肝星狀細胞前體及其分離方法

專利名稱：：肝星狀細胞前體及其分離方法
技術領域：
：本發明一般涉及構成成體肝的細胞的前體。具體說，本發明涉及肝星狀細胞的前體細胞、包含所述前體細胞的組合物以及分離所述前體細胞的方法。
背景技術：
：肝星狀細胞(HpStC)在19世紀首次由Kupffer描述，并因為它們在顯微鏡下觀察時"形狀"閃耀而命名為〃Sternellen〃。HpStC是在狄氏間隙中發現的肝特異性間質細胞，并大部分組成為含有維生素A的細胞質脂滴。事實上，脂滴促成了伴隨HpStC的"閃耀"性質。現在認為HpStC在維生素A化合物的攝取、貯存和釋放中起主要作用，這特別對視力、生殖和胚胎發育是必要的。哺乳動物中，約50至80%的全身維生素A正常貯存于HpStC中。HpStC在肝中細胞因子、細胞外基質組分(ECM)和基質金屬蛋白酶的生成中也起重要作用。許多報道證明，HpStC分泌幾種干細胞的分裂素一例如EGF、TGF和HGF—并在肝發育和再生中起重要作用。類似地，許多研究證明，ECM調節失衡是肝纖維化或肝硬化的因素。而且，HpStC的收縮性表明，它們對周細胞具有類似功能，控制血管中局部流速。總之，HpStC的這些種種功能說明它們在健康和失調的肝功能中的顯著作用。盡管我們日益理解HpStC的重要性，但是HpStC的起源還是未知的。在早期肝發育中，前腸的內胚層細胞產生肝突，肝突依次發育成周圍稱為橫隔的中胚層并形成肝索。雖然一些人推測HpStC祖細胞可衍生自橫隔中的間質細胞，但還沒有從其分離出HpStC，實現免疫選擇和/或表征前體HpStC的表面標志物還有待鑒定。因此，需要明確鑒定HpStC前體的標志物和使所述前體與所述標志物分離的方法。此外，需要體外繁殖HpStC前體細胞的方法。
發明內容發明概述在本發明的一個實施方案中，提供了獲得富集了肝星狀細胞祖細胞的細胞群的方法，該方法包括(a)提供來自哺乳動物組織的細胞的單細胞混懸液；和，以任何順序依次或基本上同時，(b)從單細胞混懸液去除表達Ia類MHC抗原的那些細胞；和(c)從細胞混懸液分離對維生素A熒光呈陽性的那些細胞，以獲得富集了肝星狀細胞祖細胞的細胞群。哺乳動物組織可以是肝、胰腺、腸、肺或骨髓細胞，優選肝。該方法可以進一步包括從細胞混懸液分離對VCAM和/或P3-整聯蛋白呈陽性的那些細胞；從細胞混懸液去除那些表達CD45的細胞；和/或從細胞混懸液分離那些表達結蛋白、巢蛋白、波形蛋白、平滑肌ot-肌動蛋白或其組合的細胞。在一些實施方案中，分離和去除步驟在流式細胞儀中進行。表達I類MHC抗原的細胞的去除可以使用抗表達那些抗原的細胞的種特異性抗體進行；例如，使用抗鼠肝細胞中RT1A的抗體。而且，肝星狀祖細胞可以是人類肝星狀細胞祖細胞。在本發明另一方面，提供了獲得富集了分離的肝星狀細胞祖細胞的細胞群的方法，該方法包括(a)獲得肝細胞的細胞混懸液；和(b)以任何順序依次或基本上同時，(i)從肝細胞的單細胞混懸液分離那些對ICAM-1抗原呈陽性的細胞(ii)去除那些對I類MHC抗原呈陽性的細胞，和(iii)分離那些在流式細胞儀中測量的對維生素A熒光呈陽性的細胞，以獲得富集了祖細胞的細胞群。該方法可以進一步包括從細胞混懸液去除那些表達I類MHC抗原、CD45或兩者的細胞，禾口/或從細胞混懸液分離那些表達結蛋白、巢蛋白、波形蛋白、平滑肌a-肌動蛋白或其組合的細胞。在本發明另一個實施方案中，提供了表達VCAM抗原和|33-整聯蛋白抗原的分離的肝星狀前體細胞。而在本發明另一實施方案中，提供了無性擴增星狀前體細胞的方法，該方法包括在無血清培養基中培養表達VCAM抗原和p3-整聯蛋白抗原的分離的星狀前體細胞。所述培養基科進一步包含生長因子，例如胰島素、運鐵蛋白、白血病抑制因子(LIF)或表皮生長因子(EGF)或其組合。分離的星狀前體細胞可以進一步在飼養細胞例如ST0細胞存在下培養。一方面，在詳細解釋本發明至少一個實施方案之前，要理解，本發明的應用不限于下述描述中提出或附圖中圖示的構造的細節和組成部分的布置。本發明包括除了所描述的那些以外的實施方案，并能夠以不同的方式實施和實現。而且，要理解，本文采用的措辭和術語以及摘要，是為描述目的，而不應視為限制性的。因此，本領域技術人員將理解，本公開基于的構思可以容易被利用為用于實現本發明幾個目的的其他結構、方法和系統的設計基礎。因此，重要的是，在不背離本發明精神和范圍的前提下，權利要求被視為包括這樣的等同構造。圖1顯示13dpc大鼠胎兒肝和肺中自熒光細胞的流式細胞檢測分析。(A)整個群(全部)的前向散射(FSC)和側向散射(SSC)的模式。基于SSC值，R1和R2門產生，并分別代表高(SSC"和低(SSC"SSC。還顯示了Rl和R2中RT1A和ICAM-1的表達模式。RT1A—ICAM-1+SSChi細胞(R2，右下)是大鼠胎兒肝中的肝胚細胞(Kubota和Reid，2000)。數字指示每個象限的百分比。(B)整個群(全部)、Rl和R2的自熒光模式用UV激光和488nm激光分析。UV激光特異性自熒光信號用450nm濾波器檢測，而用488nm激光激發的非特異性自熒光信號用530/30帶通濾波器檢測。在Rl和R2(左上)中檢測UV激光特異性自熒光細胞。(C)研究了RT1A和UV激光特異性自熒光信號的表達。UV激光特異性自熒光細胞是RT1A一。ns-autoflu+RTlA—細胞(箭頭)被鑒定，并對應于大鼠肝胚細胞群。(D)UV激光特異性自熒光信號在13dpc胎兒肺細胞中分析。肺細胞群中沒有UV特異性自熒光細胞。所有細胞的大部分是RT1A—，沒有檢測到非特異性自熒光細胞(與胎兒肝中肝胚細胞相當)。圖2顯示vA+細胞上的VCAM-1和ICAM-1表達。(A)對13dpc胎兒肝上VCAM-1表達的流式細胞術的直方圖。大約15%細胞在細胞表面表達VCAM-1。閉合和開放的直方圖分別代表染色的細胞和未染色的細胞。VCAM-l+和VCAM-1—細胞通過流式細胞術分析它們的自熒光信號。全部vA+細胞和ns-autoflu+細胞是VCAM-l陽性。數字代表每個象限的百分比。(B)針對RT1A和ICAM-1的13dpc胎兒肝細胞的兩個顏色分析。Rl細胞群(RT1A—ICAM-l+)含有全部vA+細胞和ns-autoflu+細胞。這些結果表明，vA+和ns-autoflu+細胞是VCAM-1+RT1A-ICAM-l+。圖3顯示了13dpc胎兒肝中vA+、ns-autoflu+和autoflifRT1A—細胞的抗原特征。(A)UV自熒光和RT1A表達的流式細胞檢測分析。在RT1A—細胞群中，產生基于自熒光信號的門(R1-R4)。(B)針對每個門控細胞群(R1-R4)的兩個顏色分析VCAM-1與(33-整聯蛋白、PECAM-1或Thy-l表達。數字表示每個象限的百分比。首選R1細胞是VCAM-1+P3-整聯蛋白+，而R3細胞一致表達VCAM-1，但沒有卩3-整聯蛋白、PECAM-1或Thy-1。圖4顯示了雙潛能肝胚細胞集落的免疫細胞化學。ns-autoflu+VCAM-1+細胞通過FACS分離并以無性系細胞密度(12孔板的每孔中250個細胞；66個細胞/cm"置于HDM中的ST0飼養細胞上。培養15天后，細胞經固定并用抗ALB(紅)和CK19(綠)抗體染色。每個集落從單分選細胞產生(Kubota和Reid，2000)。超過95%(95.7±0.4%;平均值±SEM，n=3)肝集落含有八1^+CK19一和ALB—CK19+細胞，其分別代表肝和膽分化。圖5提供通過FACS分離的14dpc胎兒肝細胞的RT-PCR分析。泳道l，ns-autoflu+RTlA—VCAM-1+卩3-整聯蛋白—；泳道2，vA+RTIA—VCAM-1+(33-整聯蛋白+;泳道3，autoflu一RTIA-VCAM-1+;泳道4，autoflu—RT1A—VCAM-r;泳道5，保留VCAM-r細胞群；泳道6，沒有cDNA。vA+RTIA—VCAM-1+卩3-整聯蛋白+細胞高表達SDF-la和HGF。vA+細胞對HpStC標志物(結蛋白、巢蛋白、波形蛋白、SMaA)呈陽性，而對肝胚細胞標志物(白蛋白和Proxl)呈陰性。圖6顯示LIF和EGF對vA+RTIA—VCAM-1+卩3-整聯蛋白+細胞體內繁殖的影響。(A)通過FACS分離的500個vA+RTIA—VCAM-1+卩3_整聯蛋白+細胞放入96孔板的孔中，含有添加了所示濃度的LIF禾口/或EGF的HDM加層粘連蛋白。5天培養后，細胞繁殖程度通過四唑鹽WST-1測量。低至O.1ng/ml的LIF支持vA+細胞繁殖。EGF略微提高vA+細胞增殖。(B)通過FACS分離的250個RTIA—VCAM-1+卩3-整聯蛋白+vA+細胞接種在含有EGF和/或LIF的HDM中的ST0飼養細胞上。使用了22孔板。在2周培養期后，培養物用Diff-QuickTM染色。盡管STO細胞表達LIF，但是生成的量不足以支持細胞在缺乏外源LIF添加下無性擴增細胞。外源LIF和EGF的添加顯著提高了vA+細胞的無性擴增。圖7顯示衍生自通過FACS分離的vA+RTIA—VCAM-1+(33-整聯蛋白+細胞的集落的免疫細胞化學。細胞置于添加有EGF和LIF的HDM中的STO飼養細胞上。體外培養15天后，培養物用結蛋白或巢蛋白抗體染色。集落生成細胞表達巢蛋白和結蛋白，而ST0細胞不表達任何一個。圖8顯示培養2個月的、通過FACS分離的vA+RTIA—VCAM-1+p3_整聯蛋白+細胞的免疫細胞化學。分選細胞置于添加有EGF和LIF的HDM中的STO詞養細胞上。繁殖細胞在新鮮STO飼養細胞上傳代培養5次。培養的細胞用結蛋白或巢蛋白抗體染色。繁殖細胞在培養期間保持巢蛋白和結蛋白的表達。圖9提供培養2個月的vA+RTIA—VCAM-1+卩3-整聯蛋白+細胞的表型特征。(A)培養的vA+RTIA—VCAM-1+p3-整聯蛋白+細胞的RT-PCR分析。細胞通過FACS分離，并在含有EGF和LIF的HDM中的STO飼養細胞上培養。培養2個月后，細胞通過FACS分選。繁殖的大鼠細胞和小鼠ST0詞養細胞在小鼠CD98單克隆抗體的抗體染色后通過FACS分選。CD98在小鼠STO細胞上表達，單克隆抗體與小鼠CD98但不與大鼠CD98特異性反應。從^+-衍生的大鼠細胞和ST0細胞分離RNA。還使用了正常大鼠HpStC，分離的RNA用作對照。cDNA從那些RNA合成并經受PCR，使用特異性針對HpStC中表達的各種轉錄子的引物。(B)培養的vA+RT1A—VCAM-1+(33-整聯蛋白+細胞的流式細胞術。用于RT-PCR的細胞用抗-VCAM-l或RT1A抗體和小鼠CD98抗體染色。分析CD98陰性組分的VCAM-1或RT1A表達。衍生自大鼠胎兒肝中的vA+細胞的連續繁殖細胞在檢驗培養條件下一致表達VCAM-1和RT1A。具體實施方式發明詳述HpStC已被冠以各種名稱，包括"脂細胞"、"脂肪貯存細胞"、"Ito細胞"、"周竇狀細胞"和"肝周細胞"。但是為了清楚，本文將僅使用術語HpStC，然而其應該被理解為指具有任何或全部前述替代名稱的相同的細胞群。而且，本文的教導不限于任何一種。事實上，應該理解，本文提供的實例僅是示例性的，而不應該解釋為限制性的。以這種方式，本發明不受肝組織的哺乳動物來源的限制。可以衍生HpStC及其前體的哺乳動物包括但不限于人、嚙齒動物(例如，大鼠、小鼠、倉鼠)、兔、牛、馬、豬和綿羊。優選地，HpStC及其前體衍生自人。本發明也不限于肝發育的任何特定階段。因此，本發明可以使用胎兒、新生兒、小兒和/或成體肝組織來實施，包括剛死去的個體的肝組織(例如，少于死后約30小時)。本發明提供了用于分離和繁殖HpStC前體細胞(本文還稱為"HpStC前體"或"前體HpStC")的技術。大鼠胎兒肝中的HpStC前體通過使用細胞質vA富集液滴產生的特異性自熒光的流式細胞術來鑒定。vA+細胞的表面表型表現為是一致的，并且它們是RT1A—ICAM-1+￥0八皿-1+|33-整聯蛋白+PECAM-r。除了這些表面標志物，vA+細胞表達特異性針對HpStC的中間絲，包括結蛋白、波形蛋白、SMcxA和巢蛋白。盡管胎兒肝細胞上ICAM-1表達是廣泛的，但(33-整聯蛋白在vA+細胞上是相對特異性的。(33-整聯蛋白需要ot-整聯蛋白、ocv-整聯蛋白或aII-整聯蛋白用于表面表達。選擇隨細胞類型而不同。在成體肝中HpStC的情況下，av-整聯蛋白用于a-鏈。因此，HpStC前體可能表達av-整聯蛋白。有趣的是，在成體HpStC上表達的av(33-整聯蛋白與ECM配體的相互作用似乎影響HpStC的命運確定、繁殖或凋亡。cxv(33-整聯蛋白轉導刺激信號以保護成體HpStC中的凋亡反應。此外，另一報道顯示，av(33-整聯蛋白結合PECAM-1。因此，不限于或束縛于理論，HpStC前體上的(33-整聯蛋白似乎對接收來自周圍ECM配體或內皮細胞的刺激信號而言是重要的，所述細胞表達PECAM-1，為胎兒肝發育過程中的繁殖。雖然FACS分析表明在胎兒肝中肝胚細胞和HpStC前體上檢測到了VCAM-1高表達，但是后者可能對造血細胞起更重要的作用，因為它們還表達SDF-la。SDF-la是造血干細胞的有效化學誘導物，所述細胞表達SDF-la的受體CXCR4。趨化因子在造血干/祖細胞遷移至骨髓的過程中起重要作用，并被認為上調對VCAM-1的VLA-4依賴性粘附。因此，SDF-la和VCAM-1在HpStC前體上的表達可能對募集造血干/袓細胞進入胎兒肝中是關鍵的。有趣的是，VCAM-1在肝胚細胞上表達。除了表面表型和mRNA表達外，肝胚細胞的體外CFA證明，VCAM-1+細胞是肝胚細胞。該發現是意想不到的，因為認為VCAM-1是間質細胞例如內皮細胞、生肌細胞或HpStC的表面標志物。表達似乎是發育上受控的，因為通過FACS分析，成體肝細胞是VCAM-1-。HpStC前體對于肝發育而言似乎是重要的，因為它們是胎兒肝中的主要HGF生產者。HGF是肝發育的關鍵生長因子，該因子還負責肝再生中肝實質細胞生長。此外，己經顯示，HpStC而非實質細胞、內皮細胞和Kupffer細胞，在成體肝中表達HGF。因此，我們的數據和之前的研究表明，HpStC是從胎兒到成體的肝中主要的HGF生產者。因此，HpStC前體可能對胎兒肝的肝和造血發育起重要作用，因為該細胞是HGF和SDF-la的主要前體。考慮HpStC前體的獨特表型和功能特征，包括VCAM-1和Hlx的表達以及HGF和SDF-la的生成，前體可能由肝中造血干細胞或肝干細胞或兩者的干細胞生態位組成。因為無血漿培養系統保持HpStC前體在體外的獨特特征表型，培養系統可以用于開發體外集落分析系統以從成體肝鑒定HpStC前體。此外，如果HpStC移植系統被開發，使用HpStC前體的細胞療法將是可行的。成體肝中的HpStC前體或HpStC祖細胞的鑒定、體外擴增和移植將是替換纖維生成肝中活化HpStC的有價值的來源。清楚地，本研究中描述的HpStC前體的表型鑒定和體外培養系統證明了開發新型肝疾病治療方法的新方向。下述實施例是本發明的示例，但本發明決不限于這些具體實施例。本領域普通技術人員將在這些實施例中發現實現本發明的一種方式。而且，雖然本實施例為實驗方便而以大鼠環境提出，但是本領域普通技術人員根據下文公開的教導可容易地將本文描述的方法和試劑轉變為人類應用。材料和方法大鼠懷孕的Fisher344大鼠獲自CharlesRiverBreedingLaboratory(Wilmington,MA)。觀察到塞子的早上指定為第0天。雄性Fisher344大鼠(200_250g)用于分離成體HpStC。所有動物實驗根據制度指導方針進行，北卡羅來納大學動物護理和使用制度委員會根據國家科學院的實驗室動物護理和使用指南批準了所有實驗程序。細胞制備根據本發明適合體外繁殖的肝祖細胞不限于通過任何特定方法分離或鑒定的那些。通常，HpStC前體可以從任何離體肝切片獲得。然后，離體肝切片可通過標準程序離解成單離解細胞。這樣的程序包括酶離解和/或機械離解。酶離解可以在蛋白酶存在下進行，所述蛋白酶例如膠原酶和/或核酸酶，例如DNA酶。在一些情況下，也可以使用鏈酶蛋白酶。現有技術描述和實施酶解肝細胞的方法。僅作為例子，分離和鑒定肝祖細胞的方法已經描述于例如美國專利第6,069,005號和美國專利申請第09/487,318;10/135,700和10/387，547號，其公開內容通過引用整體結合入本文。實際上，存在用于消化和分離肝細胞的單細胞混懸液的各種程序。因此要理解，本發明范圍不限于獲得完整肝或制備其單細胞混懸液的特定方法。在本實施例中，胎兒肝從1314dpc大鼠分離并用800U/ml膠原酶(Sigma)消化，隨后用胰蛋白酶-EDTA溶液(Sigma)進一步消化。細胞混懸液用200U/mlDNA酶I(Sigma)處理(Kubota和Reid，2000)。細胞培養物在優選實施方案中，體外繁殖步驟包括使用無血清、添加激素的確定培養基(HDM)來支持HpStC前體細胞在飼養細胞層上的繁殖。飼養細胞的功能是多方面的，包括提供營養、提供附著表面和向培養基分泌某些前體HpStC生存、生長和/或分化所需的生長因子和細胞外基質組分。詞養細胞可以來自爬行動物、鳥、介蟲、魚、環節動物、貝類、線蟲、昆蟲或哺乳動物，優選人。更優選地，飼養細胞衍生自胚胎組織，更優選胚胎肝組織。胎兒肝細胞在ST0飼養細胞上和前述無血清激素確定培養基中培養(Kubota和Reid，2000)。■由Dulbecco改良Eagle培養基和Ham'sF12(DMEM/F12，GIBC0/BRL)的1:1混合物組成，其中添加了2mg/ml牛血清白蛋白(Sigma)、5ng/ml胰島素(Sigma)、10—6M地塞米松(Sigma)、10pg/ml鐵飽和的運鐵蛋白(Sigma)、4.4xl(TM煙酰胺(Sigma)、5xl(TM2-巰基乙醇(Sigma)、7.6|aeq/l游離酸、2x10—3M谷酰胺(GIBC0/BRL)、1x10_fiMCuS04、3x10_8MNa2SeO:,和抗生素(青霉素和鏈霉素)。游離酸包括棕櫚酸、棕櫚油酸、硬脂酸、油酸、亞油酸和亞麻酸(都來自Sigma)，各自在100meq/1原液中的摩爾比為31.0:2.8:11.6:13.4:35.6:5.6。ST0飼養細胞如前所述制備(Kubota和Reid，2000)。簡言之，12STO細胞的亞克隆ST05用pEF-Hlx-MClneo轉染。經轉染的克隆ST05Hlx用絲裂霉素C(Sigma)處理，并在12孔板中以2x105細胞每孔的濃度用于飼養細胞。為了分選的vA+細胞的長期培養，細胞在STO飼養細胞上和添加了10ng/ml人白血病抑制因子(LIF;BoehringerMannheim)禾口10ng/ml表皮生長因子(EGF;CollaborativeBiomedicalProduct)的薩中培養。培養基每隔一天更換一次，細胞每周傳代培養至新鮮ST0飼養細胞。集落的免疫細胞化學染色用于培養細胞的染色程序先有描述(Kubota和Reid，2000)。簡言之，培養板在甲醇-丙酮(l:l)中室溫固定2分鐘、沖洗并用20%山羊血清(GIBC0/BRL)在4。C封閉。為了雙標記白蛋白(ALB)和細胞角蛋白(CK)19，培養物用抗大鼠ALB抗體(ICNBiomedicals)和抗細胞角蛋白19(CK19)單克隆抗體(Amersham)、隨后用德克薩斯紅-偶合的抗兔IgG(Vectorlaboratories)和FITC-偶合的抗小鼠IgG(Caltag)孵育。對于巢蛋白或結蛋白表達，細胞用抗巢蛋白抗體(大鼠-401，DevelopmentalStudiesHybridomaBank,TheUniversityof1owa)或抗結蛋白抗體(D33,Dako)、隨后Alexa488-偶合的抗小鼠IgG(MolecularProbes)染色。熒光激活的細胞分選(FACS)細胞通過配有雙Coherent1-90激光的FACStarPlus細胞分選儀(BDBiosciences)進行分析和分選。為了檢測vA-特異性自熒光，細胞在351nm刺激，使用450DF20濾波器(OmegaOpticalInc，Brattleboro,VT)檢測熒光發射。熒光偶合抗體在488nm刺激，通過標準濾波器檢測它們的熒光發射。用于分析大鼠細胞的單克隆抗體是FITC-偶合的抗-RTlA(B5;BDBiosciences)、藻紅蛋白(PE)-偶合的抗大鼠ICAM-l(1A29;BDBiosciences)、抗大鼠VCAM-1(5F10，Babco)、抗大鼠a6卩l-整聯蛋白(mAB-5A，Serotec)、抗大鼠CD44(OX-49，BDBiosciences)、PE-偶合的抗大鼠VCAM-1(MR109;BDBiosciences)、PE-偶合的或生物素-偶合的抗大鼠P3-整聯蛋白(2C9.G2;BDBiosciences)、生物素-偶合的抗大鼠PECAM-1(TLD-3A12;BDBiosciences)、生物素-偶合的抗大鼠Thy-l(0X-7;BDBiosciences)。為了阻斷非特異性抗體結合，細胞用20。/。山羊血清(GIBC0/BRL)、1%硬骨魚明膠(Sigma)和抗大鼠CD32(FqII受體)抗體(D34-485，大鼠BDFcBlock,BDBiosciences)溶液孵育，然后在FACS實驗中進行抗體染色。為了用未偶合抗VCAM-1抗體(5F10)染色，胎兒肝細胞用抗VCAM-1抗體孵育，隨后用生物素-偶合的抗小鼠IgG2a單克隆抗體(R19-15,BDBiosciences)染色。抗生蛋白鏈霉素-Cy-鉻(BDBiosciences)用于檢測生物素-偶合的抗體。為FACS實驗以分離衍生自分選vA+細胞的長期培養細胞，收集培養物中所有細胞并用生物素偶合的抗小鼠CD98(H202-141,BDBiosciences)、隨后抗生蛋白鏈霉素-Cy-鉻染色以分開培養的大鼠細胞和ST0飼養細胞。鼠ST0飼養細胞用抗小鼠CD98抗體輕微染色。因此，CD98-陰性細胞代表大鼠衍生的細胞，并可以使用之前所示FACS容易地區分(Kubota和Reid，2000)。肝胚細胞的集落形成分析(CFA)肝胚細胞的CFA程序之前有描述(Kubota和Reid，2000)。簡言之，分選細胞以500或2500細胞/孔(3.8cm2)置于12孔板中的ST0飼養細胞上(三份重復)，并在HDM中培養1415天，每隔一天更換一次培養基。為了檢驗肝胚細胞的雙潛能分化活性，進行ALB和CK19的雙免疫熒光染色。集落通過Diff-Quick(Baxter)染色以計數每孔的集落。細胞繁殖分析通過FACS分離的vA+細胞以500細胞/孔放入含有HDM的96孔板中(三份重復)，H函添加有終濃度為8pg/ml的層粘連蛋白(CollaborativeBiomedicalProducts)。EGF禾口LJF以指示濃度添加。涂布細胞后5天，沖洗培養物兩次以去除漂浮細胞，并添加含有四唑鹽WST-1(BoehringerMannheim)的新鮮培養基以測量有活力的附著細胞的數目(Kubota和Reid，2000)。4小時后，根據生產商方案測定吸光度。14逆轉錄酶-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)用于PCR的引物序列示于表1。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>FACS分選細胞的RT-PCR程序之前有描述(Kubota等，2002)。簡言之，細胞使用FACStarPlus細胞分選儀分離，通過RNeasy試劑盒(QIAGEN)提取總RNA，進行cDNA合成。cDNA通過寡聚dT開始和AMV逆轉錄酶(SeikagakuAmerica)以20pl反應體積在42。C下從總RNA合成(Kubota等，2002)。PCR使用合成的cDNA以總體積50pl進行，所述50|nl由1iiM各個引物、200pM各dNTP、50mMKCl、1.5mMMgCl2、10mMTrisHC1(pH8.3)禾卩1.25UAmplitaq聚合酶gold(PerkinsElmer)組成。樣品加熱至94。C、3分鐘，隨后擴增26-35個循環94。C-2分鐘、620C—2分鐘、72。C—3分鐘。每個靶基因的擴增數目不同并示于表l。最后一個循環后，最終延伸步驟在72°C進行6分鐘。然后，5|il各個PCR反應通過1%瓊脂糖凝膠電泳分析。從分選細胞的總RNA合成的cDNA被標準化為細胞數目。結果胎兒肝中維生素A+細胞的鑒定一旦單細胞混懸液建立，HpStC前體的分離包括使衍生自肝組織的混合的肝細胞群經歷流式細胞術，并選擇那些表現出細胞質維生素A(vA)富集液滴產生的特異性自熒光的細胞。維生素A在用330-360nm(紫外線，UV)激光的光刺激時特異性生成綠-藍熒光。FACS分析能夠使用UV激光檢測成體HpStC以及前體HpStC的細胞質中維生素A特異性綠-藍熒光(vA+)。圖1A顯示13dpc胎兒肝細胞中自熒光模式。通過使用450nm濾波器檢測UV激光(351nm)剌激的發射光而測量vA特異性藍-綠自熒光信號。為了檢測非UV激光特異性自熒光信號，使用了488nm激光和530/30nm帶通濾波器。整個胎兒肝細胞群以及兩個亞群(圖1A的Rl和R2門)的自熒光信號模式示于圖1B。在整個細胞群的FACS模式中(圖1B全部)，鑒定了兩個具有高自熒光特征的不同亞群。一個具有特異性針對UV光的自熒光信號(圖1B全部，左上)，其在這里被稱為vA+，而對角位于右上象限的細胞指示非特異性自熒光，因為自熒光信號在由488nm激光和UV激光刺激時分別用530nm濾波器和450nm濾波器檢測。具有非特異性自熒光特征的亞群(指定為ns-autoflu+)排他地衍生自SSC，'門(圖1A、R2和圖1B、R2)，而vA+細胞(圖1B，左上)在R1和R2中檢測。圖1C顯示vA—特異性自熒光信號和Ia類MHC表達的模式，其通過FITC偶合的抗RT1A抗體檢測。FACS分析表明，vA+細胞以及ns-autoflu+細胞沒有RT1A表達，因為那兩個群的染色樣品(圖1C，R2)與對照樣品(圖1B,R2)相比沒有改變。此外，FACS分析還表明，肝胚細胞群、RT1A—ICAM-1+SSCft的細胞(圖1AR2，右下)和RTlA_ns-autoflu+細胞(圖1CR2，箭頭)通過該FACS分析是重疊群。為了檢測這些自熒光信號是否特定在胎兒肝中，分離了來自13dpc胎兒的胎兒肺細胞，并通過FACS分析。FACS分析顯示，肺細胞中沒有ns-autoflu+細胞也沒有vA+細胞，表明胎兒肝中的特定亞群的自熒光信號是獨特的表型特征。因為肝祖細胞(g卩，肝胚細胞)已經顯示是大鼠胎兒13dpc肝中的RT1A_0X18<SICAM-l+SSC^細胞，在vA+細胞中分析這些標志物。圖1A顯示13dpc胎兒肝細胞的FACS分析模式，隨后用抗RT1A、大鼠I類MHC和ICAM-1抗體染色。圖1C顯示vA—特異性自熒光信號和RT1A表達模式，其通過FITC-偶合的抗RT1A抗體檢測。FACS分析表明，vA+細胞以及ns-autoflu+細胞沒有RTlA表達，因為這兩個群的染色樣品與對照樣品(圖1B，R2)相比沒有改變(圖1C，R2)。此外，FACS分析表明，肝胚細胞群，RT1A1CAM-1+SSC，勺細胞(圖1A，R2，右下)和RT1A—ns-autoflu+細胞(圖1C，R2，箭頭)是相同的群。這些結果表明，FACS分析能夠檢測早如13dpc的大鼠胎兒肝中的特征vA+細胞，并且vA+細胞是RTlA—ICAM-l+。表達VCAM-1和整聯蛋白[33的維生素A+細胞如上所證明的，vA陽性和Ia類MHC陰性是足以鑒定和分離HpStC的標志物。然而，在一些情況下，基于UV光的UV選擇可能不是希望的，特別是在關心分子(例如，DNA)完整性的情況下。因此，本發明提供了可以附加或替代UV選擇而使用的標志物。HpStC前體可以通過使選擇的細胞群暴露于特異性針對VCAM、更特別VCAM-1的抗體而進一步鑒定。VCAM-1是重要的，因為其已顯示為區分成體肝中的HpStC與肌纖維母細胞的獨特表面標志物。而且，VCAM-1的表達似乎是發育上受控的，因為成體肝細胞對該標志物呈陰性。在胎兒肝細胞中分析VCAM-1表達以考察vA+細胞是否表達VCAM-1。通過FACS分析，13dpc胎兒肝中似乎有約15%細胞是VCAM-1+(圖2A)。接下來確定自熒光和VCAM-1+細胞的RT1A表達的模式。VCAM-1+細胞含有基本上全部vA+細胞以及整個ns-autoflu+細胞群(圖2A)，表明HpStC和肝胚細胞表達VCAM-l。兩個單克隆抗大鼠VCAM-1抗體(5F10和MR109)的FACS分析顯示了相同的VCAM-1表達模式。此外，胎兒肝VCAM-l+細胞是RT1A—ICAM-r細胞，因為圖2B中的Rl門包括VCAM-r細胞群。這些結果表明，胎兒肝VCAM-l+RTlA—ICAM-r細胞由vA+細胞、肝胚細胞和一些非自熒光細胞組成。考察了其他表面抗原以區別兩個自熒光群vA+細胞和肝胚細胞，這兩個群都是VCAM-l+RTlA-ICAM-l+細胞。因為(33-整聯蛋白(CD61)在內皮細胞、血管平滑肌細胞和成體HpStC上表達，進行了VCAM-1與整聯蛋白卩3的二顏色FACS分析。大部分vA+RTIA—細胞表達了(33-整聯蛋白，而ns-autoflu+RTlA—細胞是(33-整聯蛋白—，而WTRT1A—細胞含有一些VCAM-l+p3-整聯蛋白+細胞(圖3B)。AutoflifRT1A—細胞含有一些VCAM-1+p3-整聯蛋白+細胞。剩余的主要群(圖3B，R4)是VCAM-1—并表現為對應于圖2B中的R2細胞群。R4細胞群當它們在塑料皿上培養時包含非附著細胞，表明它們是造血細胞。亞群(20%)組分是(33-整聯蛋白+。還評估了已知為內皮細胞標志物的PECAM-1(CD31)的表達。然而，FACS分析表明，vA+RT1A—細胞和ns-autoflu+RT1A—細胞中PECAM-1表達是可忽略的(圖3B)，而PECAM-1+細胞在autoflifRT1A—和非附著細胞群中檢測(圖3B、R2和R4)。致癌損傷后在成體肝中出現的橢圓形細胞的表面標志物Thy-l(CD90)的表達被進一步評估。FACS分析顯示，ns-autoflu+RT1A-是Thy-r。相反，vA+RT細胞、autoflu—RT1A—細胞和非附著細胞異源表達Thy-1。FACS分析表明，ns-autoflu+RT1A—細胞是CD441。，而vA+RT1A—細胞是CD44_(數據未顯示)。盡管CD44(Pgp-l)在vA+RT1A-細胞和ns-autoflu+RTlA-中表現為分化表達，細胞表面上的表達是弱的。總之，這些數據表明，在所有檢驗的抗體中，卩3-整聯蛋白抗體染色有助于區分vA+RT1A—細胞和ns-autoflu+RTlA-細胞，這兩個群在胎兒肝中都是VCAM-1+ICAM-l+。VCAM-1+整聯蛋白63—非特異性自熒光細胞群僅含有肝胚細胞直至14dpc大鼠的胎兒肝細胞是同種的，具有分化成干細胞和膽上皮細胞的發育潛力，取決于微環境。這些雙潛能祖細胞稱為肝胚細胞。為了檢驗vA+細胞是否具有產生肝細胞譜系的任何潛力，進行了CFA(Kubota和Reid，2000)。四個細胞群通過FACS分離，并接受肝胚細胞的CFA:1)ns-autoflu+RTlAlCAM-1+卩3-整聯蛋白—2)vA+RT1A—VC旭-r3)autoflifRT1A-和4)VCAM-卜非附著細胞。分選細胞組分置于H固中的ST05飼養細胞上，培養15天，用抗白蛋白和CK19抗體分別對肝譜系和膽譜系進行染色。然后，計數所有肝集落。CFA表明，肝集落產生自組l，ns-autoflu+VCAM-1+(33-整聯蛋白_細胞(下表2)，證明其他組的分選細胞，包括vA+VCAM-1+卩3-整聯蛋白+細胞，不是肝祖細胞。超過95%的、衍生自組1分選細胞的肝集落含有肝(白蛋白+CK19—)和膽上皮(白蛋白—CK19+)細胞兩者(圖4)。而且，分選ns-autoflu+VCAM-1+卩3-整聯蛋白—細胞的集落形成效率為大約31%，之前研究(Kubota和Reid，2000)中建立的肝祖細胞細胞系(rhel4321)的CFA集落效率為42.5±1.8%。總結，該實驗中的CFA結果表明，ns-autoflu+VCAM-1+(33-整聯蛋白_細胞群是幾乎純的肝胚細胞群，因為已有細胞系的CFA大概比新分離的細胞高得多。表2:提供了來自分選嚙齒胎兒肝細胞的肝星狀集落的頻率。產生了如圖3的R1、R2、R3和R4分別所示的vA+RTlA—VCAM-l+、autoflu—RT1A\ns-autoflu+RTlA—和VCAM-1—細胞的分選門。細胞群vA+RT1A—VCAM-1+P3-整聯蛋白+~^autoflu—RT1A—ns-autoflu+RT1A—VCAM-1+03-整聯蛋白-§VC扁-1-卞接種的細肝集落數目集落效率胞數目_^_2500(6)~~3.3±0.9~~0.1±0.02500(6)5.5±0.20.2±0.1250(6)77.0±6.730.8±2.72500(3)0.0±0.00.0±0.01:分選了來自R2的VCAM-1+|33-整聯蛋白+細胞§:分選了來自Rl的VCAM-1+卩3-整聯蛋白-細胞卞分選了來自R4的VCAM-r細胞流式細胞術分選細胞以每孔指定細胞數目在12孔板中ST0詞養細胞上培養。肝集落數目是每孔平均數。集落效率表示為培養中接種的并在15天培養后持續形成集落的細胞的百分比。值是平均值土SEM。總孔接種分選細胞數目包括在括號中。新分離的維生素〃VCAM-1+整聯蛋白(33+細胞的基因表達接下來分析vA+RTIA—VCAM-1+閃-整聯蛋白+細胞的基因表達模式以檢驗它們是否表達HpStC的各種標志物。通過FACS分離了五個群，從這五個群分離RNA。使用從RNA合成的cDNA進行HpStC標志物的RT-PCR。這五個群是1)ns-autoflu+RTIA—VCAM-1+P3-整聯蛋白—，2)vA+RTIA—VCAM-1+(33-整聯蛋白+，3)autoflu—RTIA—VCAM-1+:4)autoflu一RTIA—VCAM-1—，和5)VCAM-1_非附著細胞群。成體肝中的HpStC表達中間絲、結蛋白和巢蛋白，其不在肝中其他細胞類型中表達。RT-PCR分析顯示，vA+RTIA—VCAM-1+(33-整聯蛋白+、ns-autoflu+RT1A_VCAM-1+和autoflifVCAM-1—細胞表達了所有四個中間絲。ns-autoflu+RTlAlCAM-r細胞表達白蛋白以及Proxl，其是在肝胚細胞中特異性表達的轉錄因子。該結果與CFA分析獲得的數據一致，其證明該群包含肝胚細胞。肝胚群中沒有表達巢蛋白、SMaA或波形蛋白。HpStC特異性中間絲的表達強力表明vA+細胞是HpStC前體。隨后，使用RT-PCR考察了三個單獨的間質細胞標志物HGF、間質細胞衍生的因子-lot(SDF-la)和分歧同源異形盒轉錄因子Hlx的表達。HGF是正常肝發育、特別是小鼠中肝胚細胞的繁殖和分化所需的，在成體肝中，HpStC是主要的HGF生產者。SDF-la是造血祖細胞的有效趨化因子，胎兒肝中的造血干細胞相應該趨化因子而遷移。Hlx在發育胎兒肝的間質細胞中表達，并在胎兒肝造血和肝發育中起不可缺少的作用。有趣的是，在所有被檢驗的細胞中，vA+RTIA—VCAM-1+(33-整聯蛋白+細胞表達HGF、SDF-la和Hlx轉錄子最強烈(圖5)。總結，vA+RTIA—VCAM-1+|33-整聯蛋白+細胞是結蛋白+巢蛋白+SMaA+波形蛋白+Hlx+，并且是胎兒肝中HGF和SDF-la的主要生產者。RT1A—VCAM-1+[33-整聯蛋白+vA+細胞的體外無性擴增從成體肝分離的HpStC在體外僅具有有限的繁殖活性。考察了胎兒肝中vA+RT1A—VCAM-1+卩3-整聯蛋白+細胞的體外生長能力，因為HpStC前體可能具有廣泛的繁殖活性。LIF是許多不同類型的細胞的多效生長因子，所述細胞包括胚胎干細胞或肌性細胞。當通過FACS分離的vA+RTIA—VCAM-1+閃-整聯蛋白+細胞用激素確定的無血清培養基以500細胞/孔的密度在LIF存在下于96孔板培養5天時，細胞以劑量依賴方式擴增(圖6A)。此外，各種細胞類型(包括神經干細胞)的生長因子EGF增強了LIF誘導的HpStC前體的繁殖，但是沒有支持其自身的擴增(圖6A)。但是，繁殖沒有在單獨使用塑料培養板的條件下持續。因此，FACS-分選的vA+RT1A1CAM-1+p3-整聯蛋白+細胞接下來置于ST05飼養細胞上(Kubota和Reid，2000)。盡管LIF由ST0細胞生成，但外源LIF和EGF補充進一步支持了從分選的vA+RT1A—VCAM-1+(33-整聯蛋白+細胞顯著地形成集落(圖6B)。培養中的繁殖細胞表達了結蛋白和巢蛋白，而ST05飼養細胞沒有表達任一個(圖7)。三個單集落被挑選并置于新鮮ST05飼養細胞上。單集落衍生的細胞在與添加了LIF和EGF的ST05詞養細胞共培養中繼續繁殖2個月，表明它們具有廣泛的生長潛力。結蛋白和巢蛋白的表達保持在繁殖細胞中(圖8)。為了進一步比較2個月培養的細胞與新分離的vA+RTIA—VCAM-1+(33-整聯蛋白+細胞的特征表型，進行了RT-PCR。培養中維持2個月的單集落衍生的細胞(A428-3)通過FACS從ST05飼養細胞分離，提取RNA用于RT-PCR分析。從同時分選的ST05飼養細胞分離的RNA用作對照樣品。此外，從成體HpStC分離RNA以與來自A428-3和ST05細胞的RNA比較。結果證明，A428-3表達了結蛋白、巢蛋白、SMaA、波形蛋白、卩3-整聯蛋白、SDF-louHGF和Hlx，表明表達模式類似于新鮮vA+RTIA—VCAM-l+(33-整聯蛋白+細胞(圖5和圖9A)。而且，VCAM-1表達通過FACS分析確認(圖9B)。RT1A表達似乎在體內培養中誘導(圖9B)。成體HpStC的RT-PCR結果與之前報道相符，其中正常成體HpStC的表型是結蛋白+、膠質纖維酸性蛋白(GFAP)+、HGF+、但SMaAw—。結果還顯示，成體HpStC表達SDF-lou卩3-整聯蛋白和Hlx。A428-3細胞中不表達GFAP(圖9A)，胎兒肝中不表達任何測試組分。但是，本發明提供了可以與前述標志物一起使用以鑒定HpStC前體細胞的其他標志物，包括例如p3-整聯蛋白+PECAM-rVLA-6+和CD44HICAM-1和(33-整聯蛋白還表達在成熟HpStC上。除了那些表面標志物外，成熟和前體HpStC表達特異性針對HpStC的中間絲，包括結蛋白、波形蛋白、平滑肌a-肌動蛋白和巢蛋白。在該研究中，A428-3細胞中沒有可檢測的GFAP表達(圖9A)，胎兒肝GFAP中沒有任何測試組分。盡管GFAP是用于鑒定中樞神經系統中星狀細胞的標志物，但是該蛋白質還表達于成體肝的HpStC中。但是，我們沒有通過RT-PCR在所檢驗的任何細胞組分以及整個胎兒肝樣品中發現GFAPm腦A。此外，甚至在培養分離的HpStC前體后，沒有誘導GFAP表達，而培養物中保持了結蛋白和巢蛋白表達。該結果表明，胎兒肝的HpStC前體將在后來的發育階段獲得GFAP表達。但是，我們不能排除另一種可能，其中GFAP+細胞衍生自不存在于13dpc胎兒肝中的不同前體。血流中的循環細胞可以是替代細胞起源的來源。但是，成體肝中的大部分HpStC表達GFAP;因此，血液循環細胞的較小貢獻不可能成為肝中的優勢群。因此，更可能的是，GFAP表達的獲得發生在HpStC成熟過程中。數據還表明，HpStC前體相對強地表達分歧同源異形盒蛋白Hlx。盡管Hlx表達與HpStC發育之間的關系不清楚，但是Hlx表達的損失可能促進變異小鼠的缺陷。小鼠胎兒肝的HpStC前體還表達HGF、SDF-l和Hlx。除了HpStC前體的獨特表面表型外，該研究中建立的培養系統可以用于鑒定成體肝的HpStC前體。直到現在，成體肝的HpStC已經在添加有胎兒牛血清的培養基中培養。正常而言，添加血清的培養基中培養的HpStC產生成肌纖維細胞，其獲得了成纖維特征但失去了原始的HpStC表型。因此，添加血清的培養基條件不適合鑒定HpStC前體。該研究中描述的無血清培養條件支持HpStC祖細胞的體外保持。HpStC前體似乎在肝發育中起關鍵作用，因為它們表達比所檢驗的胎兒肝細胞組分中任何亞群更多的HGF轉錄子。HGF是肝發育的關鍵生長因子(Schmidt等，1995)，并且該因子還負責肝再生過程中肝實質細胞生長(Michalopoulos和DeFr塞es，1997)。此外，已經顯示，HpStC而非實質細胞、內皮細胞或Kupffer細胞，是成體肝中HGF的生產者(Schirmacher等，1992)。因此，我們的數據和之前研究的數據表明，HpStC是從胎兒到成體肝中主要的HGF生產者。該研究中，13dpc胎兒肝中無GFAP表達。盡管GFAP是用于鑒定中樞神經系統星狀細胞的標志物，但是蛋白質也在成體肝的HpStC中表達。但是，我們沒有通過RT-PCR在所檢驗的任何細胞組分以及整個胎兒肝樣品中發現GFAPmRNA。此外，甚至在培養分離的HpStC前體后，沒有誘導GFAP表達，而培養物中保持了結蛋白和巢蛋白表達。該結果表明，胎兒肝的HpStC前體將在后來的發育階段獲得GFAP表達。但是，我們不能排除另一種可能，其中GFAP+細胞衍生自不存在于13dpc胎兒肝中的不同前體。血流中的循環細胞可以是替代細胞起源的來源。但是，成體肝中的大部分HpStC表達GFAP;因此，血液循環細胞的較小貢獻不可能成為肝中的優勢群。因此，更可能的是，GFAP表達的獲得發生在HpStC成熟過程中。分歧同源異形盒蛋白Hlx表達于胎兒肝的橫隔和間質細胞中(Lints等，1996)。Hlx敲除小鼠的之前研究證明，突變小鼠具有受損的肝發育和胎兒肝造血(Hentsch等，1996)。移植實驗表明，造血缺陷是由胎兒肝微環境引起的，而不是由造血祖細胞本身引起的。因此，Hlx+細胞是胎兒肝中支持肝和造血發育的關鍵細胞群。我們的數據表明，HpStC前體高表達了Hlx。因此，感興趣的是檢查Hlx敲除小鼠是否具有HpStC前體。盡管Hlx表達與HpStC發育之間的關系不清楚，但是Hlx表達的損失可能促進變異小鼠的缺陷。最近我們發現，小鼠胎兒肝中類似的HpStC前體還表達HGF、SDF-la和Hlx。而且，本發明人已經在人類胎兒肝中鑒定了具有類似標志物(例如，平滑肌(x-肌動蛋白)并且已經證明對人肝干細胞的體外擴增至關重要的間質細胞。通過FACS純化的HpStC前體在ST0飼養細胞和添加了脂質、胰島素、運鐵蛋白、EGF和LIF的無血清培養基條件下繁殖。我們的數據表明，LIF對于體內繁殖更有益。在ST0詞養細胞支持下，HpStC前體持續復制超過2個月。培養的細胞表達了VCAM-1、(3-(33-整聯蛋白、結蛋白、波形蛋白、平滑肌(x-肌動蛋白、巢蛋白、HGF和SDF-la。這些新鮮HpStC前體表型沒有在體外培養過程中改變。除了HpStC前體的獨特表面表型外，該研究中建立的培養系統可用于鑒定成體肝中的HpStC前體。直到現在，成體肝的HpStC已經在添加有胎兒牛血清的培養基中培養。正常而言，添加血清的培養基中培養的HpStC產生成肌纖維細胞，其獲得了成纖維特征但失去了原始的HpStC表型。因此，添加血清的培養基條件不適合鑒定HpStC前體。該研究中描述的無血清培養條件支持HpStC祖細胞的體外保持。如果成體肝中存在HpStC前體，則它們將是替換纖維生成肝中活化HpStC的有價值的資源。HpStC前體的表型鑒定和體外培養系統將有利于新型肝疾病治療方法的開發。雖然已經結合其具體實施方案描述了本發明，但要理解其能夠進一步改變，本申請是要涵蓋下述發明的任何變性、用途或改變。大體上，本發明原理包括如下從本公開的偏離落入本發明所述領域已知或常規實踐，可以適用于上文所提出的必要特征，落入所附權利要求范圍內。權利要求1.一種獲得富集了肝星狀細胞祖細胞的細胞群的方法，該方法包括(a)提供來自哺乳動物組織細胞的單細胞混懸液；并以任何順序依次或基本上同時，(b)從所述單細胞混懸液去除那些表達Ia類MHC抗原的細胞；并(c)從細胞混懸液分離那些對維生素A熒光呈陽性的細胞，以獲得富集了肝星狀細胞祖細胞的細胞群。2.權利要求1的方法，其中所述哺乳動物組織是肝、胰腺、腸、肺或骨髓細胞。3.權利要求1的方法，其進一步包括以任何順序依次或基本上同時(d)分離那些對VCAM呈陽性的細胞。4.權利要求1的方法，其進一步包括去除那些表達CD45的細胞。5.權利要求1的方法，其進一步包括以任何順序依次或基本上同時(d)分離那些對VCAM抗原和(33-整聯蛋白呈陽性的細胞。6.權利要求1的方法，其進一步包括以任何順序依次或基本上同時，(e)從所述細胞混懸液分離那些表達結蛋白、巢蛋白、波形蛋白、平滑肌a-肌動蛋白或其組合的細胞。7.權利要求1的方法，其中所述分離和去除步驟使用流式細胞儀進行。8.權利要求2的方法，其中所述哺乳動物組織是肝組織。9.權利要求1的方法，其中所述肝星狀祖細胞是人肝星狀細胞祖細胞。10.—種獲得富集了分離的肝星狀細胞祖細胞的細胞群的方法，該方法包括(a)獲得肝細胞的細胞混懸液；和(b)以任何順序依次或基本上同時，(i)從肝細胞的單細胞混懸液分離那些對ICAM-1抗原呈陽性的細胞(ii)去除那些對I類MHC抗原呈陽性的細胞，和(iii)分離那些在流式細胞儀中測量的對維生素A熒光呈陽性的細胞，以獲得富集了祖細胞的細胞群。11.權利要求10的方法，其進一步包括以任何順序依次或基本上同時，(C)從細胞混懸液分離那些表達結蛋白、巢蛋白、波形蛋白、平滑肌a-肌動蛋白或其組合的細胞。12.權利要求10的方法，其中所述分離和去除步驟使用流式細胞儀進行。13.權利要求10的方法，其中那些表達I類MHC抗原的細胞的去除使用抗體進行。14.權利要求10的方法，其中所述肝星狀祖細胞是人肝星狀細胞祖細胞。15.—種分離的肝星狀前體細胞，其表達VCAM抗原和(33-整聯蛋白抗原。16.—種無性擴增星狀前體細胞的方法，該方法包括在無血清培養基中培養表達VCAM抗原和(33-整聯蛋白抗原的分離的星狀前體細胞。17.權利要求16的方法，其中所述培養基進一步包含生長因子。18.權利要求16的方法，其中所述生長因子是胰島素、運鐵蛋白、LIF或EGF或其組合。19.權利要求16的方法，其中所述分離的星狀前體細胞進一步在飼養細胞存在下培養。20.權利要求19的方法，其中所述飼養細胞是STO細胞。全文摘要本發明涉及肝星狀細胞的前體細胞、包含所述前體細胞的組合物以及分離所述前體細胞的方法。所述前體的表面抗原特征是Ia類MHC陰性、ICAM-1⁺、VCAM-1⁺、β3-整聯蛋白⁺。除了這些表面標志物的表達外，細胞還表達細胞內標志物結蛋白、波形蛋白、平滑肌α-肌動蛋白、巢蛋白、肝細胞生長因子、間質衍生因子-1α和Hlx同源異形框轉錄因子。文檔編號C12N5/02GK101553564SQ200780026863公開日2009年10月7日申請日期2007年5月24日優先權日2006年5月26日發明者H·庫伯塔,洛拉·M·里德申請人:北卡羅來納大學教堂山分校