專利名稱：：檢測結核分支桿菌和非結核分支桿菌核酸擴增產物的試紙與方法
技術領域：
：本發明涉及一種用于快速識別是否存在結核分支桿菌和非結核分支桿菌的擴增DNA產物的試紙和方法。技術背景結核分支桿菌(A//co/^cte/7々/77/"Ze/"c"/os/^是一種弓I起肺結核病(Tuberculosis,TB)的細菌。結核分支桿菌大多攻擊呼吸系統，但也可感染身體的其它器官、組織等。結核分支桿菌通過其攜帶者咳嗽、打噴嚏或說話等行為而通過空氣傳播。在2004年，統計數據顯示有1460萬人長期患病、有890萬人是新增病例、有160萬人死亡，這些人大部分分布在發展中國家。然而，因為免疫抑制藥物的濫用或艾滋病的感染，越來越多的發達國家的人患上了肺結核。非結核分支桿菌(Nontuberculousmycobacteria,NTM)不會引起我們所說的肺結核癥狀，且感染到非結核分支桿菌并不會傳染，因此不會產生公共衛生問題。它不像結核分支桿菌引起的疾病，屬于非法定傳染病。然而，受非結核分支桿菌感染的組織，會引起與肺結核病相似的肉芽腫(gra皿lomataformation),進而導致干酪樣壞死(caseousnecrosis)。在直接涂片中，分支桿菌抗酸醇Ziehl-Neelsen染色呈陽性反應，故無法區別是結核分支桿菌或非結核分支桿菌。只有通過細菌培養，才能從它們特定的形態特征上加以區別。結果導致感染非結核分支桿菌的患者，經常首先被診斷出肺結核癥狀。只有當細菌培養約六周后，才發現診斷需修正，這段期間導致患者或醫生治療混亂。快速正確地檢測結核分支桿菌的臨床樣本，對于臨床治療及疑似病人的確認，都有越來越重要的作用。分子技術，例如結核分支桿菌特定DNA的PCR擴增，可能是一種最有前景的快速、精確和敏銳的診斷方式。在加拿大專利第02223705號中，JiaBeiZhu等揭露了檢測核酸擴增最終產物的一步分析法，該方法是通過用免疫原分子或親和配體化合物來標記用于DNA擴增的探針，以及利用預固定有兩種不同抗體和/或配體的測試試紙來檢測最終產物來進行的。
發明內容本發明提供一種用于檢測結核分支桿菌(TB)和非結核分支桿菌(NTM)的核酸擴增產物的檢測試紙，其包括:(a)抗生物素蛋白-金釋放區域(avidin-goldreleaseregion)和(b)測試帶。本發明還提供一種檢測TB盒NTM的方法，其包括(a)擴增具有標記的引物的樣本DNA;(b)用電泳緩沖夜混合擴增的DNA產物；(c)將所述檢測試紙浸入所述混合物中；和(d)使所述混合物流向試紙的反應區。圖1為本發明一個實施例中的設計圖。圖2顯示了引物的相對位置。圖3顯示了不同比例的結核分支桿菌及非結核分支桿菌的效果。圖4顯示了不同電泳緩沖液的效果。圖5顯示了引物與試紙的特異性。圖6顯示了TB/NTM二重PCR及巢式二重PCR的檢測局限。圖7顯示了當用TB/NTM巢式二重PCR擴增DNA時試紙的檢測局限。具體實施方式肺結核的致死率與死亡率在傳染病中列于首位。然而，由于結核分支桿菌與非結核分支桿菌的臨床癥狀相似，傳統的診斷方法不但耗時而且混亂。快速而精確的診斷分支桿菌菌屬(Mycobacterialspecies),可以幫助臨床治療并降低傳染風險。本發明的試紙及方法為從檢測分支桿菌提供了一種快速且簡便的方式，而且可在同一張試紙上檢出兩種分支桿菌，例如TB和NTM。本試紙是一片吸水紙，自左到右包括，抗生物素蛋白-金釋放區域和有測試帶的測試區。所述試紙還可以包括位于所述測試區之后的對照帶。抗生物素蛋白-金釋放區域被覆蓋著連有抗生物蛋白的膠體金顆粒。另外，兩種與下述免疫原標記引物相對應的抗體分別被預固定在兩個檢測帶上，而結合有牛血清白蛋白(BSA)的生物素被預固定在對照帶上。本方法包含四個步驟。在第一步中，通過PCR，將一個鏈上含有生物素而另一鏈上含有免疫原分子例如DIG或FITC的特別設計的引物，用于擴增從病人體內獲得的樣本DNA。所述引物對應于一個耙標基因，例如rpoB基因，其包含高度保守區域，該區域存在于所有分支桿菌種類中但各種類間又是可區別的。擴增后，DNA產物被混合在電泳緩沖液中。在以下步驟中，測試試紙的左邊浸入混合物，使得混合物利用毛細作用由左向右移動。如果靶標DNA是存在于樣本中，且已被擴增，則所述DNA產物將在其一端包含生物素，而在其另一端包含免疫原分子。在DNA產物中的生物素將通過生物素化而在抗生物素蛋白-金釋放區域結合到抗生物素上，從而與膠體金顆粒結合。測試帶上的抗免疫原性分子抗體將結合到DNA產物中的免疫原分子上。只要樣本中存在生物素，并且與抗生物素蛋白-金釋放區域的抗生物素蛋白-金充分反應，使得抗生物素蛋白-金移向試紙的右側，則膠體金顆粒也將會被連結到對照帶上。因為膠體金的自然色為紅色，所以檢測帶及對照帶將顯色為紅色條帶。若檢測帶為紅色，則表示為陽性反應。如測試標的物不存在于混合物中，g卩，無DNA被擴增，則無標記DNA存在。在試紙上，在檢測帶將不發生反應，紅色條帶將僅僅存在于對照帶上，而不論該靶標DNA是否存在于樣本中。在一些實施例中，試紙上的區域和條帶由左至右的順序為抗生物素蛋白-金釋放區域、TB檢測帶、NTM檢測帶及控制帶。TB檢測帶覆蓋有預固定的抗DIG抗體，NTM檢測帶覆蓋有預固定的抗FITC抗體。對照帶覆蓋有BSA-生物素。結合到TBDNA的引物對其中一鏈標記有生物素，而另一鏈標記有DIG。而結合到NTMDNA的引物對其中一鏈標記有生物素，而另一鏈標記有FITC。如果樣本中含有TB，則TBDNA將被擴增，因此TB檢測帶與對照帶將顯示紅色。如果樣本中含有NTM，則NTMDNA將被擴增，因此NTM檢測帶與對照帶將顯示紅色。如果TB、NTM皆存在于樣本中，貝l」TB、NTMDNA都將被擴增，因此TB、NTM檢測帶以及對照帶都將顯示紅色。如果TB、NTM都不存在于樣本中，則無DNA被擴增，因此TB、NTM檢測帶都不會顯示紅色，只有對照帶將顯示紅色。實施例以下實施例進一步說明本發明。它們僅用于說明本發明，并闡明本發明特定實施例的各種優點，但不表示本發明只局限于此種方式。本發明實施例的設計如圖l所示。實施例1耙標DNA的擴增下述引物的相對位置如圖2所示。首先用rpoB弓I物通過PCT擴增TB/NTM的rpoB基因。正義引物RpoBF3的序列為5'-ACCGACGACATCGACCACTT-3，(SEQIDNO:1)。反義引物RpoBR2的序列為5，-AGCCGATCAGACCGATGTT-3(SEQIDNO:2)。第一次PCR的條件如下95°C95°C54°C72°C72°C4。C5分鐘l分鐘l分鐘l分鐘5分鐘保存30循環10x延伸緩沖溶液5dNTP(10mM)1rpoBF3(lOuM)1rpoBR2(lOuM)1PowerTaq(5U/ul)0.4水36.6pi模板DNA5總共50第一次PCR的產物隨后被用作第二次PCR的模板。用作第二次PCR的引物為TB引物和NTM引物，TB正義引物Tbcl的序列為5-CGTACGGTCGGCGAGCTGATCCAA畫3，(SEQIDNO:3);TB反義引物TbcR的序列為5，陽GACCTCCAGCCCGGCACGCTCACGT畫3，(SEQIDNO:4)。NTM正義引物NTMM5的序列為5，-GGAGCGGATGACCACCCAGGACGTC-3，(SEQIDNO:5);NTM反義引物NTMRM3的序列為5，-CAGCGGGTTGTTCTGGTCCATGAAC-3，(SEQIDNO:6)。測試TB弓I物和NTM引物的比例，結果顯示最佳比例為0.3ulTB引物加1ulNTM引物，參考表1及圖3。表11234567810x緩沖夜55555555dNTP0.50.50.50.50.50.50.50.5Tbcl-biotin0.5111.50.50.30.50.3TbcR7-DIG0.5111.50.50.30.50.3NTMM5-biotin0.510.50.5111.51.5NTMRM3-FITC0.510.50.5111.51.5Taq0.20.20.20.20.20.20.20.2DNA55555555水37.335.336.335.336.336.735.335.7總共5050505050505050根據測試結果，第2次PCR的條件如下:10x延伸緩沖液95°C5分鐘95°C30秒72°C60秒72°C5分鐘4°C保存h35循環dNTP(10mM)Tbcl-biotin(10uM)TbcR7-DIG(10uM)NTMM5畫Biotin(10uM)NTMRM3-(FITC)(10uM)PowerTaq(5U/ul)水0.4pi36.5pl模板DNA50jil實施例2電泳緩沖液申請人測試了三種電泳緩沖液。緩沖液A包含10mMHEPES,1%牛血清白蛋白(BSA),和0.1°/。吐溫20。緩沖液B包含lOmMTris,1%牛血清白蛋白(BSA),和0.1%吐溫20。緩沖液C包含lx磷酸緩沖液(PBS)，1%牛血清白蛋白(BSA)，及0.1%吐溫20。結果顯示緩沖液B提供了最佳的電泳條件，如圖4所示，其中C為對照帶，T為結核分枝桿菌檢測帶，N為非結核分枝桿菌檢測帶，TB(+)為結核分枝桿菌陽性，NTM(+)為非結核分枝桿菌陽性，TB(-)為結核分枝桿菌陰性，NTM(-)為非結核分枝桿菌陰性。實施例3弓l物與TB/NTM檢測試紙的特異性為測試上述引物的特異性，以另外四種經常存在于呼吸道的細菌的基因組位靶標，進行上述測試步驟。這四種細菌是流感嗜血桿菌(Haemophilusinfluenzae)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、克雷白氏月巿炎菌(Klebsiellapneumoniae)禾口月巿炎鏈球菌(Streptococcuspneumonia)。結果顯示引物及試紙對于TB及NTM具有特異性(如圖5所示，其中TB代表結核分枝桿菌；NTM代表非結核分枝桿菌；H代表流感嗜血桿菌；S代表金黃色葡萄球菌；K代表克雷白氏肺炎菌；P代表肺炎鏈球菌)。實施例4TB/NTM檢測試紙的敏感度為測試TB/NTM試紙的敏感度，TB/NTM二重PCR及TB/NTM巢式二重PCR被用來擴增DNA。結果顯示依靠TB/NTM二重PCR檢測TB及NTM的最低限度為20000份(見圖6);依靠TB/NTM巢式二重PCR，檢測TB的最低限度至少為10份，檢測NTM的最低限度至少為20份(見圖7)。試紙的生色結果與電泳結果一致。試紙亦偵測TB至少需10份及NTM至少為20份，如圖7。實施例5TB/NTM試紙對于臨床樣本的特異性及敏感性為了確認實際TB/NTM檢測試紙對臨床樣本的特異性及敏感性，共收集239個臨床樣本且利用TB/NTM檢測試紙檢測并用傳統細菌培養方式作比較。實驗結果如下<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>利用TB/NTM試紙測試的239個臨床樣本中，只有1個(169號)與細胞培養的檢測結果不相符。因此TB/NTM檢測試紙的TB檢測靈敏度約為97%>特異性為100%，而NTM檢測靈敏度為100%、特異性為97%。雖然本發明已以較佳實施例揭露如上，但并非用以限定本發明。本領域的任何技術人員，在不脫離本發明的精神和范圍內，所作的改動或修飾，均屬本發明的專利保護范圍。序列表<110>亞洲基因科技股份有限公司<120>檢測結核分支桿菌和非結核分支桿菌核酸擴增產物的試紙與方法<150>US11/948,389<151>2007-11-30<160>6<170>Patentlnversion3.4<210>1<211>20<212>DNA<213>結核分支桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)<400>1accgacgacatcgaccactt20<210>2<211>19<212>DNA<213>結核分支桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)<400>2agccgatcagaccgatgtt19<210>3<211>24<212>DNA<213>結核分支桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)<400>3cgtacggtcggcgagctgatccaa24<210>4<211>25<212>DNA<213>結核分支桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)<400>4gacctcc3gcccggcacgctcacgt25<210>5<211>25<212〉DNA<213>結核分支桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)<400>5ggagcggatgaccacccaggacgtc25<210>6<211>25<212>DNA<213>結核分支桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)<400>6cagcgggttgttctggtccatgaac2權利要求1.一種用于檢測結核分支桿菌及非結核分支桿菌的核酸擴增產物的試紙，其包含(a)抗生物素蛋白-金釋放區域和(b)檢測帶，其中所述檢測帶為結核分支桿菌檢測帶或非結核分支桿菌檢測帶。2.根據權利要求1所述的試紙，其特征在于該試紙進一步包含對照帶。3.根據權利要求1所述的試紙，其特征在于所述核酸擴增產物為利用標記引物通過PCR擴增的DNA。4.根據權利要求3所述的試紙，其特征在于所述標記引物在其一鏈上標記生物素，在其另一鏈上標記免疫原分子。5.根據權利要求4所述的試紙，其特征在于所述免疫原分子是地高辛或異硫氰酸熒光素。6.根據權利要求1所述的試紙，其特征在于所述結核分支桿菌檢測帶被覆蓋有與被標記的結核分支桿菌DNA結合的抗體。7.根據權利要求6所述的試紙，其特征在于所述結核分支桿菌檢測帶被覆蓋有抗地高辛抗體。8.根據權利要求1所述的試紙，其特征在于所述非結核分支桿菌檢測帶被覆蓋有與被標記的非結核分支桿菌DNA結合的抗體。9.根據權利要求8所述的試紙，其特征在于所述非結核分支桿菌檢測帶被覆蓋有抗異硫氰酸熒光素的抗體。10.根據權利要求1所述的試紙，其特征在于所述對照帶被覆蓋有牛血清白蛋白結合的生物素。11.一種檢測結核分支桿菌及非結核分支桿菌的方法，其包含以下步驟:(a)利用標記引物擴增樣本DNA;(b)將擴增的DNA產物與電泳緩沖液混合；(C)將檢測試紙浸入所述混合物；及(d)使混合物移向試紙上的反應區。12.根據權利要求11所述的方法，其特征在于所述標記引物其一鏈標記有生物素，其另一鏈上標記有免疫原分子。13.根據權利要求11所述的方法，其特征在于所述免疫原分子是地高辛或異硫氰酸熒光素。14.根據權利要求11所述的方法，其特征在于所述檢測試紙為權利要求1所述的試紙。全文摘要本發明提供一種用于檢測結核分支桿菌(TB)和非結核分支桿菌(NTM)的核酸擴增產物的檢測試紙，其包括(a)抗生物素蛋白-金釋放區域(avidin-goldreleaseregion)和(b)測試帶。本發明還提供一種檢測TB和NTM的方法，其包括(a)擴增具有標記的引物的樣本DNA；(b)用電泳緩沖液混合擴增的DNA產物；(c)將所述檢測試紙浸入所述混合物中；和(d)使所述混合物流向試紙的反應區。文檔編號C12Q1/04GK101307355SQ20081013360公開日2008年11月19日申請日期2008年7月11日優先權日2007年11月30日發明者周錦生,撒耘伊央,朱志鋒申請人:亞洲基因科技股份有限公司