專利名稱：人源肝星狀細胞激活相關蛋白治療肝臟疾病的用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物醫藥領域，具體涉及一種人源肝星狀細胞激活相關蛋白的醫藥用途，即其可以用于治療肝臟疾病的用途。
背景技術：
肝星狀細胞激活相關蛋白(Stellate cell activation-associated protein STAP)是在大鼠肝臟蛋白質組學研究中發現的，與肝星狀細胞(hepatic stellate cell，HSC)激活密切相關的蛋白。在HSC激活過程中它有明顯的上調表達(見Biol Chem.2001，276(27)25318-25323)。通過同源比對，在人的肝臟基因組中又發現了人源肝星狀細胞激活相關蛋白(human Stellate cell activation-associated protein hSTAP)，其核苷酸序列參見GENEBANK中的AB057769。免疫組化研究顯示，hSTAP的mRNA在人的腦、心臟、肝臟、腎臟等組織細胞中都有不同程度的表達(見Biochim Biophys Acta.2002，1577471-475)。但hSTAP的治療功能未見文獻報道。
目前認為，HSC在肝纖維化發生發展中起主導作用。正常肝臟中HSC處于靜息狀態，增殖活性很低，肝損傷及各種慢性肝病時HSC被激活，表型發生改變由靜息細胞轉變為移行細胞，然后轉分化肌成纖維樣母細胞，合成和分泌細胞外基質(ECM)上調，同時合成和釋放大量基質金屬蛋白酶抑制因子(TIMPs)，使間質膠原酶等蛋白酶活性降低，ECM降解減少，最終導致ECM積聚而發生肝纖維化乃至肝硬化。肝星狀細胞活化是肝纖維化形成的關鍵。
國內外學者對肝纖維化的可逆性已無異議。鑒于HSC在肝纖維化發病機制中的主導作用，大多數抗肝纖維化研究都以HSC為靶標。通過對抗氧化應激，抑制炎癥反應，調節相關細胞因子的活性，干擾細胞因子信號轉導等途徑抑制HSC增殖、活化，誘導HSC凋亡，均可呈現良好的抗肝纖維化效應。
大量基礎和臨床研究都顯示反應性氧(ROS)和細胞膜的脂質過氧化與肝纖維化發生有關，這表明氧應激是不同病因慢性肝病共同的發病因素。有研究從基因水平證實脂質過氧化可刺激HSC合成I型膠原，而且細胞色素P450 2E1來源的氧化物可促進HSC的增殖和膠原的合成。最近有研究表明，黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶系統產生的ROS能促進HSC的增殖，此促進作用與基質金屬蛋白酶-2(MMP-2)的激活和表達有關，而且在大鼠肺和皮膚成纖維細胞以及心肌成纖維細胞中也發現氧應激可調節MMP-2的表達。由此認為，氧應激和脂質過氧化可通過不同的機制促進HSC的增殖。
發明內容
發明人對hSTAP進行了重組表達，建立了rhSTAP的制備方法，鑒定了rhSTA的一級結構，研究了rhSTAP的抗氧化活性以及對氧化損傷的肝星狀細胞的保護作用。結果顯示rhSTAP具有抗氧化的生物活性，并且對Fe-NTA造成的肝星狀細胞的氧化損傷具有保護作用，并通過緩解Fe-NTA對肝星狀細胞造成的氧化損傷，抑制了肝星狀細胞的氧化應激反應，從而抑制了HSC的活化。因此，它具有防治肝臟疾病的功能，特別可用于防治肝硬化和肝纖維化。
本發明通過RT-RCP的方法獲得hSTAP的cDNA；選擇合適的載體，高效表達重組人源肝星狀細胞激活相關蛋白(recombinant human Stellate cell activation-associated proteinrhSTAP)；建立rhSTAP分離、純化、復性的方法；研究rhSTAP的生物活性及對氧化應激的肝星狀細胞的保護作用。
hSTAP cDNA的獲取方法，其步驟是1、設計PCR引物primer 1(5’-GTCCATGGAGAAAGTGCCAGGCGAGA，NcoI site is underlined)and primer 2(5’-CTAAGCTTCTACGGCCCCGAAAGGG，HindIII site is underlined)；2、提取Hep G2細胞的總RNA，利用RT-PCR的方法，獲得rhSTAP的cDNA，見圖1；3、PCR條件(94℃1分鐘；60℃；1分鐘；72℃1分鐘；30個循環)。
rhSTAP高效表達方法的建立，其步驟是1、將hSTAP cDNA經過NcoI、HindIII酶切，克隆到載體pET-28a的表達區，構建載體pET-28a-hSTAP；2、轉化到宿主菌Escherichia coli BL21(DE3)中進行表達。
3、搖瓶篩選表達水平最高的菌株保存菌種。
4、利用5L自動發酵罐進行表達，LB培養基，接種量1％，溶氧量30％，()D達到0.6添加IPTG(作用濃度1mM/L)，培養6h，離心收集菌體，SDS-PAGE電泳檢測表達水平，見圖2。
結果顯示rhSTAP獲得了高效的表達，占菌體總蛋白的30％以上。
rhSTAP的制備方法，其步驟是1、rhSTAP以包含體的方式存在。在4℃，5000rpm離心15min收集菌體，然后重懸于緩沖液I中(20mM Tris-HCl pH8.0，500mM NaCl and 0.1％ Triton X-100)；2、菌體利用超聲波進行破碎，4℃，15000rpm離心15min收集包含體沉淀；
3、包含體用緩沖液I重懸、洗滌3次；4、然后用溶解液(20mM Tris-HCl pH8.0，150mM NaCl，20mM DTT，8M urea)溶解6小時以上；4℃，15000rpm離心15min收集上清液；5、將上清液在Sephadex G-25層析柱中復性與純化，上柱量小于10％柱床體積，用緩沖液II(20mM Tris-HCl，pH8.0)進行洗脫，流速8cm/h；6、UV280nm紫外檢測，收集第一個洗脫峰；7、洗脫液經SDS-PAGE檢測，保存于4℃(一周以內)或凍干保存。
8、檢測復性后的rhSTAP的生物穩定性見表1表1.復性后rhSTAP穩定性的檢驗
結果顯示，采用該制備方法，rhSTAP的收率可以達到100mg/L培養基，純度大于90％，復性后具有生物活性且性質穩定。
rhSTAP一級結構的鑒定方法，其步驟是1、復性后的rhSTAP利用Resource RPC柱(Global)進行反向質譜純化，流動相為A液(2％乙腈，0.05％三氟乙酸)、B液(98％乙腈，0.05％三氟乙酸)，利用質譜儀AKTA explorer(Pharmacia Biotech)進行洗脫、收集和結果分析，見圖3。
2、rhSTAP的分子量利用MALDI-TOF-MS(matrix-assisted laser desorption ionizationtime of flight mass spectrometry)檢測，見圖4。
3、rhSTAP的N-terminal氨基酸序列利用儀器Protein N-terminal Sequencer(ABI491LCPE).用HPLC的方法檢測，見圖5。
4、rhSTAP的C-terminal氨基酸序列利用儀器Protein C-terminal Sequencer(LTQFinnigan)用tandem mass spectrometry的方法檢測，見圖6。
結果顯示，rhSTAP經過RPC純化后，純度大于95％，分子量為21429，N-terminal 10個氨基酸序列為NH2-M-E-K-V-P-G-E-M-E-I，C-terminal 23個氨基酸序列為E-V-G-W-V-Q-Q-V-P-N-A-T-T-P-P-A-T-L-P-S-S-G-P，均與理論值吻合。
本發明公開了rhSTAP具有抗氧化的生物活性及活性檢測方法，其步驟為將復性后的rhSTAP用總抗氧化能力檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所NJBI)檢測。結果見圖7，圖7顯示，rhSTAP具有明顯的抗氧化活性，根據試劑盒的計算方法，抗氧化活性為80.0±3.0U/mg。
本發明研究了rhSTAP的生物活性及對氧化應激的肝星狀細胞的保護作用，見實施例部分。試驗結果表明rhSTAP通過緩解Fe-NTA對HSC造成的氧化損傷，抑制了HSC的氧化應激反應，從而抑制了HSC的活化。具體表現為改善了機體抗氧化損傷防御體系，脂質過氧化程度減輕，膠原蛋白的合成減少。表明rhSTAP具有防治肝硬化及肝纖維化的應用前景。
圖1是hSTAP cDNA的PCR結果(ADNA marker；Lane BhSTAP cDNA)圖2是rhSTAP在Escherichia coli BL21(DE3)中的表達(A蛋白質分子量Marker；B菌體總蛋白；C菌體超聲波破碎后，離心分離得到的可溶性蛋白；D經過Sephadex G-25層析柱復性、純化后的rhSTAP)圖3是rhSTAP利用質譜純化后的結果圖4是rhSTAP分子量的測定圖5是rhSTAP N-terminal氨基酸序列的測定結果圖6是rhSTAP C-terminal氨基酸序列的測定結果圖7是rhSTAP抗氧化活性的檢測具體實施方式
實施例1MDA是脂質過氧化的重要終產物之一，反映了機體細胞受自由基攻擊的嚴重程度，可促進I型膠原mRNA的表達，與HSC增殖和膠原合成密切相關；SOD是機體抗氧化損傷防御體系中最重要的抗氧化酶之一，反映了機體清除氧自由基的能力。羥脯氨酸(Hyp)是構成膠原纖維特異的氨基酸成分，膠原纖維主要由膠原蛋白構成，而羥脯氨酸在膠原蛋白的含量較為穩定，約為2.5％，在非膠原蛋白中的含量很低，甚至缺乏，所以羥脯氨酸常被認為是膠原蛋白特有成份，肝組織細胞中Hyp的含量可較準確地反映肝組織膠原纖維含量，因此，測定肝組織細胞中羥脯氨酸含量可間接反映肝細胞纖維化的程度。
具體試驗過程
1、取對數生長期的大鼠的肝星狀細胞，2.5g/L胰酶消化后，用含100mL/L胎牛血清的DMEM配成細胞懸液；2、以105接種于10塊6孔培養板，每孔加入DMEM培養液2ml，置于37℃，50mL/L CO2培養箱中培養過夜；3、24h后細胞貼壁良好，換用含2mL/L胎牛血清的DMEM培養，使其生長同步化。
4、再培養24h后，設立5個組別，第一組為陰性對照，另外4組加入次氮基三乙酸鐵(Fe-NTA，終濃度200μmol/L)，并加入rhSTAP，終濃度分別為0μg/ml(模型組)、5μg/ml(低劑量組)、10μg/ml(中劑量組)、20μg/ml(高劑量組)；5、繼續培養24小時后，采用丙二醛(MDA)試劑盒(NJBI)、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(NJBI)、羥脯氨酸(Hyp)試劑盒(NJBI)分別檢測細胞與培養液中的MDA、SOD、Hyp。實驗結果見表2、3。
表2.rhSTAP對培養基中MDA、SOD、Hyp含量的影響
n＝12，x±s.ap＜0.01，bp＜0.05，與正常組相比；cp＜0.01，dp＜0.05，與模型組相比。
結果顯示1、對比正常HSC組，模型組培養基中MDA、SOD、Hyp的含量有明顯的差異，其中MDA、Hyp的含量升高，SOD的活力單位降低；2、對比模型組，rhSTAP低劑量組培養基中MDA、Hyp的含量變化不明顯，SOD的活力單位有明顯提高；3、對比模型組，rhSTAP中劑量組培養基中MDA、SOD、Hyp的含量有明顯的差異，其中MDA、Hyp的含量降低，SOD的活力單位升高；4、對比模型組，rhSTAP高劑量組培養基中MDA、SOD、Hyp的含量有明顯的差異，其中MDA、Hyp的含量降低，SOD的活力單位升高。
表3.rhSTAP對細胞內MDA、SOD、Hyp含量的影響
n＝12，x±s.ap＜0.01，bp＜0.05，與正常組相比；cp＜0.01，dp＜0.05，與模型組相比。
結果顯示1、對比正常HSC組，模型組細胞內MDA、SOD、Hyp的含量有明顯的差異，其中MDA、Hyp的含量升高，SOD的活力單位降低；2、對比模型組，rhSTAP低劑量組細胞內Hyp、SOD的含量變化不明顯，MDA的含量有明顯降低；3、對比模型組，rhSTAP中劑量組細胞內MDA、SOD、Hyp的含量有明顯的差異，其中MDA、Hyp的含量降低，SOD的活力單位升高；4、對比模型組，rhSTAP高劑量組細胞內MDA、SOD、Hyp的含量有明顯的差異，其中MDA、Hyp的含量降低，SOD的活力單位升高。
結果顯示1、對比正常HSC組，模型組細胞內及培養基中MDA、SOD、Hyp的含量均有明顯的差異，其中MDA、Hyp的含量升高，SOD的活力單位降低；2、對比模型組，rhSTAP低劑量組細胞內及培養基中MDA、SOD、Hyp的含量變化不夠明顯；3、對比模型組，rhSTAP中、高劑量組細胞內及培養基中MDA、SOD、Hyp的含量均有明顯的差異，其中MDA、Hyp的含量降低，SOD的活力單位升高。
結果說明了1、Fe-NTA對HSC造成了明顯的氧化損傷，具體表現為其中MDA、Hyp的含量升高，SOD的活力單位降低。
2、Fe-NTA對HSC造成的氧化損傷，通過氧化應激的機制，引起了HSC的活化，促使HSC從靜息態向活化態的轉化，具體表現為破壞了機體抗氧化損傷防御體系，脂質過氧化程度加重，膠原蛋白的合成增加。
3、rhSTAP可以明顯緩解Fe-NTA對HSC造成的氧化損傷，具體表現為其中MDA、Hyp的含量降低，SOD的活力單位升高。
4、rhSTAP通過緩解Fe-NTA對HSC造成的氧化損傷，抑制了HSC的氧化應激反應，從而抑制了HSC的活化。具體表現為改善了機體抗氧化損傷防御體系，脂質過氧化程度減輕，膠原蛋白的合成減少。
5、rhSTAP對HSC氧化損傷的保護作用有劑量依賴關系。濃度大于或等于10μg/mg，即有明顯的作用。
權利要求
1.人源肝星狀細胞激活相關蛋白或重組人源肝星狀細胞激活相關蛋白用于制備治療肝臟疾病藥物的用途。
2.權利要求1的用途，其中肝臟疾病是肝硬化。
3.權利要求1的用途，其中肝臟疾病是肝纖維化。
全文摘要
本發明涉及生物醫藥領域，具體涉及一種人源肝星狀細胞激活相關蛋白的醫藥用途，即其可以用于制備治療肝臟疾病的藥物的用途。本發明還公開了其重組制備方法。
文檔編號C12N15/70GK101036781SQ20071002056
公開日2007年9月19日 申請日期2007年3月12日 優先權日2007年3月12日
發明者吳梧桐, 魏威 申請人:中國藥科大學