國藥品生物制品檢定所)和其它菌株(王勇等，解放軍預防醫學雜志，2007，25(2):94-97)進行TaqMan探針實時熒光定量PCR檢測，具體檢測方法如下以待測菌株的基因組DNA為模板，在引物P0007-F和P0007-R的引導下用在實時熒光定量PCR儀LightCycler2.0上進行PCR擴增，反應體系為(20ul):10XBuffer2ul;dNTP(2.5mmol/L)1.6ul;Mgcl2(25mmol/L)1.6ul;上游引物(10ramol/L)0.5ul;下游引物(10mmol/L)0.5ul;探針(10mmol/L)0.5ul;Taq酶(5U/ul)0.4ul;Rox0.4ul;模板DNA2ul;水10.lul。反應條件為先95。C3rain;然后95。C5s，60°C8s，共50個循環。TaqMan探針實時熒光定量PCR線性標準曲線繪制提取參比模板質粒(將上述PCR擴增產物純化后，用T克隆試劑盒(TaKaRa公司)克隆至pMD18T載體中得到重組質粒，由上海生物工程公司進行序列測定，測定結果表明獲得了插入序列正確的攜帶有目的片段的參比模板質粒)，用Nanodr叩核酸及蛋白分析儀定量后分級10倍稀釋，分別取每一數量級稀釋液2u1作為PCR模板，使每20ul反應體系中含有模板拷貝數分別為10。、101、102、103、104、105、106、107、108，其余反應體系及反應條件同上。結果在10°至1080脆拷貝/每反應范圍內，Ct值和DNA拷貝數呈線性關系(見圖4)，所建立的TaqMan實時熒光定量PCR反應系統的檢測最低限度可達1拷貝/反應。以其它細菌為模板時，沒有擴增產物，表明該方法是特異的。上述檢測結果表明，用本發明的TaqMan探針及引物建立的TaqMan探針實時熒光定量PCR檢測方法具有敏感性高、特異性強和線性檢測范圍廣的特點，可進一步制備出含有該TaqMan探針及引物對的奇異變形桿菌的TaqMan探針實時熒光定量PCR檢測試劑盒。1.一種脫濯柿子酒的生產方法，其特征在于包括如下步驟和工藝條件①選果，清洗，打漿選擇新鮮柿子，用清水或每公斤清水中添加0.2-0.5g高錳酸鉀的溶液洗凈柿表皮污染物，清洗后瀝干采用打漿機打漿；②護色按照每公斤果漿中添加0.2-0.3g維生素C和0.2-0.3g檸檬酸進行護色；③酶解將柿子果漿加熱45-55'C，按照每公析果漿中添加0.20-0.25g果膠酶，在50-60。C溫度條件下酶解90-100min，取汁；④脫澀和澄清按照每公斤柿汁加入0.3-0.6g明膠，靜置30-40min，澄清贅過濾s⑤成分調整使用檸檬酸將pH值調到3.5-4.5，添加蔗糖使每公斤果汁的含糖量達到200-240g;⑥發酵以酵母干粉質量計，每公斤柿汁加入0.61.2g活化后的釀酒干酵母，在24-28°C條件下進行主發酵6-8天，發酵時每公斤果汁中加入0.07-0.13g亞硫酸氫鈉，在無菌條件下將原酒過濾到經滅菌的密閉容器中，15-20'C條件下后發酵8-10天；⑦陳釀把經過后發酵的酒液密封，放在4-10"C下靜止貯存7-10天；⑧過濾、裝瓶、殺菌將陳釀后的酒液過濾，裝瓶后用70-75。C水浴殺菌15-20min;⑨入庫殺菌后入庫貯存。2.根據權利要求1所述的一種脫澀柿子酒的生產方法，其特征在于所述的步驟②維生素C為每公斤果漿中添加0.250.3g;所述檸檬酸用量為每公斤果漿中添加0.250.3g。3.根據權利要求1所述的一種脫澀柿子酒的生產方法，其特征在于所述明膠按照每公斤柿汁加0.5-0.6g的比例加入。<213〉人工序列<220><223><400>3caccagcaagaatagaaca<210>4〈211〉19〈212〉DNA〈213〉人工序列<220〉<223><400〉4atgaa_taccgtgccca^ga_<210>5<211〉22<212>DNA<213〉人工序列<220><223><400〉5caccagcaagaatagaacaaga<210〉6〈211>24〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉<223〉〈400〉63ca^c犯tagcggcacga_gtgscc24〈210〉7<211>21<212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉<400>7tcaacaatttcaaaggaggga21〈210〉8<211>21〈212>DNA〈213>人工序列〈220〉<223><400>8ttatattgcaggtgctgatgt2權利要求1、奇異變形桿菌特異的核酸標識序列，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQIDNO1的DNA序列；2)與序列表中SEQIDNO1限定的DNA序列的全部或部分具有90％以上同源性且為奇異變形桿菌特異的核苷酸序列；3)在高嚴謹條件下可與序列表中SEQIDNO1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。2、根據權利要求l所述的奇異變形桿菌特異的核酸標識序列，其特征在于所述核酸標識序列如序列表中SEQIDNO:l所示。3、一種篩選權利要求1或2所述奇異變形桿菌特異核酸標識序列的方法，包括以下步驟1)構建奇異變形桿菌的基因組文庫；2)隨機測定基因組文庫中克隆插入片段的序列，再將其與GenBank數據庫中的序列進行比對，根據序列的相似性，得到奇異變形桿菌的特異性序列；3)根據歩驟2)獲得的特異性序列分別設計PCR擴增引物，再分別以不同的奇異變形桿菌臨床分離株及其相近菌株的基因組DNA為模板進行PCR擴增，根據所述特異性序列在奇異變形桿菌臨床分離株及其相近菌株中的分布情況，得到權利要求1或2所述的奇異變形桿菌的特異標識序列。4、權利要求1或2所述的奇異變形桿菌特異的核酸標識序列在檢測奇異變形桿菌中的應用。5、用于對奇異變形桿菌進行定性PCR檢測的引物，其上游引物具有序列表中SEQIDNO:2的核苷酸序列，下游引物具有序列表中SEQIDNO:3的核苷酸序列。6、定性檢測奇異變形桿菌的普通PCR試劑盒，包括權利要求5所述的引物。7、用于對奇異變形桿菌進行SYBRGreenI實時熒光定量PCR檢測的引物，其上游引物具有序列表中SEQIDNO:4的核苷酸序列，下游引物具有序列表中SEQIDNO:5的核苷酸序列。8、對奇異變形桿菌進行SYBRGreenI實時熒光定量PCR檢測的試劑盒，包括權利要求7所述的引物。9、用于對奇異變形桿菌進行實時熒光定量PCR檢測的TaqMan探針和引物，所述TaqMan探針具有序列表中SEQIDNO:6的核苷酸序列；所述引物的上游引物具有序列表中SEQIDNO:7的核苷酸序列，下游引物具有序列表中SEQIDNO:8的核苷酸序列。10、對奇異變形桿菌進行實時熒光定量PCR檢測的試劑盒，包括權利要求9所述的TaqMan探針和引物。全文摘要本發明公開了奇異變形桿菌特異的核酸標識序列及PCR檢測方法與應用。其目的是提供奇異變形桿菌特異的核酸標識序列及奇異變形桿菌的定性、定量PCR檢測方法和在制備奇異變形桿菌的定性、定量PCR檢測試劑盒中的應用。所述奇異變形桿菌特異的核酸標識序列是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQIDNO1的DNA序列；2)與序列表中SEQIDNO1限定的DNA序列具有90％以上同源性且為奇異變形桿菌特異的核苷酸序列；3)在高嚴謹條件下可與序列表中SEQIDNO1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。本發明可用于奇異變形桿菌的定性、定量分子檢測(包括普通PCR、定量PCR、芯片和雜交等檢測方法)中，應用前景廣闊。文檔編號C12N15/31GK101215567SQ20071030387公開日2008年7月9日申請日期2007年12月26日優先權日2007年12月26日發明者鳳喬,伶張,玲張,杜昕穎,勇王,王玉飛,瑾趙,陳澤良,黃留玉申請人:中國人民解放軍疾病預防控制所