發酵阿拉伯糖的真核細胞的代謝工程改造的制作方法

專利名稱：：發酵阿拉伯糖的真核細胞的代謝工程改造的制作方法
技術領域：
：本發明涉及下述真核細胞和使用該細胞生產發酵產物的工藝，所述細胞具有使用L-阿拉伯糖和/或將L-阿拉伯糖轉化為L-核酮糖和/或5-磷酸木酮糖和/或轉化為期望的發酵產物的能力。
背景技術：
：乙醇染料被認為是化石燃料的有價值的備選方案。從植物生物質的半纖維素級分到乙醇的經濟學可行的生產需要以相當的速率和高產率同時發酵轉化戊糖和己糖這二者。酵母(尤其是Sacc/^rom;;c^^^)是該工藝的最適當的候選者，因為在需氧和厭氧時它們均能夠在己糖上快速生長和發酵。另外，它們對木質纖維素水解產物的毒性環境比(經一般修飾的)細菌有抗性得多。EP1499708描述了制造下述5".cewv&ae菌株的工藝，所述菌株能夠從L-阿拉伯糖生產乙醇。通過引入B戲7/^wto'fo的araA(L-阿拉伯糖異構酶、來自^c/m'c//aco/z'的araB(L-核酮糖激酶)和araD(L-核酮糖-5-P4-差向異構酶)基因來修飾這些菌株。另外，這些菌株基因組中帶有額外的突變，或者過表達TAL1(轉醛酶)基因。然而，這些基因具有若干缺點。它們在氧受限的條件下發酵阿拉伯糖。另外，它們具有0.05g.g".h'1的低乙醇生產速率(BeckerandBoles,2003)。另外，這些菌株不能夠在厭氧條件下使用L-阿拉伯糖。最后，這些5".""W^^菌株具有野生型背景，因此它們不能被用于共同發酵若干種C5糖。WO03/062430和WO06/009434公開了能夠將木糖轉化為乙醇的酵母菌株。這些酵母菌株能夠值直接將木糖異構化為木酮糖。仍然存在對生產乙醇的下述備選菌株的需要，所述菌株運行更好，并且更有活力和對相對苛刻的生產條件更具抗性。圖hpRW231和pRW243的質粒圖譜。圖2:在含0.5M半乳糖(A)和0.1%半乳糖+2%L-阿拉伯糖(B)的合成培養基中，菌株RWB219(o)和IMSOOOl("搖瓶培養的生長模式。培養物在含半乳糖(A)的合成培養基中培養72小時，然后被轉移至含半乳糖和阿拉伯糖(B)的合成培養基。通過測量OD,來測定生長。圖3.S.cewvWaeIMS0001在搖瓶培養物中系列轉移期間的生長速率，所述培養物含有含2M(w/v)L-阿拉伯糖的合成培養基。每個數據點代表從(指數)生長期間測量的OD,評價的生長速率。閉合和開放的圓圈代表一式兩份的系列轉移實驗。圖4.S.cerev&aeIMS0001在含2%(w/v)L-阿拉伯糖的合成培養基中厭氧SBR發酵期間的生長速率。每個數據點代表從指數生長期間的C02譜(實線)評價的生長速率。圖5.菌株IMS0002厭氧分批發酵期間的糖消耗和產物形成。發酵在l升合成培養基中進行，所述培養基補充有20gI—1阿拉伯糖(A);20gr1葡萄糖和20gl"阿拉伯糖(B);30gl"葡萄糖、15gl"木糖和15gl"阿拉伯糖(C)。用菌株IMS0002和RWB218的混合物進行的厭氧分批發酵期間的糖消耗和產物形成。發酵在1升合成培養基中進行，所述培養基補充有30gl"葡萄糖、15gl"木糖和15gl"阿拉伯糖(D)。符號葡萄糖—)；木糖(o);阿拉伯糖—)；從累計的C02生產計算的乙醇(口)；通過HPLC測量的乙醇(A);累計的C02生產(A);木糖醇(T)。圖6.選擇用于在木糖上厭氧生長的菌株IMS0002細胞厭氧分批發酵期間的糖消耗和產物形成。發酵在1升合成培養基中進行，所述培養基補充有20gl"木糖和20gr1阿拉伯糖(B)。符號木糖(o);阿拉伯糖(一；通過HPLC測量的乙醇(A);累計的C02生產(A);木糖醇(T)。圖7.菌株IMS0003厭氧分批發酵期間的糖消耗和產物形成。發酵在1升合成培養基中進行，所述培養基補充有30gl"葡萄糖、15gl"木糖和15g1"阿拉伯糖。符號葡萄糖()；木糖(O);阿拉伯糖(■);從累計的C02生產計算的乙醇(口)；通過HPLC測量的乙醇(A);累計的C02生產(A)。發明詳述真核細胞本發明第一方面涉及能夠表達以下核苷酸序列的真核細胞，其中，這些核苷酸序列的表達賦予細胞使用L-阿拉伯糖和/或將L-阿拉伯糖轉化為L-核酮糖和/或5-磷酸木酮糖和/或轉化為期望的發酵產物如乙醇的能力(a)編碼阿拉伯糖異構酶(^^4)的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列選自由以下組成的組(i)編碼araJ的核苷酸序列，所述"^4包含與SEQIDNO:l的氨基酸序列具有至少55%序列同一性的氨基酸序列，(ii)核苷酸序列，其包含與SEQIDNO:2的核苷酸序列具有至少60%序列同一性的核苷酸序列，(iii)核苷酸序列，其互補鏈與(i)或(ii)的序列的核酸分子雜交，(iv)核苷酸序列，其序列由于遺傳密碼子的簡并性而與(iii)的核酸分子的序列不同；(b)編碼L-核酮糖激酶("m用的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列選自由以下組成的組(0編碼"raS的核苷酸序列，所述ara5包含與SEQIDNO:3的氨基酸序列具有至少20%序列同一性的氨基酸序列，(ii)核苷酸序列，其包含與SEQIDNO:4的核苷酸序列具有至少50%序列同一性的核苷酸序列，(iii)核苷酸序列，其互補鏈與(i)或(ii)的序列的核酸分子雜交，(iv)核苷酸序列，其序列由于遺傳密碼子的簡并性而與(iii)的核酸分子的序列不同；(c)編碼L-核酮糖-5-P-4-差向異構酶("mZ))的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列選自由以下組成的組(i)編碼araZ)的核苷酸序列，所述ara/)包含與SEQIDNO:5的氨基酸序列具有至少60%序列同一性的氨基酸序列，(ii)核苷酸序列，其包含與SEQIDNO:6的核苷酸序列具有至少60%序列同一性的核苷酸序列，(iii)核苷酸序列，其互補鏈與(i)或(ii)的序列的核酸分子雜交，(iv)核苷酸序列，其序列由于遺傳密碼子的簡并性而與(iii)的核酸分子的序列不同。一個優選的實施方案涉及能夠表達以下核苷酸序列的真核細胞，從而這些核苷酸序列的表達賦予細胞使用L-阿拉伯糖和/或將L-阿拉伯糖轉化為L-核酮糖和/或5-磷酸木酮糖和/或轉化為期望的發酵產物如乙醇的能力(a)編碼阿拉伯糖異構酶("nL4)的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列選自由以下組成的組(i).核苷酸序列，其包含與SEQIDNO:2的核苷酸序列具有至少60%序列同一性的核苷酸序列，(ii).核苷酸序列，其互補鏈與(i)的序列的核酸分子雜交，(iii).核苷酸序列，其序列由于遺傳密碼子的簡并性而與(ii)的核酸分子的序列不同；(b)編碼L-核酮糖激酶(am用的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列選自由以下組成的組(i).編碼araS的核苷酸序列，所述araS包含與SEQIDNO:3的氨基酸序列具有至少20%序列同一性的氨基酸序列，(ii).核苷酸序列，其包含與SEQIDNO:4的核苷酸序列具有至少50%序列同一性的核苷酸序列，(iii).核苷酸序列，其互補鏈與(i)或(ii)的序列的核酸分子雜交，(iv).核苷酸序列，其序列由于遺傳密碼子的簡并性而與(iii)的核酸分子的序列不同；(c)編碼L-核酮糖-5-P-4-差向異構酶(arai))的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列選自由以下組成的組(i).編碼的核苷酸序列，所述包含與SEQIDNO:5的氨基酸序列具有至少60%序列同一性的氨基酸序列，(ii).核苷酸序列，其包含與SEQIDNO:6的核苷酸序列具有至少60%序列同一性的核苷酸序列，(iii).核苷酸序列，其互補鏈與(i)或(ii)的序列的核酸分子雜交，(iv).核苷酸序列，其序列由于遺傳密碼子的簡并性而與(iii)的核酸分子的序列不同。序列同一性和相似性序列同一性在本文中被定義為通過比較序列測定的，兩條或更多條氨基酸(多肽或蛋白質)序列或兩條或更多條核酸(多核苷酸)序列之間的關系。通常，在被比較的序列的整個長度上比較序列的同一性或相似性。在本領域內，"同一性"也表示氨基酸或核酸序列之間的序列相關性(relatedness)程度，所述相關性程度根據情況由這類序列的字符串之間的匹配測定。通過將一個多肽的氨基酸序列及其保守的氨基酸取代與另一多肽進行比較，測定兩條氨基酸序列之間的"相似性"。"同一性"和"相似性"可通過本領域技術人員已知的多種方法容易地計算。測定同一性的優選方法被設計為在被測試的序列之間給出最大匹配。測定同一性和相似性的方法被編碼于公眾可獲得的計算機程序中。測定兩條序列之間同一性和相似性的優選的計算機程序方法包括例如BestFit、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul，S.F.etal.,J.Mol.Biol.215:403-410(1990)，公眾可從NCBI和其它來源獲得(BLASTManual,Altschul,S.,etal.,NCBINLMNIHBethesda,MD20894)。使用的一種最優選的算法是EMBOSS(http:〃www.ebi.ac.uk/emboss/align)。使用EMBOSS進行氨基酸序列比較的優選的參數為缺口開放10.0，缺口延伸0.5，Blosum62矩陣。使用EMBOSS進行核酸序列比較的優選的參數為缺口開放10.0，缺口延伸0.5，DNA完全矩陣(DNA同一性矩陣)。可選地，在測定氨基酸相似性程度時，技術人員也可考慮所謂的"保守"氨基酸取代，這是技術人員應當明白的。保守氨基酸取代是指具有相似側鏈的殘基的互換性。例如，具有脂肪族側鏈的氨基酸組為甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸；具有脂肪族-羥基測量的氨基酸組是絲氨酸和蘇氨酸；具有含酰胺側鏈的氨基酸組是天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳香族側鏈的氨基酸組是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有堿性側鏈的氨基酸組為賴氨酸、精氨酸和組氨酸；具有含硫側鏈的氨基酸組為半胱氨酸和甲硫氨酸。優選的保守氨基酸取代基為纈氨酸-亮氨酸-異亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、賴氨酸-精氨酸、丙氨酸-纈氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。本文公開的氨基酸序列的取代變體是下述變體，其中公開的序列中至少一個殘基被去除，并在其位置中插入不同的殘基。優選地，氨基酸改變是保守的。對各天然存在的氨基酸的優選的保守取代如下Ala到ser;Arg到lys;Asn到gin或his;Asp到glu;Cys到ser或ala;Gin到asn;Glu到asp;Gly到pro;His至ljasn或gin;Ile至!jleu或val;Leu至llile或val;Lys至Uarg;gin或glu;Met至'Jleu或ile;Phe至[Jmet、leu或tyr;Ser至ljthr;Thr到ser;Trp到tyr;Tyr到tip或phe;禾卩Val到ile或leu。雜交核酸序列編碼在本發明的細胞中表達的酶的核苷酸序列也可以通過它們分別與SEQIDNO.2、4、6、8、16、18、20、22、24、26、28、30的核苷酸序列在中度雜交條件下(或優選地在嚴格雜交條件下)雜交的能力來定義。嚴格雜交條件在本文中定義為下述條件，其允許至少約25個、優選地約50個核苷酸、75或IOO個和最優選地約200或更多個核苷酸的核酸序列，在約65。C的溫度下，在含約1M鹽、優選地6xSSC或具有相當的離子強度的任何其它溶液中雜交，并在65。C下在含約0.1M鹽或更少、優選地0.2xSSC或具有相當的離子強度的任何其它溶液中洗滌。優選地，雜交進行過夜，即至少進行10小時，并且優選地，洗滌進行至少一個小時，至少更換兩次洗滌溶液。這些條件通常會允許具有約90%或更高序列同一性的序列特異雜交。中度條件在本文中定義為下述條件，所述條件允許至少50個核苷酸、優選地約200個或更多個核苷酸的核酸序列，在約45'C的溫度下，在含約1M鹽、優選地6xSSC或具有相當的離子強度的任何其它溶液中雜交，并在室溫下在含約0.1M鹽、優選地6xSSC或具有相當的離子強度的任何其它溶液中洗滌。優選地，雜交過夜進行，即至少進行10小時，并且優選地將洗滌進行至少一個小時，至少兩次更換洗滌溶液。這些條件通常會允許具有至多50%序列同一性的序列特異雜交。本領域技術人員將能改變這些雜交條件，從而特異地鑒定同一性在50%和90%之間變化的序列。編碼在本發明的細胞中表達的阿拉伯糖異構酶(amA)的一個優選的核苷酸序列選自由以下組成的組-(a)編碼araA多肽的核苷酸序列，所述araA包含與SEQIDNO.1的氨基酸序列至少具有55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列；(b)核苷酸序列，其包含與SEQIDNO.2的核苷酸序列至少具有60%、70%、80%、90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的核苷酸序列；(c)核苷酸序列，其互補鏈與(a)或(b)的核酸分子序列雜交；(d)核苷酸序列，其序列由于遺傳密碼子的簡并性而與(c)的核酸分子的序列不同。編碼araA的核苷酸序列可編碼原核或真核amA，即具有下述氨基酸序列的amA，所述氨基酸序列與原核生物或真核生物中天然存在的araA的氨基酸序列相同。本發明人發現與wa5禾n"raD共表達時，具體的下述能力不太取決于該"ra^是原核或是真核來源，所述能力是賦予真核宿主細胞使用阿拉伯糖和/或將阿拉伯糖轉化為L-核酮糖和/或5-磷酸木酮糖和/或轉化為期望的發酵產物如乙醇的能力。更確切地說，這取決于的氨基酸序列與SEQIDNO.l序列的相關性。編碼在本發明的細胞中表達的L-核酮糖激酶(AraB)的一個優選的核苷酸序列選自由以下組成的組(a)編碼下述多肽的核苷酸序列，所述多肽包含與SEQIDNO.3的氨基酸序列至少具有20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65°/。、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列；(b)核苷酸序列，其包含與SEQIDNO.5的核苷酸序列至少具有50%、60%、70%、80%、90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的核苷酸序列；(c)核苷酸序列，其互補鏈與(a)或(b)的核酸分子序列雜交；(d)核苷酸序列，其序列由于遺傳密碼子的簡并性而與(c)的核酸分子的序列不同。編碼的核苷酸序列可編碼原核或真核araB，即具有下述氨基酸序列的araB，所述氨基酸序列與原核生物或真核生物中天然存在的"ra5的氨基酸序列相關。本發明人發現與"ra^和共表達時，具體的下述能力不太取決于該woS是原核或是真核來源，所述能力賦予真核宿主細胞使用阿拉伯糖和/或將阿拉伯糖轉化為L-核酮糖和/或5-磷酸木酮糖和/或轉化為期望的發酵產物如乙醇的能力。更確切地說，這取決于的氨基酸序列與SEQIDN0.3序列的相關性。編碼在本發明的細胞中表達的L-核酮糖-5-P-4-差向異構酶(amD)的一個優選的核苷酸序列選自由以下組成的組(e)編碼下述多肽的核苷酸序列，所述多肽包含與SEQIDNO.5的氨基酸序列至少具有60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列；(f)核苷酸序列，其包含與SEQIDNO.6的核苷酸序列至少具有60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98。/q或99%序列同一性的核苷酸序列；(g)核苷酸序列，其互補鏈與(a)或(b)的核酸分子序列雜交；(h)核苷酸序列，其序列由于遺傳密碼子的簡并性而與(c)的核酸分子的序列不同。編碼amD的核苷酸序列可編碼原核或真核araD，即具有下述氨基酸序列的araD，所述氨基酸序列與原核生物或真核生物中天然存在的的氨基酸序列相同。本發明人發現與ara^和ara^共表達時，具體的下述能力不太取決于該araZ)是原核或是真核來源，所述能力賦予真核宿主細胞使用阿拉伯糖和/或將阿拉伯糖轉化為L-核酮糖和/或5-磷酸木酮糖和/或轉化為期望的發酵產物如乙醇的能力。更確切地說，這取決于的氨基酸序列與SEQIDN0.5序列的相關性。驚人地，密碼子偏好指數(codonbiasindex)表明比起EP1499708中所述的原核am8禾口araD基因來說，丄actoZj"c/〃t^p/a她ra附ara丄woB和araZ)基因更適合在酵母中表達。應當注意丄.；/awtomm是通常被認為安全(GRAS)的生物，其被食物注冊機構(foodregistrationauthorities)認可是安全的。因此，優選的核苷酸序列分別編碼具有分別與上述SEQIDNO:1、3或5序列分別相關的氨基酸序列的araA、araB或araD。優選的核苷酸序列分別編碼真菌araA、araB或araD(例如來自S^^om;;cete)，更優選地分別編碼來自厭氧真菌(例如屬于7Veoca〃/maWx、Caecom少ces、尸zVo柳少ces、Or戸'wom;;cas或iwm^omj;c^科的厭氧真菌)的araA、araB或araD。或者，優選的核苷酸序列分別編碼細菌araA、araB或araD，其優選地來自革蘭氏陽性細菌，更優選地來自丄(3ctoZ^d〃t^屬，最優選地來自丄acto6ac〃/wsp/cmtanim禾中。優選地，araA、araB和araD核苷酸序列中的一條、兩條或三條來源于丄actoZ^c"/t^屬，更優選地來源于丄acto^c/〃us;/a"toram禾中。在本發明的細胞中表達的細菌araA不是EP1499708中公開的Sa"'〃t^aro4(作為SEQIDNO:9給出)。SEQIDNO:10表示編碼SEQIDNO:9的核苷酸序列。在本發明細胞中表達的細菌araB和araD不是EP1499708中公開的5^/^n'c/n'aco/z'(五.co/Z)的araB禾卩araD(作為SEQIDNO:11和SEQIDNO:13給出)。SEQIDNO:12代表編碼SEQIDNO:11的核苷酸序列。SEQIDNO:14代表編碼SEQIDNO:13的核苷酸序列。為了提高(細菌)araA、amB和araD酶分別以活性形式在本發明的真核宿主細胞如酵母中表達的可能性，可使相應的編碼核苷酸序列適應選定的真核宿主細本發明的其它酶，見下文)的核苷酸序列對所選宿主細胞密碼子使用的適應性可被表述為密碼子適應指數(CAI)。密碼子適應指數在本文中定義為基因的密碼子使用朝向高度表達的基因的密碼子使用的適應性。每種密碼子的相對適應性(W)是對相同氨基酸而言每種密碼子的使用與最大量密碼子使用的比例。CAI指數被定義為這些相對適應性值的幾何平均值。非同義密碼子和終止密碼子(取決于遺傳密碼子)排除在外。CAI值范圍從0到1，更高的值表示最大量密碼子的更高比例(見SharpandLi,1987，NucleicAcidsResearch15:1281-1295;還見Jansenetal.，2003,NucleicAcidsRes.31(8):2242-51)。已適應的核苷酸序列優選地具有至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6或0.7的CAI。在一個優選的實施方案中，編碼本文之前定義的核苷酸araA、araB和amD的核苷酸序列的表達賦予細胞使用L-阿拉伯糖和/或將其轉化為L-核酮糖和/或5-磷酸木酮糖的能力。不期望受任何理論束縛的情況下，預計L-阿拉伯糖首先被轉化為L-核酮糖，所述L-核酮糖隨后被轉化為5-磷酸木酮糖，所述5-磷酸木酮糖是進入戊糖磷酸途徑的主要分子。在本發明的上下文中，"使用L-阿拉伯糖"優選地表示在至少20天期間，存在至少0.5%L-阿拉伯糖時，在需氧或厭氧條件下培養的經轉化的細胞于660nm處的光密度(OD660)被提高了約0.5至l.O或更多。更優選地，OD66Q被提高了0.5到1.5或更多。更優選地，在存在至少1%、至少1.5%或至少2%L-阿拉伯糖時培養細胞。最優選地，在存在約2y。L-阿拉伯糖時培養細胞。在本發明的上下文中，在至少20天期間，存在L-阿拉伯糖(與前一段中相同的優選的濃度)的需氧或厭氧條件下培養的細胞中使用合適的測定法檢測到可檢測量的L-核酮糖時，該細胞能夠"將L-阿拉伯糖轉化為L-核酮糖"。優選地，該測定法是針對L-核酮糖的HPLC。在本發明的上下文中，在至少20天期間，在存在L-阿拉伯糖(與前一段中相同的優選的濃度)的需氧或厭氧條件下培養的細胞中使用合適的測定法檢測到至少2%的5-磷酸木酮糖增加時，細胞"能夠將L-阿拉伯糖轉化為5-磷酸木酮糖"。優選地，針對5-磷酸木酮糖的基于HPLC的測定法被描述于ZaldivarJ"etal((2002),Appl.Microbiol.Biotechnol.,59:436-442)優選地，所述增加為至少5%、10%、15%、20%、25%或更多。在另一個優選的實施方案中，在至少一個月到一年期間，在存在L-阿拉伯糖(與前一段中相同的優選的濃度)的需要或厭氧條件下培養時，本文較早定義的編碼araA、araB和araD的核苷酸序列的表達賦予細胞將L-阿拉伯糖轉化為期望的發酵產物的能力。更優選地，當細胞在前一句中給出的條件下培養時，使用合適的測定法檢測到可檢測量的期望的發酵產物，則細胞能夠將L-阿拉伯糖轉化為期望的發酵產物。進一步更優選地，該測定法為HPLC。進一步更優選地，該發酵產物為乙醇。用于用上文所述分別編碼araA、araB和araD酶轉化的細胞優選地是下述宿主細胞，其能夠將木糖主動或被動轉運進入細胞中并在細胞中進行木糖異構化。所述細胞優選地能夠進行活性糖酵解。所述細胞還可含有內源戊糖磷酸途徑，并可含有內源木酮糖激酶活性，從而從木糖異構化而來的木酮糖可被代謝為丙酮酸。細胞還優選地含有將丙酮酸轉化為期望的發酵產物的酶，所述期望的發酵產物如乙醇、乳酸、3-羥基-丙酸、丙烯酸、乙酸、琥珀酸、檸檬酸、蘋果酸、延胡索酸、氨基酸、1,3-丙烷-二醇、乙烯、甘油、丁醇、i8-內酰胺抗生素或頭孢菌素。可以通過引入WO2007/041269中公開的丁醇途徑的一個或多個基因使細胞能夠生產丁醇。一種優選的細胞天然能夠進行醇發酵，優選地進行厭氧的醇發酵。宿主細胞還優選地具有對乙醇的高耐受、對低pH的高耐受(能夠在低于5、4、3或2.5的pH下生長)和對有機酸如乳酸、乙酸或甲酸和糖降解產物如糠醛和羥甲基糠醛的高耐受以及對提高的溫度的高耐受。宿主細胞的任何這些特征或活性可天然存在于宿主細胞中，或可通過遺傳選擇或通過遺傳修飾被引入。合適的宿主細胞是真核微生物例如真菌，然而，最合適作為宿主細胞的是酵母或絲狀真菌。酵母在本文中被定義為下述真核微生物，其包括真菌亞門的所有物種(Alexopoulos，C.J.,1962,In:IntroductoryMycology,JohnWiley&Sons,Inc.,NewYork),其主要以單細胞形式生長。酵母可通過單細胞原植體的出芽生長，或可通過生物的分裂生長。作為宿主細胞的優選的酵母屬于//朋56做/(3、X/o6cA:era、jS"c/而wm'蘭少cay或yamH7'a之^^的屬。優選地,酵母能夠進行厭氧發酵，更優選地能夠進行厭氧的醇發酵。絲狀真菌在本文中被定義為包含真菌亞門所有絲狀形式的真核微生物。這些真菌的特征是由甲殼質、纖維素和其它復雜多糖組成的營養菌絲體。本發明的絲狀真菌從形態上、生理上和遺傳上與酵母不同。絲狀真菌的植物性生長是通過菌絲伸長，且大部分絲狀真菌的碳代謝是專性需氧的。作為宿主細胞的優選的絲狀真菌屬于A^w^〃m、7WcAo&rma、//wm/co/a、v4cremowz'w柳、i^Ywan'wm或尸ew/cz'〃z'i/w之^"的屬。數年來，已提出引入多種生物用于從農作物糖生產生物乙醇的建議。然而在實踐中，所有主要的生物乙醇生產工藝都繼續使用&CC/^ram_yC^屬的酵母作為乙醇生產者。這歸因于^cc/^rawj;ce5物種用于工業工藝的許多吸引人的特征，即對高酸、乙醇和滲透的耐受，厭氧生長的能力，當然還有其高的醇發酵能力。作為宿主細胞的優選的酵母物種包括X在一個優選的實施方案中，本發明的宿主細胞是已用核酸構建體轉化的宿主細胞，所述核酸構建體包含編碼如上文定義的araA、araB和araD酶的核苷酸序列。在一個更優選的實施方案中，用三種核酸構建體共轉化宿主細胞，每種核酸構建體包含編碼araA、araB或araD的核苷酸序列。包含ara^、w^8禾n/或amZ)編碼序列的核酸構建體能夠在宿主細胞中表達araA、araB禾口/或araD酶。為此，可如例如WO03/0624430中所述構建核酸構建體。宿主細胞可包含單拷貝的每種核酸構建體，但優選地包含多拷貝。核酸構建體可維持為游離狀態，并因此包含用于自主復制的序列，例如ARS序列。合適的游離核酸構建體可例如基于酵母或pKDl(Fleeretal.,1991,Biotechnology9:968-975)質粒。然而優選地，每種核酸構建體以一個或多個拷貝被整合進宿主細胞的基因組中。整合進宿主細胞的基因組可通過不符合慣例的重組隨機發生，但是優選地核酸構建體通過同源重組被整合進宿主細胞的基因組中，如真菌分子遺傳學領域所公知的(見例如WO90/14423、EP-A畫0481008、EP陽A隱0635574和US6,265,186)。因此，在一個更優選的實施方案中，本發明的細胞包含含有"ra^、ara^禾口/或編碼序列的核酸構建體，并且能夠表達araA、araB和/或araD酶。在一個進一步更優選的實施方案中，"raj、和/或編碼序列各自與啟動子可操作地連接，所述啟動子引起相應的核苷酸序列在細胞中的充分表達，以賦予細胞使用L-阿拉伯糖和/或將L-阿拉伯糖轉化為L-核酮糖和/或5-磷酸木酮糖的能力。優選地，該細胞為酵母細胞。因此在又一方面中，本發明還包括如前文較早闡述的核酸構建體。優選地，該核酸構建體包含編碼araA、araB和/或araD的核酸序列。編碼araA、araB或amD的核酸序列均已在本文中較早定義。進一步更優選地，相應核苷酸序列在細胞中的表達賦予細胞將L-阿拉伯糖轉化為本文稍后定義的期望的發酵產物的能力。在一個進一步更優選的實施方案中，該發酵產物為乙醇。進一步更優選地，該細胞為酵母細胞。本文使用術語"可操作地連接"是指多核苷酸元件(或編碼序列或核酸序列)在功能性相互關系中連接。當核酸序列被置于與另一核酸序列的功能性相互關系中時，其是"可操作地連接"的。例如，如果啟動子或增強子能影響編碼序列的轉錄，則其與編碼序列是可操作地連接的。可操作地連接的意味著被連接的核酸序列通常是連續的，并且在需要接合兩條蛋白質編碼區時是連續的和符合讀碼框的。本文使用術語"啟動子"是指下述核酸片段，其能發揮功能以控制一個或多個基因的轉錄，相對于轉錄方向而言位于基因轉錄起點的上游，并且在結構上通過存在DNA-依賴型RNA聚合酶的結合位點、轉錄起點和任何其它DNA序列鑒定，所述任何其它DNA序列包括但不限于轉錄因子結合位點、阻抑和激活蛋白結合位點以及本領域技術人員已知直接或間接作用以調節來自該啟動子的轉錄量的任何其它序列。"組成型"啟動子是在大部分環境和發育條件下有活性的啟動子。"誘導型"啟動子是在環境或發育調節下有活性的啟動子。能夠用于達成編碼araA、araB和/或araD的核苷酸序列表達的啟動子對要被表達的編碼酶的核苷酸序列可以不是天然的，即啟動子對與其可操作地連接的核苷酸序列(編碼序列)是異源的。盡管啟動子優選地對與其可操作地連接的編碼序列是異源的，但是也啟動子是同源的也是優選，即對宿主細胞而言是內源的。優選地，與對編碼序列是固有的啟動子相比，優選地在可獲得阿拉伯糖，或阿拉伯糖和葡萄糖，或木糖和阿拉伯糖，或木糖和阿拉伯糖和葡萄糖作為碳源，更優選地作為主要碳源(即多于50%的可獲得的碳源由阿拉伯糖，或阿拉伯糖和葡萄糖，或木糖和阿拉伯糖，或木糖和阿拉伯糖和葡萄糖組成)，最優選地作為唯一碳源的條件下，(對核苷酸序列)異源的啟動子能夠生產高穩態水平的包含編碼序列的轉錄本(或每單位時間能夠生產更多轉錄本分子，即mRNA分子)。該上下文中合適的啟動子包括組成型和誘導型天然啟動子以及經改造的啟動子。用于本發明中的一個優選的啟動子除了會對分解代謝產物(葡萄糖)阻抑不靈敏外，和/或會優選地不需要阿拉伯糖和/或木糖用于誘導。具有這些特征的啟動子是可廣泛獲得的，并是技術人員已知的。這類啟動子的合適的例子包括例如來自糖酵解基因的啟動子，如來自酵母或絲狀真菌的果糖磷酸激酶(PPK)、磷酸丙糖異構酶(TPI)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GPD、TDH3或GAPDH)、丙酮酸激酶(PYK)、磷酸甘油酸酯激酶(PGK)啟動子；關于來自酵母的這類啟動子的更多細節可見(WO93/03159)。其它有用的啟動子是核糖體蛋白質編碼基因啟動子、乳糖酶基因啟動子(LAC4)、醇脫氫酶啟動子(ADH1、ADH4等等)、烯醇化酶啟動子(ENO)、葡萄糖-6-磷酸異構酶啟動子(PGI1,Haufetal,2000)或己糖(葡萄糖)轉運子啟動子(HXT7)或甘油醛-3-磷酸脫氫酶(TDH3)。PGI1啟動子的序列在SEQIDN0:51中給出。HXT7啟動子的序列在SEQIDNO:52中給出。TDH3啟動子的序列在SEQIDNO:49中給出。其它組成型和誘導型啟動子與增強子或上游激活序列會是本領域技術人員已知的。需要時可修飾本發明的宿主細胞中使用的啟動子，以影響其控制特征。本發明的一種優選的細胞是用丄.p/awtomm的ara」、禾卩基因轉化的真核細胞。更優選地，該真核細胞是酵母細胞，進一步更優選地是用Z.//awtan/附的ara^、ara5禾口araD基因轉4七的51.cerev&ae菌株。最優選地，該細胞為CBS120327或CBS120328，其均在2006年9月27日保藏于CBSInstitute(荷蘭)。用于表明給定的(重組)核酸或多肽分子和給定的宿主生物或宿主細胞之間相互關系時，術語"同源的"被理解為表示該核酸或多肽分子天然地由相同物種的宿主細胞或生物產生，優選地由相同變種或菌株產生。典型地，如果與宿主細胞同源，則編碼多肽的核酸序列會與并非其天然環境中的另一啟動子序列或適用時另一分泌信號序列和/或終止子序列可操作地連接。當用于表明兩條核酸序列的相關性時，術語"同源的"表示一條單鏈核酸序列可與互補的單鏈核酸序列雜交。雜交程度可取決于大量因素，包括如前文所述的序列之間的同一性量和雜交條件如溫度和鹽濃度。優選地，同一性區域大于約5bp，更優選地同一性區域大于約10bp。關于核酸(DNA或RNA)或蛋白質使用時，術語"異源的"表示下述核酸或蛋白質，其在其存在的生物、細胞、基因組或DNA或RNA序列中不是天然存在的部分，或在基因組或DNA或RNA序列中存在的位置與其天然存在的位置不同。異源的核酸或蛋白質對其被引入的細胞不是內源的，而是得自合成或重組產生的另一細胞。一般地，盡管不是必須地，這類核酸編碼下述蛋白質，其中引入或表達DNA的細胞通常不生產所述蛋白質。類似地，外源RNA編碼在存在該外源RNA的細胞中通常不表達的蛋白質。異源核酸和蛋白質也可表示外來核酸或蛋白質。術語異源核酸或蛋白質包括下述任何核酸或蛋白質，其會被本領域技術人員識別為對表達該核酸或蛋白質的細胞而言是異源或外來的。術語異源的還適用于核酸或氨基酸序列的非天然組合，即組合中至少兩條組合的序列對彼此是外來的。能夠使用和/或轉化L-阿拉伯糖和木糖的優選的真核細胞在一個更優選的實施方案中，表達araA、araB和araD的本發明的細胞能夠使用L-阿拉伯糖和/或將其轉化為L-核酮糖和/或5-磷酸木酮糖和/或本文較早定義的期望的發酵產物，并且還顯示出使用木糖和/或將木糖轉化為木酮糖的能力。木糖到木酮糖的轉化優選為一步異構化步驟(直接將木糖異構化為木酮糖)。因此這類細胞既能使用L-阿拉伯糖又能使用木糖。"使用"木糖優選地具有與本文較早定義的"使用"L-阿拉伯糖相同的含義。酶定義按照WO06/009434中針對木糖異構酶(EC5.3丄5)、木酮糖激酶(EC2.7丄17)、5-磷酸核酮糖差向異構酶(5丄3.1)、5-磷酸核酮糖異構酶(EC5.3丄6)、轉酮酶(EC2.2丄1)、轉醛酶(EC2.2丄2)和醛糖還原酶(ECU丄21)使用的定義。在一個優選的實施方案中，如前文較早定義的表達araA、amB和araD的本發明的真核細胞具有將木糖異構化為木酮糖的能力，如例如WO03/0624430或WO06/009434中所述。通過用包含編碼木糖異構酶的核苷酸序列的核酸構建體轉化宿主細胞，賦予該宿主細胞將木糖異構化為木酮糖的能力。被轉化的宿主細胞將木糖異構化為木酮糖的能力是木糖到木酮糖的直接異構化。這被理解為表示木糖在由木糖異構酶催化的單一反應中被異構化為木酮糖，與從木糖通過木糖醇中間產物到木酮糖的兩步驟轉化相反，所述兩步驟轉化分別由木糖還原酶和木糖醇脫氫酶催化。核苷酸序列編碼木糖異構酶，其優選地在本發明的經轉化的宿主細胞中以活性形式表達。因此，核苷酸序列在宿主細胞中的表達產生木糖異構酶，該酶在3CTC下至少具有每mg蛋白質10U木糖異構酶活性的比活性，優選地在30。C下至少具有每mg20U、25U、30U、50U、IOOU、200U、300或500U的比活性。在經轉化的宿主細胞中表達的木糖異構酶的比活性在本文中被定義為每mg宿主細胞細胞游離裂解物(例如酵母細胞游離裂解物)的蛋白質的木糖異構酶活性單位的量。木糖異構酶活性的測定在前文中己描述。優選地，編碼木糖異構酶的核苷酸序列在宿主細胞中的表達產生對木糖具有下述Km的木糖異構酶，所述Km少于50、40、30或25mM，更優選地，對木糖的K^為約20mM或更少。編碼木糖異構酶的一條優選的核苷酸序列可選自由以下組成的組(e)編碼下述多肽的核苷酸序列，所述多肽包含與SEQIDNO.15的氨基酸序列至少具有60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列；①核苷酸序列，其包含與SEQIDNO.16的核苷酸序列至少具有40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的核苷酸序列；(g)核苷酸序列，其互補鏈與(a)或(b)的核酸分子序列雜交；(h)核苷酸序列，其序列由于遺傳密碼子的簡并性而與(c)的核酸分子的序列不同。編碼木糖異構酶的核苷酸序列可編碼原核或真核木糖異構酶，即具有下述氨基酸序列的木糖異構酶，所述氨基酸序列與原核生物或真核生物中天然存在的木糖異構酶的氨基酸序列相同。本發明人發現具體木糖異構酶的下述能力不太取決于該異構酶是原核或是真核來源，所述能力賦予真核宿主細胞將木糖異構化為木酮糖的能力。更確切地說，這取決于異構酶的氨基酸序列與Ay歸F^序列(SEQIDNO.7)的相關性。驚人地，與其它己知的真核異構酶相比，真核/Vom;;c"異構酶與原核異構酶更加相關。因此，優選的核苷酸序列編碼具有下述氨基酸序列的木糖異構酶，所述氨基酸序列與上文定義的AramycM序列相關。一種優選的核苷酸序列編碼真菌木糖異構酶(例如來自^wWomycete)，更優選地編碼來自另一厭氧真菌的木糖異構酶，例如來自屬于7Veoca〃z'mos"x、Q^cow少ces、_PZram_ycas、0;^'"cw;;cm或Wwmz'"omyc&y禾斗的厭氧真菌的木、糖異構酶。或者，一種優選的核苷酸序列編碼細菌木糖異構酶，優選地來自革蘭氏陰性細菌，更優選地編碼來自SacteraW^綱、或來自SacteraWes屬的異構酶，最優選地來自5.AetoZotoom^ro"(SEQIDNO.15)。為了提高木糖異構酶以活性形式在真核宿主細胞如酵母中表達的可能性，可使編碼木糖異構酶的核苷酸序列適應前文定義的真核宿主細胞，以優化其密碼子使用。用于用編碼上文定義的木糖異構酶的核苷酸序列轉化的宿主細胞優選地為能夠將木糖主動或被動轉運進入細胞的宿主細胞。該宿主細胞優選地含有活性糖酵解。該細胞還可含有內源戊糖磷酸途徑，并可含有內源木酮糖激酶活性，從而從木糖異構化而來的木酮糖可被代謝為丙酮酸。該宿主還優選地含有將丙酮酸轉化為期望的發酵產物的酶，所述期望的發酵產物如乙醇、乳酸、3-羥基-丙酸、丙烯酸、乙酸、琥珀酸、檸檬酸、蘋果酸、延胡索酸、氨基酸、1，3-丙烷-二醇、乙烯、甘油、丁醇、^-內酰胺抗生素或頭孢菌素。一種優選的宿主細胞天然能夠進行醇發酵，優選地進行厭氧的醇發酵。宿主細胞還優選地具有對乙醇的高耐受、對低pH的高耐受(即能夠在低于5、4、3或2.5的pH下生長)和對有機酸如乳酸、乙酸或甲酸和糖降解產物如糠醛和羥甲基糠醛的高耐受和對提高的溫度的高耐受。宿主細胞的任何這些特征或活性可天然存在于宿主細胞中，或可通過遺傳修飾被引入或修飾。合適的宿主細胞是真核微生物例如真菌，然而，最合適作為宿主細胞的是酵母或絲狀真菌。優選的酵母和絲狀真菌本文已定義。本文使用的措辭宿主細胞具有與細胞相同的含義。本發明的細胞優選地用下述核酸構建體轉化，所述核酸構建體包含編碼木糖異構酶的核苷酸序列。優選地使用的核酸構建體與使用的包含編碼araA、amB或araD的核苷酸序列的核酸構建體相同。在本發明的另一個優選的實施方案中，本發明的細胞(其表達araA、araB和amD，并顯示將木糖直接異構化為木酮糖的能力，如前文所定義)還包含下述遺傳修飾，其提高戊糖磷酸途徑的通量，如WO06/009434中所述。具體地，該遺傳修飾引起非氧化部分戊糖磷酸途徑通量的提高。引起戊糖磷酸途徑非氧化性部分通量提高的遺傳修飾在本文中應被理解為表示下述修飾，與除了引起通量提高的遺傳修飾外是遺傳同一的菌株中的通量相比，所述修飾至少將通量提高1.1、1.2、1.5、2、5、10或20倍。可如下測量戊糖磷酸途徑非氧化部分的通量使經修飾的宿主在作為唯一碳源的木糖上生長，測定木糖比消耗速率(specificxyloseconsumptionrate)并從木糖比消耗速率中減去木糖醇比生產速率，如果產生任何木糖醇的話。然而，戊糖磷酸途徑的非氧化部分通量與在作為唯一碳源的木糖上的生長速率成比例，優選地與在作為唯一碳源的木糖上的厭氧生長速率成比例。在作為唯一碳源的木糖上的生長速率O^J與戊糖磷酸途徑非氧化部分的通量之間存在線性關系。木糖比消耗速率(Qs)等于生長速率(M)除以生物質相對于糖的產率(Y^)，因為生物質相對于糖的產率是恒定的(在給定的一組條件下厭氧、生長培養基、pH、菌株的遺傳背景等；即Qs，/Yxs)。因此，可從這些條件下的最大生長速率的提高推論出戊糖磷酸途徑非氧化部分提高的通量。在一個優選的實施方案中，細胞包含下述遺傳修飾，其提高戊糖磷酸途徑的通量，并具有至少346mg木糖/g生物質/h的木糖比消耗速率。提高戊糖磷酸途徑通量的遺傳修飾可以多種途徑被引入宿主細胞中。這些途徑包括例如達到木酮糖激酶和/或戊糖磷酸途徑非氧化部分的一種或多種酶的更高穩定狀態活性水平，和/或降低的穩態水平的非特異性醛糖還原酶活性。可通過選擇突變體(自發的或由化學品或輻射誘導)和/或通過重組DNA技術(例如分別通過過表達或失活基因，所述基因編碼調節這些基因的酶或因素)影響穩態活性水平的這些改變。在一個更優選的宿主細胞中，遺傳修飾包括過表達戊糖磷酸途徑(非氧化部分)的至少一種酶。優選地，該酶選自由編碼5-磷酸核酮糖異構酶、5-磷酸核酮糖差向異構酶、轉酮酶和轉醛酶的酶組成的組，如WO06/009434中所述。可過表達戊糖磷酸途徑(非氧化部分)的酶的多種組合。例如，被過表達的酶可以至少是酶5-磷酸核酮糖異構酶和5-磷酸核酮糖差向異構酶；或至少是酶5-磷酸核酮糖異構酶和轉酮酶；或至少是酶5-磷酸核酮糖異構酶和轉醛酶；或至少是酶5-磷酸核酮糖差向異構酶和轉酮酶；或至少是酶5-磷酸核酮糖差向異構酶和轉醛酶；或至少是酶轉酮酶和轉醛酶；或至少是酶5-磷酸核酮糖差向異構酶、轉酮酶和轉醛酶；或至少是酶5-磷酸核酮糖異構酶、轉酮酶和轉醛酶；或至少是酶5-磷酸核酮糖異構酶、5-磷酸核酮糖差向異構酶和轉醛酶；或至少是酶5-磷酸核酮糖異構酶、5-磷酸核酮糖差向異構酶和轉酮酶。在本發明的一個實施方案中，在宿主細胞中過表達5-磷酸核酮糖異構酶、5-磷酸核酮糖差向異構酶、轉酮酶和轉醛酶各種酶。更優選的是下述宿主細胞，其中遺傳修飾包括至少過表達轉酮酶和轉醛酶兩種酶，因為這樣的宿主細胞已經能夠在木糖上厭氧生長。事實上，在一些條件下，我們發現僅過表達轉酮酶和轉醛酶的宿主細胞在木糖上已經具有與過表達所有四種酶的宿主細胞相同的厭氧生長速率，所述四種酶即5-磷酸核酮糖異構酶、5-磷酸核酮糖差向異構酶、轉酮酶和轉醛酶。另外，過表達5-磷酸核酮糖異構酶和5-磷酸核酮糖差向異構酶兩種酶的宿主細胞是超過僅過表達異構酶或僅過表達差向異構酶的宿主細胞而被優選的，因為僅過表達這些酶之一即可產生代謝失衡。本領域可獲得多種手段用于在本發明的細胞中過表達酶。具體地，可通過提高宿主細胞中編碼酶的基因的拷貝數來過表達酶，例如通過在宿主細胞的基因組中整合額外的基因拷貝，通過從附加體多拷貝表達載體中表達基因，或通過引入包含多拷貝基因的附加體表達載體來實現。或者，可通過使用下述啟動子達成酶在本發明宿主細胞中的過表達，所述啟動子不是編碼要過表達的酶的序列所固有的，即對與其可操作地連接的編碼序列是異源的啟動子。對該目的而言合適的啟動子在本文中己定義。用于過表達酶的編碼序列優選地與本發明的宿主細胞是同源的。然而，與本發明宿主細胞異源的編碼序列也可同樣使用，如WO06/009434中所述。用于在本發明的宿主細胞中過表達5-磷酸核酮糖異構酶的核苷酸序列是編碼具有5-磷酸核酮糖異構酶活性的多肽的核苷酸序列，其中優選地該多肽具有與SEQIDNO.17至少具有50%、60%、70%、80%、90%或95%同一性的氨基酸序列，或其中該核苷酸序列能夠在中度條件下、優選地在嚴格條件下與SEQIDNO.18的核苷酸序列雜交。用于在本發明的宿主細胞中過表達5-磷酸核酮糖差向異構酶的核苷酸序列是編碼具有5-磷酸核酮糖差向異構酶活性的多肽的核苷酸序列，其中優選地該多肽具有與SEQIDNO.19至少具有50%、60%、70%、80%、90%或95%同一性的氨基酸序列，或其中該核苷酸序列能夠在中度條件下、優選地在嚴格條件下與SEQIDNO.20的核苷酸序列雜交。用于在本發明的宿主細胞中過表達轉酮酶的核苷酸序列是編碼具有轉酮酶活性的多肽的核苷酸序列，其中優選地該多肽具有與SEQIDNO.21至少具有50%、60%、70%、80%、90%或95%同一性的氨基酸序列，或其中該核苷酸序列能夠在中度條件下、優選地在嚴格條件下與SEQIDNO.22的核苷酸序列雜交。用于在本發明的宿主細胞中過表達轉醛酶的核苷酸序列是編碼具有轉醛酶活性的多肽的核苷酸序列，其中優選地該多肽具有與SEQIDNO.23至少具有50%、60%、70%、80%、90%或95%同一性的氨基酸序列，或其中該核苷酸序列能夠在中度條件下、優選地在嚴格條件下與SEQIDNO.24的核苷酸序列雜交。當涉及在經遺傳修飾的宿主細胞中生產酶時，酶的過表達表示與相同條件下未經修飾的宿主細胞相比，酶以更高水平的酶比活性被生產。通常，這表示與相同條件下未經修飾的宿主細胞相比，具有酶活性的蛋白質(或在多亞基酶的情況下為多個蛋白質)以更大的量被生產，或者說以更高的穩態水平被生產。類似地，這通常表示與相同條件下未經修飾的宿主細胞相比，編碼具有酶活性的蛋白質的mRNA以更大量被生產，或者說以更高的穩態水平被生產。因此，優選地通過使用如本文所述的適當酶測定法，通過測量宿主細胞中酶的比活性水平測定酶的過表達。或者，可例如使用對酶特異的抗體通過定量酶蛋白質的比穩態水平，或通過定量編碼該酶的mRNA的比穩態水平，間接測定酶的過表達。后者尤其適用于戊糖磷酸途徑的酶，對該途徑而言酶測定法不是容易可行的，因為酶的底物不是可商業獲得的。優選地，在本發明的宿主細胞中，與除了引起過表達的遺傳修飾外遺傳上同一的菌株相比，要被過表達的酶以至少1.1、1.2、1.5、2、5、10或20的倍數被過表達。應當理解，這些過表達水平可適用于酶活性的穩態水平、酶的蛋白質的穩態水平，以及編碼酶的轉錄本的穩態水平。在又一個優選的實施方案中，本發明的宿主細胞(其表達araA、araB和amD，并顯示將木糖直接異構化為木酮糖的能力，并可選地包含下述遺傳修飾，其提高戊糖磷酸途徑的通量，如前文所述)還包含提高木酮糖激酶比活性的遺傳修飾。優選地，該遺傳修飾例如通過過表達編碼木酮糖激酶的核苷酸序列，來引起木酮糖激酶的過表達。編碼木酮糖激酶的基因對宿主細胞可以是內源的，或可以是對宿主細胞異源的木酮糖激酶。用于在本發明的宿主細胞中過表達木酮糖激酶的核苷酸序列是編碼具有木酮糖激酶活性的多肽的核苷酸序列，其中優選地該多肽具有與SEQIDNO.25至少具有50%、60%、70%、80%、90%或95%同一性的氨基酸序列，或其中該核苷酸序列能夠在中度條件下、優選地在嚴格條件下與SEQIDNO.26的核苷酸序列雜交。一種尤其優選的木酮糖激酶是與來自A>ow;;cm的木酮糖激酶x;;/S相關的木糖激酶，如WO03/0624430中所述。用于在本發明的宿主細胞中過表達木酮糖激酶的一種更優選的核苷酸序列是編碼具有木酮糖激酶活性的多肽的核苷酸序列，其中優選地該多肽具有與SEQIDNO.27至少具有50%、60%、70%、80%、90%或95%同一性的氨基酸序列，或其中該核苷酸序列能夠在中度條件下、優選地在嚴格條件下與SEQIDNO.28的核苷酸序列雜交。在本發明的宿主細胞中，提高木酮糖激酶比活性的遺傳修飾可以與如上所述提高戊糖磷酸途徑通量的任何修飾組合，但是該組合對本發明不是必需的。因此，除了表達本文定義的araA、araB和araD酶之外還包含提高木酮糖激酶比活性的遺傳修飾的本發明宿主細胞特定地包含在本發明中。本領域中用于達成和分析木酮糖激酶在本發明宿主細胞中過表達的多種手段與上文針對戊糖磷酸途徑的酶所述相同。優選地，在本發明的宿主細胞中，與除了引起過表達的遺傳修飾外遺傳上同一的菌株相比，要被過表達的木酮糖激酶以至少1.1、1.2、1.5、2、5、10或20的倍數被過表達。應當理解，這些過表達水平可應用于酶活性的穩態水平、酶的蛋白質的穩態水平，以及編碼酶的轉錄本的穩態水平。在又一個優選的實施方案中，本發明的宿主細胞(其表達araA、araB和amD，并顯示將木糖直接異構化為木酮糖的能力，并可選地包含提高戊糖磷酸途徑通量的遺傳修飾，和/或還包含提高木酮糖激酶比活性的遺傳修飾，均如前所述)還包含降低宿主細胞中非特異性醛糖還原酶活性的遺傳修飾。優選地，通過一種或多種遺傳修飾降低宿主細胞中非特異性醛糖還原酶活性，所述遺傳修飾降低非特異性醛糖還原酶的表達或使編碼該酶的基因失活，如WO06/009434中所述。優選地，遺傳修飾降低或失活宿主細胞中非特異性醛糖還原酶各內源拷貝的表達。宿主細胞可由于二倍性、多倍性或非整倍性而包含多拷貝的編碼非特異性醛糖還原酶的基因，和/或宿主細胞可含有具有醛糖還原酶活性的若干種不同的(同工)酶，其氨基酸序列不同并且各自由不同的基因編碼。另外，在這類情況下編碼非特異性醛糖還原酶的各基因的表達優選地被降低或失活。優選地，通過至少刪除基因的部分或通過破壞基因將該基因失活或刪除，其中在該語境中術語基因還包括編碼序列上游或下游的任何非編碼序列，其(部分)刪除或失活導致宿主細胞中非特異性醛糖還原酶活性表達的降低。編碼要在本發明的宿主細胞中降低其活性的醛糖還原酶的核苷酸序列是編碼具有醛糖還原酶活性的多肽的核苷酸序列，其中優選地該多肽具有與SEQIDNO.29至少具有50%、60%、70%、80%、90%或95%同一性的氨基酸序列，或其中該核苷酸序列能夠在中度條件下、優選地在嚴格條件下與SEQIDNO.30的核苷酸序列雜交。在本發明的宿主細胞中，本文定義的araA、araB和araD酶的表達與降低非特異性醛糖還原酶活性的遺傳修飾組合。導致非特異性醛糖還原酶活性降低的遺傳修飾可以與如上所述在宿主細胞中提高戊糖磷酸途徑通量的任何修飾和/或提高木酮糖激酶比活性的任何修飾組合，但是這些組合對本發明不是必需的。因此，包含降低非特異性醛糖還原酶活性的其它遺傳修飾的、表達araA、araB和araD的宿主細胞特定地包含在本發明中。在一個優選的實施方案中，宿主細胞是于2006年9月27日保藏于CBS協會(荷蘭)的CBS120327。在又一個優選的實施方案中，本發明涉及還適應L-阿拉伯糖利用(使用L-阿拉伯糖和/或將其轉化為L-核酮糖和/或5-磷酸木酮糖和/或期望的發酵產物)并可選地適應木糖利用的經修飾的宿主細胞，所述宿主細胞通過選擇自發或(例如通過輻射或化學品)誘導的突變體獲得，所述突變體在L-阿拉伯糖和可選的木糖上生長，優選地在作為唯一碳源的L-阿拉伯糖和可選的木糖上生長，更優選地在厭氧條件下生長。突變體的選擇可以通過例如Kuyperetal.(2004,FEMSYeastRes.4:655-664)所述的培養物連續傳代進行，和/或通過例如WO06/009434實施例4中所述在恒化培養中于選擇壓力下培養進行。該選擇過程可根據需要繼續。該選擇過程優選地在一周內直至一年內完成。然而如果需要的話，該選擇過程可進行更長的時間段。在該選擇過程中，優選地在存在約20g/1L-阿拉伯糖和/或約20g/1木糖時培養細胞。預期在該選擇過程結束時獲得的細胞關于其下述能力被改進，所述能力為使用L-阿拉伯糖和/或木糖的能力，和/或將L-阿拉伯糖轉化為L-核酮糖和/或5-磷酸木酮糖和/或期望的發酵產物如乙醇的能力。在該語境中，"改進的細胞"可表示獲得的細胞與其來源的細胞相比，能夠以更有效的方式使用L-阿拉伯糖和/或木糖。例如，預期在相同的條件下，獲得的細胞比其來源的細胞更好地生長比生長速率提高至少2%。優選地，該提高至少為4%、6%、8%、10%、15%、20%、25%或更多。如技術人員所已知的，比生長速率可以從0066。計算。因此，通過監測OD66。，可以推論比生長速率。在該語境中，"改進的細胞"也可表示獲得的細胞與其來源的細胞相比，以更有效的方式將L-阿拉伯糖轉化為L-核酮糖和/或5-磷酸木酮糖和/或期望的發酵產物如乙醇。例如，預期獲得的細胞生產更高量的L-核酮糖和/或5-磷酸木酮糖和/或期望的發酵產物如乙醇相同條件下與其來源的細胞相比，至少一種這些化合物至少提高2%。優選地，該提高至少為4%、6%、8%、10%、15%、20%、25%或更多。在該語境中，"改進的細胞"也可表示獲得的細胞與其來源的細胞相比，以更有效的方式將木糖轉化為木酮糖和/或期望的發酵產物如乙醇。例如，預期獲得的細胞生產更高量的木酮糖和/或期望的發酵產物如乙醇相同條件下與其來源的細胞相比至少一種這些化合物至少提高2%。優選地，該提高至少為4%、6%、8%、10%、15%、20%、25%或更多。在本發明的一個優選的宿主細胞中，至少一種上述遺傳修飾(包括通過選擇突變體獲得的修飾)賦予宿主細胞在作為碳源、優選地作為唯一碳源的L-阿拉伯糖和可選的木糖上、優選地在厭氧條件下生長的能力優選地，經修飾的宿主細胞基本上不生產木糖醇，例如產生的木糖醇低于檢測極限，或例如以摩爾為基礎少于消耗的碳的5%、2%、1%、0.5%或0.3%。優選地，經修飾的宿主細胞具有在作為唯一碳源的L-阿拉伯糖和可選的木糖上在需氧條件下以至少0.001、0.005、0.01、0.03、0.05、0.1、0.2、0.25或0.3h"的速率生長的能力，或者如果可應用的話，在厭氧條件下以至少0.001、0.005、0.01、0.03、0.05、0.07、0.08、0.09、0.1、0.12、0.15或0.2h—1的速率生長的能力。優選地，經修飾的宿主細胞具有在作為唯一碳源的葡萄糖和L-阿拉伯糖和可選的木糖(1:1重量比)的混合物上在需氧條件下以至少0.001、0.005、0.01、0.03、0.05、0.1、0.2、0.25或0.3h"的速率生長的能力，或者如果可應用的話，在厭氧條件下以至少0.001、0.005、0.01、0.03、0.05、0.1、0.12、0.15或0.2h"的速率生長的能力。優選地，經修飾的宿主細胞具有至少346、350、400、500、600、650、700、750、800、900或1000mg/g細胞/h的L-阿拉伯糖和可選的木糖的比消耗速率。優選地，經修飾的宿主細胞具有下述相對于L-阿拉伯糖和可選的木糖的發酵產物(如乙醇)產率，所述產率至少是宿主細胞的相對于葡萄糖的發酵產物(如乙醇)產率的20%、25%、30%、35°/0、40%、45%、50%、55%、60%、70%、80%、85%、90%、95%或98%。更優選地，經修飾的宿主細胞的相對于L-阿拉伯糖和可選的木糖的發酵產物(如乙醇)產率等于宿主細胞的相對于葡萄糖的發酵產物(如乙醇)產率。同樣，經修飾的宿主細胞的相對于L-阿拉伯糖和可選的木糖的生物質產率優選地至少是宿主細胞的相對于葡萄糖的生物質產率的55%、60%、70%、80%、85%、90%、95%或98%。更優選地，經修飾的宿主細胞的相對于-阿拉伯糖和可選的木糖的生物質產率等于宿主細胞的相對于葡萄糖的生物質產率。應當理解在相對于葡萄糖和L-阿拉伯糖和可選的木糖的產率的比較中，兩種產率均在需氧條件下比較或均在厭氧條件下比較。在一個更優選的實施方案中，宿主細胞是于2006年9月27日保藏于CBS協會(荷蘭)的CBS120328，或于2007年9月20日保藏于CBS協會(荷蘭)的CBS121879。在一個優選的實施方案中，細胞表達一種或多種酶，所述酶賦予細胞生產至少一種選自下組的發酵產物的能力，該組由乙醇、乳酸、3-羥基-丙酸、丙烯酸、乙酸、琥珀酸、檸檬酸、蘋果酸、延胡索酸、氨基酸、1,3-丙烷-二醇、乙烯、甘油、丁醇、/3-內酰胺抗生素和頭孢菌素組成。在一個更優選的實施方案中，本發明的宿主細胞是用于生產乙醇的宿主細胞。在另一個優選的實施方案中，本發明涉及用于生產除乙醇外的發酵產物的經轉化的宿主細胞。這樣的非乙醇發酵產物原則上包括可由真核微生物如酵母或絲狀真菌生產的任何粗制化學品(bulkchemical)或精細化學品。這類發酵產物包括例如乳酸、3-羥基-丙酸、丙烯酸、乙酸、琥珀酸、檸檬酸、蘋果酸、延胡索酸、氨基酸、1,3-丙垸-二醇、乙烯、甘油、丁醇、/3-內酰胺抗生素和頭孢菌素。用于生產非乙醇發酵產物的一個優選的本發明宿主細胞是含有下述遺傳修飾的宿主細胞，所述修飾導致降低的醇脫氫酶活性。方法另一方面，本發明涉及下述發酵工藝，其中本發明的宿主細胞被用于發酵碳源，所述碳源包含L-阿拉伯糖來源和任選的木糖來源。優選地，該L-阿拉伯糖來源和木糖來源為L-阿拉伯糖和木糖。另外，發酵培養基中的碳源也可以包含葡萄糖來源。L-阿拉伯糖、木糖或葡萄糖來源可以同樣是L-阿拉伯糖、木糖或葡萄糖，或可以是包含L-阿拉伯糖、木糖或葡萄糖單元的任何碳水化合物寡聚體或多聚體，例如木質纖維素、木聚糖、纖維素、淀粉、阿拉伯糖聚糖等等。為了從這類碳水化合物中釋放木糖或葡萄糖。可向發酵培養基中添加或由經修飾的宿主細胞生產合適的碳水化合物酶(如木聚糖酶、葡聚糖酶、淀粉酶等等)。在后一情況下，經修飾的宿主細胞可被遺傳工程改造為生產和分泌這類碳水化合物酶。使用寡聚體或多聚體的葡萄糖來源的另一個優點是其使得在發酵期間能夠維持(更)低的游離葡萄糖濃度，所述發酵例如使用速率限制量的碳水化合物酶。因此，這進而會防止代謝和轉運非葡萄糖的糖如木糖所需的體系阻抑。在一種優選的工藝中，經修飾的宿主細胞發酵L-阿拉伯糖(可選地為木糖)和葡萄糖二者，優選地同時發酵，在該情況下優選地使用經修飾的宿主細胞，所述宿主細胞對妨礙二次生長(diauxicgrowth)的葡萄糖阻抑不敏感。除了作為碳源的L-阿拉伯糖、任選的木糖(和葡萄糖)的來源外，發酵培養基還會包含經修飾的宿主細胞生長所需的適當成分。用于微生物如酵母和絲狀真菌生長的發酵培養基的組成是本領域公知的。在一種優選的工藝中，提供了用于生產選自下組的發酵產物的工藝，該組由乙醇、乳酸、3-羥基-丙酸、丙烯酸、乙酸、琥珀酸、檸檬酸、蘋果酸、延胡索酸、氨基酸、1,3-丙烷-二醇、乙烯、甘油、丁醇、/3-內酰胺抗生素和頭孢菌素組成，其中該工藝包括步驟(a)用本文定義的經修飾的宿主細胞發酵含有阿拉伯糖和可選的木糖來源的培養基；和可選地(b)回收所述發酵產物。發酵工藝是用于生產發酵產物如乙醇、乳酸、3-羥基-丙酸、丙烯酸、乙酸、琥珀酸、檸檬酸、蘋果酸、延胡索酸、氨基酸、1,3-丙垸-二醇、乙烯、甘油、丁醇、/3-內酰胺抗生素(如青霉素G和青霉素V及其發酵衍生物)和頭孢菌素的工藝。該發酵工藝可以是需氧或厭氧的發酵工藝。厭氧發酵工藝在本文中定義為不存在氧時進行的發酵工藝，或其中基本不消耗氧、優選地消耗少于5、2.5或1mmol/L/h、更優選地消耗0mmol/L/h(即氧消耗是不可檢測的)的工藝，并且其中有機分子發揮電子供體和電子受體兩種作用。不存在氧時，在糖酵解和生物質形成中產生的NADH不能被氧化磷酸化氧化。為了解決該問題，許多微生物使用丙酮酸或其衍生物之一作為電子和氫受體，從而再生NAD+。因此，在一種優選的厭氧發酵工藝中，丙酮酸被用作電子(和氫受體)，并被還原為發酵產物如乙醇、乳酸、3-羥基-丙酸、丙烯酸、乙酸、琥珀酸、檸檬酸、蘋果酸、延胡索酸、氨基酸、1,3-丙烷-二醇、乙烯、甘油、丁醇、/3-內酰胺抗生素和頭孢菌素。在一個優選的實施方案中，發酵工藝是厭氧的。厭氧的發酵工藝是有利的，因為其比需氧工藝更便宜需要更少的專用設備。另外，預期厭氧過程比需氧過程給出更高的產物產率。在需氧條件下，通常生物質產率比厭氧條件下更高。因此，通常在需氧條件下，預期的產物產率比厭氧條件下更低。根據本發明人，本發明的工藝是目前為止開發出的首個使用包含L-阿拉伯糖來源的培養基的厭氧發酵工藝。在另一個優選的實施方案中，發酵工藝在處于氧限制的條件下進行。更優選地，發酵工藝是需氧的并處于氧限制的條件下。氧限制的發酵工藝是下述工藝，其中氧消耗受從氣體轉移至液體的氧的限制。通過進入氣流的量和組成以及使用的發酵設備的實際混合/質量轉移特性測定氧限制的程度。優選地，在處于氧限制條件下的工藝中，氧消耗的速率至少為5.5mmol/L/h,更優選地至少為6mmol/L/h，進一步更優選地至少為7mmol/IVh。發酵工藝優選地在對經修飾的細胞最適的溫度下進行。因此，對大部分酵母或真菌細胞而言，在少于42°C、優選地少于38"C的溫度下進行發酵工藝。對酵母或絲狀真菌宿主細胞而言，發酵工藝優選地在低于35、33、30或28。C的溫度下且高于20、22或25°C的溫度下進行。一種優選的工藝是用于生產乙醇的工藝，其中該工藝包括步驟(a)用本文定義的經修飾的宿主細胞發酵含有阿拉伯糖和可選的木糖來源的培養基；和可選地(b)回收乙醇。發酵培養基也可包含也被發酵為乙醇的葡萄糖來源。在一個優選的實施方案中，用于生產乙醇的發酵工藝是厭氧的。厭氧的在前文中已被定義。在另一個優選的實施方案中，用于生產乙醇的發酵工藝是需氧的。在另一個優選的實施方案中，用于生產乙醇的發酵工藝處于氧限制的條件下，更優選地處于需氧和氧限制的條件下。氧限制的條件在前文中已定義。在該工藝中，乙醇的體積生產力(productivity)優選地為每小時每升至少0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、5.0或10.0g乙醇。工藝中相對于L-阿拉伯糖和可選的木糖和/或葡萄糖的乙醇產率至少為20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或98%。乙醇產率在本文中被定義為理論最大產率的百分比，所述理論最大產率對葡萄糖和L-阿拉伯糖和可選的木糖而言為每g葡萄糖或木糖0.51g乙醇。在另一個優選的實施方案中，本發明涉及用于生產選自下組的發酵產物的工藝，該組由乳酸、3-羥基-丙酸、丙烯酸、乙酸、琥珀酸、檸檬酸、蘋果酸、延胡索酸、氨基酸、1,3-丙垸-二醇、乙烯、甘油、丁醇、^-內酰胺抗生素和頭孢菌素組成。該工藝優選地包括步驟(a)用上文定義的經修飾的宿主細胞發酵含有L-阿拉伯糖和可選的木糖來源的培養基；和可選地(b)回收所述發酵產物。在一種優選的工藝中，培養基還含有葡萄糖來源。在導致乙醇生產的本發明的發酵工藝中，可通過與已知的乙醇發酵工藝比較引證若干優點-厭氧工藝是可能的。-氧限制的條件也是可能的。-可獲得更高的乙醇產率和乙醇生產速率。-使用的菌株可能能夠使用L-阿拉伯糖和可選的木糖。除了上述發酵工藝外，提供了另一種發酵工藝作為本發明的另一方面，其中至少使用兩種不同的細胞發酵包含至少兩種選自下組的碳來源的碳源，該組由L-阿拉伯糖的來源、木糖來源和葡萄糖來源組成，但不僅限于此。在該發酵工藝中，"至少兩種不同的細胞"表示該工藝優選地是共同發酵工藝。在一個優選的實施方案中，使用兩種不同的細胞一種是如前文定義的本發明細胞，其能夠使用L-阿拉伯糖和/或將其轉化為L-核酮糖和/或5-磷酸木酮糖和/或期望的發酵產物如乙醇，并可選的能夠使用木糖；另一種是例如WO03/062430和/或WO06/009434中定義的菌株，其能夠使用木糖和/或將其轉化為期望的發酵產物如乙醇。能夠使用木糖的細胞優選地是如前文定義的顯示直接將木糖異構化為木酮糖(在一個步驟中)的能力的菌株。這兩種不同的菌株優選地在存在L-阿拉伯糖來源、木糖來源和可選的葡萄糖來源時被培養。可共同培養三種或更多不同的細胞，和/或可使用三種或更多碳來源，只要至少一種細胞能夠使用存在的至少一種碳來源和/或將其轉化為期望的發酵產物如乙醇即可。表述"使用至少一種碳來源"具有與表述"使用L-阿拉伯糖"相同的含義。表述"將其(即碳來源)轉化為期望的發酵產物"具有與表述"將L-阿拉伯糖轉化為期望的發酵產物"相同的含義。在一個優選的實施方案中，本發明涉及生產選自下組的發酵產物的工藝，該組由乙醇、乳酸、3-羥基-丙酸、丙烯酸、乙酸、琥珀酸、檸檬酸、蘋果酸、延胡索酸、氨基酸、1,3-丙垸-二醇、乙烯、甘油、丁醇、^-內酰胺抗生素和頭孢菌素組成，其中該工藝包括下述步驟(a)用前文定義的本發明的細胞和能夠使用木糖和/或顯示直接將木糖轉化為木酮糖的能力的細胞發酵培養基，所述培養基至少含有L-阿拉伯糖來源和木糖來源，其中各細胞將L-阿拉伯糖和/或木糖發酵為發酵產物，和可選地(b)回收所述發酵產物。上述發酵工藝的所有優選的實施方案也是該進一步發酵工藝的優選的實施方案鑒定發酵產物、鑒定L-阿拉伯糖來源和木糖來源、發酵條件(需氧或厭氧條件、氧限制的條件、進行該工藝的溫度、乙醇生產力、乙醇產率)。遺傳修飾為了在如上所述本發明的宿主細胞中過表達酶，以及為了宿主細胞(優選地為酵母)的其它遺傳修飾，通過本領域公知的方法用本發明的多種核酸構建體轉化宿主細胞。這類方法例如從標準手冊已知，例如SambrookandRussel(2001)"MolecularCloning:ALaboratoryManual(3rdedition),ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,或F.Ausubeletal,eds.，"Currentprotocolsinmolecularbiology",GreenPublishingandWileyInterscience,NewYork(1987)。用于真菌宿主細胞轉化和遺傳修飾的方法可從例如EP-A-0635574、WO98/46772、WO99/60102和WO00/37671已知。上文已描述了用于在本發明宿主細胞中過表達酶的核酸構建體中使用的啟動子。在用于過表達的核酸構建體中，編碼酶的核苷酸序列的3'-端優選地與轉錄終止子序列可操作地連接。優選地，該轉錄終止子序列在選擇的宿主細胞例如選擇的酵母細胞中可操作。在任何情況下，終止子的選擇不是關鍵性的；其可例如來自任何酵母基因，盡管如果來自非酵母的真核基因時終止子有時也可工作。轉錄終止序列還優選地包含多聚腺苷酸化信號。優選的終止子序列是醇脫氫酶(ADH1)和PGI1終止子。更優選地，ADHl和PGI1終止子均來自函v她e(分別為SEQIDNO:50和SEQIDNO:53)。可選地，可選擇的標記物可存在于核酸構建體中。本文使用術語"標記物"表示編碼性狀或表型的基因，所述性狀或表型允許選擇或篩選含有該標記物的宿主細胞。標記物基因可以是抗生素抗性基因，其中適當的抗生素可被用于從未被轉化的細胞中選擇經轉化的細胞。然而，優選地使用非抗生素抗性標記物，如營養缺陷標記物(URA3，TRP1,LEU2)。在一個優選的實施方案中，用核酸構建體轉化的宿主細胞是無標記基因的。用于構建無重組標記物基因宿主細胞的方法在EP-A-0635574中公開并且基于雙向標記物的使用。或者，可篩選的標記物如綠色熒光蛋白、lacZ、螢光素酶、氯霉素乙酰轉移酶、/3-葡萄糖苷酸酶可被摻入本發明的核酸構建體中，允許篩選經轉化的細胞。可存在于本發明核酸構建體中的可選的其它元件包括但不限于，一條或多條前導序列、增強子、整合因子和/或受體基因、內含子序列、著絲粒、調聚物和/或基質附著(MAR)序列。本發明的核酸構建體還可包含用于自主復制的序列，如ARS序列。合適的附加體核酸構建體可例如基于酵母的2p或pKDl(Fleeretal.,1991,Biotechnology9:968-975)質粒。或者，核酸構建體可包含用于整合的序列，優選地通過同源重組整合。這類序列因此可以是與宿主細胞基因組中用于整合的靶位點同源的序列。本發明的核酸構建體可以用本身已知的方式提供，所述方式通常涉及例如限制性酶切(restricting)和連接核酸/核酸序列的技術，針對該技術參考標準手冊例如SambrookandRussel(2001)"MolecularCloning:ALaboratoryManual(3rdedition),ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress.用于酵母或真菌中失活和基因破壞的方法是本領域公知的(見例如Fincham,1989，MicrobiolRev.53(1):148-70或EP-A-0635574)。在本文件及其權利要求中，動詞"包含"及其變化形式以其非限制性的含義使用，表示該詞后面的項目是包含在內的，但是不排除未明確提到的項目。另外，不定冠詞"一個/種"("a"或"an")涉及元素時不排除存在多于一個元素的可能性，除非上下文明確地要求存在且僅存在一個元素。因此，不定冠詞"一個/種"("a"或"an")通常表示"至少一個/種"。本發明還通過以下的實施例描述，所述實施例不應被解釋為限制本發明的范圍。實施例質粒和菌株構建菌株本工作中描述的消耗L-阿拉伯糖的SflcMaram少c&scerev^ae菌株基于菌株RWB220，其自身是RWB217的衍生物。RWB217是CEN.PK菌株，其中編碼戊糖磷酸途徑中酶表達的基因7M丄7、7XZJ、iP￡7、iA77已被過表達(Kuyperetal.,2005a)。另外，編碼醛糖還原酶(GM3)的基因已被缺失。菌株RWB217還含有兩種質粒單拷貝質粒，其帶有用于過表達木酮糖激酶(Xi:W)的Z五t/2標記物和附加體；多拷貝質粒，其帶有作為表達木酮糖異構酶義少"的標記物。針對在木糖上改善的生長對RWB217進行選擇步驟，這在Kuyperetal.(2005b)中描述。該步驟得到了兩種純凈的菌株RWB218(Kuyperetal.,2005b)和RWB219。RWB218和RWB219之間的差異是在選擇步驟后，通過在含葡萄糖作為碳源的礦物質培養基上涂布和重新劃線獲得RWB218，而對RWB219使用木糖作為碳源。將菌株RWB219在含葡萄糖作為碳源的YP(YPD)上非選擇性地培養，從而促進兩種質粒的丟失。涂布在YPD上后，通過在尿嘧啶和亮氨酸輔源營養上觀察，測試質粒丟失的單個菌落。用含有cre重組酶的pSH47轉化兩種質粒均丟失的菌株，從而去除整合過表達構建體后仍然存在的KanMX盒(Guldeneretal.,1996)。將帶有質粒的菌落重懸于含1。/。半乳糖的酵母蛋白胨培養基(YP)(10g/l酵母提取物和20g/l蛋白胨，均來自BDDifcoBelgium)中，在3(TC孵育1小時。將約200個細胞涂布在YPD上。針對KanMX標記物(G418抗性)和pSH47(t/^43)的丟失檢驗得到的菌落。然后將KanMX標記物和pSH47質粒均丟失的菌株命名為RWB220。為了獲得在本專利中測試的菌株，用pRW231和pRW243轉化RWB220，得到菌株IMSOOOl。在構建期間，菌株在復合的YP:10gl"酵母提取物(BDDifco)、20gI—1蛋白胨(BDDifco)上或在合成培養基(MY)(Verduynetal.,1992)上維持，所述培養基補充有葡萄糖(2%)作為碳源(YPD或MYD)并且在平板的情況下補充有1.5%瓊脂。用質粒轉化后，將菌株涂布在MYD上。酵母的轉化根據GietzandWoods(2002)進行。質粒在五化/^n'c/n'aco//菌株XL-lblue(Stratagene,LaJolla,CA，美國)上擴增。轉化根據Inoueetal.(1990)進行。五.co/z'在LB(Luria-Bertani)平板上或液體TB(TerrificBroth)培養基中培養，用于分離質粒(Sambrooketal，1989)。質粒為了在L-阿拉伯糖上生長，酵母需要表達三種不同的基因L-阿拉伯糖異構酶(AraA)、L-核酮糖激酶(AraB)和L-核酮糖-5-P-4-差向異構酶(AraD)(BeckerandBoles,2003)。在本工作中，我們選擇在cerev&ae中表達來自乳酸細菌丄actoZa"'〃Mp/a"ton/m的AraA、AraB禾口AraD。因為最終的目的是將L-阿拉伯糖與其它糖如D-木糖組合消耗，所以將編碼細菌L-阿拉伯糖途徑的基因與編碼D-木糖消耗的基因組合在同一質粒上。為了得到高水平的表達，將丄.//朋ton/wJra^和基因連接進帶有2/xXjL4的質粒pAKX002中。通過用Spel5，Ptdh3和5'AraAPtdh3擴增截短版的TDH3啟動子(SEQIDNO:49)、用Ptdh5，AraA和Tadh3，AraA擴增AraA基因和用3'AraATadhl和3'Tadhl-Spel擴增ADH1終止子(SEQIDNO:50)，構建AraA盒。從凝膠中提取三種片段并將其以大致等摩爾的量混合。使用Spel-5，Ptdh3和3'TadhlSpel寡聚體對該混合物進行PCR。凝膠純化得到的PTDH3-AraA-TADm盒，在5'和3'Spel位點切割，然后連接進用Nhel切割的pAKX002中，得到質粒pRW230。如下制造AraD構建體首先用寡聚體SalI5'Phxt7和5'AraDPhxt擴增截短版的HXT7啟動子(SEQIDNO:52)，用Phxt5，AraD禾口Tpgi3，AraD擴增AraD基因，和用3，AraDTpgi和3，TpgiSal1寡聚體擴增GPI1終止子(SEQIDNO:53)區。從凝膠中提取得到的片段并將其以大致等摩爾的量混合，然后使用SalI5，Phxt7和3，TpgilSa11寡聚體進行PCR。凝膠純化得到的PHXT7-AraD-Tpcu盒，在5'和3'Sail位點切割，然后連接進用XhoI切割的pRW230中，得到質粒pRW231(圖l)。因為L-核酮糖激酶的過高表達對生長是有害的(BeckerandBoles,2003)，所以將^ra^基因與編碼木酮糖激酶的XKS1基因組合在整合質粒上。為此，首先如下將p415ADHXKS(Kuyperetal.，2005a)改變為pRW229:用Pvul切割p415ADHXKS和pRS305二者，并將來自p415ADHXKS的含ADHXKS的Pvul片段與來自pRS305的載體主鏈連接，得到pRW229。通過用SacI5'Ppgil禾卩5'AraBPpgil寡聚體擴增PGI1啟動子，用Ppgi5，AraB和Tadh3，AraB寡聚體擴增AraB基因，和用3'AraBTadhl和3，TadhlSacI寡聚體擴增ADH1終止子，制造PGI1啟動子(SEQIDN0:51)和ADH1終止子(SEQIDNO:50)之間含有丄.；/朋ton/mAraB基因的盒。從凝膠中提取三種片段并將其以大致等摩爾的量混合。使用SacI-5，Ppgil和3TadhlSacI寡聚體對該混合物進行PCR。凝膠純化得到的PPGIl-AraB-TADH1盒，在5'和3'Sacl位點切割，然后連接進用Sacl切割的pRW22中，得到質粒pRW243(圖1)。用pRW231和pRW243(表2)轉化菌株RWB220，得到菌株IMSOOOl。限制性內切核酸酶(NewEnglandBiolabs，Beverly,MA,美國和Roche,Basel,瑞士)和DNA連接酶(Roche)根據制造商的說明使用。用Qiaprep離心小量制備試劑盒(Qiagen,Hilden,Germany)從五.co/z'分離質粒。在lxTBE(Sambrooketal,1989)中于1。/o瓊脂糖(Sigma,St.Louis,MO,美國)凝膠上分離DNA片段。用Qiaquick凝膠提取試劑盒(Quiagen)從凝膠上分離片段。AraA、AraB和AraD盒(的元件)的擴增根據制造商的說明用VentRDNA聚合酶(NewEnglandBiolabs)完成。啟動子和終止子的模板為ce"v&aeCEN.PK113-7D的染色體DNA，Ara基因的模板為丄acto^c"/t^戶/朋tommDSM20205的染色體DNA。聚合酶鏈式反應(PCR)在BiometraTGradientThermocycler(Biometra,G6ttingen,德國)中進行，使用一下的設置在55。C、60。C或65。C退火l分鐘，在75。C延伸1到3分鐘(取決于期望的片段長度)和在94'C變性1分鐘，進行30個循環。培養和培養基在3(TC于合成培養基(Verduyneta1.,1992)中進行搖瓶培養。滅菌前用2MKOH將培養基的pH調節至6.0。對固體合成培養基而言，添加1.5%瓊脂。通過用冷凍菌種培養物接種500-ml搖瓶中含適當糖的100ml培養基，制備預培養物。在30(TC于定軌搖床(200rpm)中孵育后，使用該培養物接種搖瓶培養物或發酵罐培養物。用于厭氧培養的合成培養基補充有溶于乙醇中的0.42gl-1Tween80和0.01gI—1麥角固醇(AndreasenandStier，1953;AndreasenandStier,1954)。厭氧(程序化)分批培養在30。C下于工作體積為1升的2升實驗室發酵罐(Applikon，Schiedam,瑞士)中進行。通過自動添加2MKOH將培養物pH維持在pH5.0。以800rpm攪拌培養物，并用0.51min—1的氮氣鼓泡"10ppm氧)。為了最小化氧的擴散，對發酵耀裝酉己Norprene車俞送管(ColePalmerInstrumentcompany,VernonHills,USA)。用氧電極(Applisens,Schiedam,荷蘭)監測溶解氧。通過以約0.051min"頂空充氣在相同的實驗裝置中達到氧限制的條件。干重的測定在預先稱重的硝酸纖維素濾紙(孔徑0.451m;Gelmanlaboratory,AnnArbor,USA)上過濾培養物樣品(IO.Oml)。去除培養基后，用去離子水洗滌濾紙并在微波爐(Bosch,Stuttgart,德國)中于360W干燥20分鐘并稱重。一式兩份的測定變化小于1%。氣體分析在冷凝器(2。C)中冷卻排出氣，并用MD-110-48P-4型Permapure干燥器(Permapure，TomsRiver，USA)干燥。用NGA2000分析儀(RosemountAnalytical,Orrville,USA)測定02和(302濃度。如先前所述(VanUrketal.,1988;Weusthuisetal.,1994)測定排出氣體流速和氧的比消耗速率與二氧化碳的比生產速率。在計算這些生物質-比速率時，考慮由取出培養物樣品引起的體積改變。代謝物分析使用WatersAlliance2690HPLC(Waters,Milford,USA)通過HPLC分析葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、木糖醇、有機酸、甘油和乙醇，所述設備裝配有BioRadHPX87H柱(BioRad,Hercules,USA)、Waters2410趨光指數檢測器和Waters2487UV檢測器。在60。C下用0.5gl—1的硫酸以0.6mlmin-1的流速洗脫柱。對5-磷酸木酮糖的測定(ZaldivarJ.,etal,Appl.Microbiol.Biotechnol.,(2002),59:436-442)為了分析細胞內代謝產物如5-磷酸木酮糖，在葡萄糖耗盡之前(培養的第22和26小時)和葡萄糖耗盡之后(培養的42、79和131小時)從反應器中一式兩份手機5ml培養液。用于停止代謝、固相提取代謝產物和分析的步驟已由SmitsH.P.etal.(Anal.Biochem"261:36-42,(1998))詳細描述。然而，通過高壓離子交換色譜的分析被輕微修飾，所述高壓離子交換色譜與用于分析細胞提取物的脈沖安培檢測偶聯。使用的溶液為洗脫液A、75mMNaOH和洗脫液B、500mMNaAc。為了防止洗脫液中碳酸鹽的污染，使用具有低碳酸鹽濃度的NaOH溶液(BakerAnalysed,Deventer,荷蘭)代替NaOH塊。用氦(He)將洗脫液脫氣30分鐘，，然后保持在氦氣壓下。將梯度泵編程為產生以下的梯度100。/。A和0y。B(0分鐘)，A到70%的線性降低和8到30%的線性提高(0-30分鐘)，A到30。/。的線性降低和B到70%的線性提高(30-70分鐘)，A至U0的線性降低和B到100%的線性提高(70-75分鐘)，0%八和100%B(75-85分鐘)，A到100%的線性提高和B到0%的線性降低(85-95分鐘)。流動相以1ml/分鐘的流速移動。其它條件根據Smitsetal.(1998)。碳回收碳回收被計算為形成的產物中的碳除以消耗的糖碳總量，并且基于48%的生物質碳含量。為了針對發酵其間的乙醇蒸發進行校正，推測產生的乙醇量等于測量的累計C02生產減去由于生物質合成而發生的C02生產(每克生物質5.85mmolC02(Verduynetal.,1990))和與乙酸鹽形成相關的C02生產。針對在L-阿拉伯糖上的生長進行選擇根據上述步驟構建菌株IMS0001(CBS120327，在27/09/06保藏于CBS)，其含有編碼木糖(XylA和XKS1)和阿拉伯糖(AraA、AraB、AraD)二者代謝途徑的基因。盡管能夠在木糖上生長(數據未顯示)，但是菌株IMS0001似乎不能在補充有2%L-阿拉伯糖的固體合成培養基上生長。通過在搖瓶中的系列轉移和通過在發酵罐中的程序化分批培養(SBR)選擇能夠利用L-阿拉伯糖作為碳源生長的IMS0001突變體。對系列轉移實驗而言，用菌株IMSOOOl或參考菌株RWB219接種含有100ml合成培養基的500-ml搖瓶，所述培養基含有0.5%半乳糖。72小時后，在3.0的660nm吸光度下，使用培養物接種新的搖瓶，其含有0.1%半乳糖和2%阿拉伯糖。基于用D-核酮糖作為校準標準的HPLC測定，測定了在菌株IMS0001的第一次培養中，在含半乳糖/阿拉伯糖混合物的培養基上，部分阿拉伯糖己被轉化為核酮糖并隨后分泌至上清液中。使用WatersAlliance2690HPLC(Waters,Milford，USA)進行這些HPLC分析，所述設備裝配有BioRadHPX87H柱(BioRad，Hercules,USA)、Waters2410趨光指數檢測器和Waters2487UV檢測器。在6(TC下用0.5gl—1的硫酸以0.6mlmin—1的流速洗脫柱。與參考菌株RWB219相反，菌株IMSOOOl培養物的OD66o在耗盡半乳糖后提高。當觀察到菌株IMSOOOl在阿拉伯糖上生長約850個小時后(圖2)，將該培養物以1.7的OD,轉移至含2%阿拉伯糖的搖瓶中。然后將培養物以2-3的OD,先后順序至含2%阿拉伯糖的信箱培養基中，通過間斷地用HPLC測量阿拉伯糖濃度證實阿拉伯糖的利用(數據未顯示)。在約3600小時內這些培養物的生長速率從0提高至0.15h"(圖3)。通過用100ml搖瓶培養物接種1升補充有2%阿拉伯糖的合成培養基，開始在氧限制條件下的分批發酵，所述搖瓶培養物是阿拉伯糖培養的IMSOOOl細胞的搖瓶培養物，其以約0.12h—1的最大生長速率在2%ofL-阿拉伯糖上生長。當觀察到在阿拉伯糖上生長時，通過用氮氣鼓泡對培養物加以厭氧條件。通過手動或自動地將90%的培養物替換為含20gr1阿拉伯糖的合成培養基，開始厭氧分批培養的順序循環。對SBR發酵期間的每個循環而言，從C02譜估計指數生長速率(圖4)。在13個循環中，指數生長速率從0.025h"提高至0.08h"。20個循環后取樣，涂布在補充有2%1^-阿拉伯糖的固體合成培養基上，并在3(TC孵育數天。在含L-阿拉伯糖的固體合成培養基上將分離的菌落再劃線兩次。最后，用單個菌落接種含有含2%L-阿拉伯糖的合成培養基的搖瓶，并在3(TC孵育5天。該培養物被命名為菌株IMS0002(CBS120328，在27/09/06保藏于CentraalBureauvoorSchimmdculturen(CBS))。采取培養物樣品，添加30%甘油并將樣品儲存于-80。C下。混合培養物發酵生物質水解產物是工業生物技術期望的原料，其含有由多種糖組成的復雜混合物，所述糖中葡萄糖、木糖和阿拉伯糖通常存在于顯著的級分中。為了完成葡萄糖和阿拉伯糖以及木糖的乙醇發酵，用阿拉伯糖發酵菌株IMS0002和木糖發酵菌株RWB218的混合培養物進行厭氧分批發酵。用100ml菌株IMS0002的預培養物接種含800ml合成培養基的厭氧分批發酵罐，所述合成培養基含有30gr1d-葡萄糖、15gr1d-木糖和15gr1L-阿拉伯糖。10小時后添加100mlRWB218接種物。與僅用菌株IMS0002進行混合糖發酵相反，在葡萄糖耗盡后木糖和阿拉伯糖均被消耗(圖5D)。混合培養完全消耗了所有的糖，并且在80小時內以0.42gg—1糖的高總產率生產了564.0±6.3mmolI—1乙醇(從(302生產計算)。木糖醇僅小量產生，濃度為4.7mmol1"。對菌株IMS0002的表征在合成培養基上厭氧分批發酵期間測定菌株IMS0002的生長和產物形成，所述培養基含有L-阿拉伯糖作為唯一的碳源，或含有葡萄糖、木糖和L-阿拉伯糖的混合物。在含有100ml含2%L-阿拉伯糖的合成培養基的搖瓶中，通過用菌株IMS0002的-80。C冷凍菌種接種并在3(TC下孵育48小時，制備用于該厭氧分批發酵的預培養物。圖5A顯示在約70小時的厭氧分批發酵期間，菌株IMS0002能夠將20gl"L-阿拉伯糖發酵為乙醇。使用L-阿拉伯糖作為唯一碳源時，厭氧條件下的比生長速率為0.05±0.001h—1。考慮到分批發酵期間的乙醇蒸發，來自20gr1阿拉伯糖的乙醇產率為0.43±0.003gg"。不進行蒸發校正時，乙醇產率為0.35±0.01gg"阿拉伯糖。在阿拉伯糖上的厭氧生長期間未觀察到阿拉伯糖醇的形成。在圖5B中，展示了菌株IMS0002對20g1"葡萄糖和20g1"L-阿拉伯糖的混合物的乙醇發酵。葡萄糖耗盡后開始消耗L-阿拉伯糖。在70小時內，葡萄糖和L-阿拉伯糖均被完全消耗。來自總糖的乙醇產率為0.42±0扁gg-1。在圖5C中，展示了菌株IMS0002對30gl"葡萄糖、15gl"D-木糖和15gr1L-阿拉伯糖的混合物的發酵模式。在80小時內，葡萄糖和阿拉伯糖均被完全消耗。100mM木糖中僅20mM被菌株IMS0002消耗。另外，觀察到20mM木糖醇的形成。明顯地，木糖被菌株IMS0002轉化為木糖醇。因此，來自總糖的乙醇產率低于上述發酵0.38±0.001gg—1。來自總葡萄糖和阿拉伯糖的乙醇產率與其它發酵相似0.43±0.001gg—1。表1顯示了針對菌株IMS0002的厭氧分批發酵觀察的阿拉伯糖消耗速率和乙醇生產速率。阿拉伯糖以0.23-0.75gh"g"生物質干重的速率被消耗。從阿拉伯糖生產乙醇的速率從0.08到0.31gh—1g"生物質干重變化。最初，構建的菌株IMS0001能夠發酵木糖(數據未顯示)。與我們的預期相反，所選擇的菌株IMS0002不能將木糖發酵為乙醇(圖5C)。為了重新獲取發酵木糖的能力，將菌株IMS0002的菌落轉移至含2%D-木糖的固體合成培養基上，并在厭氧罐中于3(TC下孵育25天。隨后再次將菌落轉移至含2%阿拉伯糖的固體合成培養基上。在3(TC孵育4天后，將菌落轉移至含合成培養基的搖瓶中，所述合成培養基含2%阿拉伯糖。在30。C孵育6天后，添加30%的甘油，取樣并儲存于-8(TC下。用這樣的冷凍菌種接種搖瓶并用作在含20gr1木糖和20gr1阿拉伯糖的合成培養基上厭氧分批發酵的預培養物，所述搖瓶含有100ml含2%阿拉伯糖的合成培養基。在圖6中，顯示了該分批發酵的發酵模式。木糖和阿拉伯糖同時被消耗。阿拉伯糖在70小時內被耗盡，而木糖在120小時內被耗盡。從總糖中至少生產了250mM乙醇，未計入乙醇的蒸發。假設3.2gI—1的最終生物質干重(假設0.08gg"糖的生物質產率)，則由累計的C02生產(355mmoll")評價的最終乙醇濃度約為330mmol1"，對應于0.41gg—1戊糖的乙醇產率。除了乙醇、甘油和有機酸外，產生了小量的木糖醇(約5mM)。菌株IMS0003的選擇最初，構建的菌株IMS0001能夠發酵木糖(數據未顯示)。與我們的預期相反，所選擇的菌株IMS0002不能將木糖發酵為乙醇(圖5C)。為了重新獲取發酵木糖的能力，將菌株ims0002的菌落轉移至含2%D-木糖的固體合成培養基上，并在厭氧罐中于3(TC下孵育25天。隨后再次將菌落轉移至含2%阿拉伯糖的固體合成培養基上。在3(TC孵育4天后，將菌落轉移至含合成培養基的搖瓶中，所述合成培養基含2%阿拉伯糖。在30'C孵育6天后，添加30%的甘油，取樣并儲存于-8(TC下。將來自于該冷凍菌種的樣品在含2%L-阿拉伯糖的固體合成培養基上涂布，并在3(TC孵育數天。在含L-阿拉伯糖的固體合成培養基上將分離的菌落再劃線兩次。最后，用單個菌落接種含有含2"/。L-阿拉伯糖的合成培養基的搖瓶，并在30"C孵育4天。該培養物被命名為菌株IMS0003(CBS121879，在20/09/07保藏于CBS)。采取培養物樣品，添加30%甘油并將樣品儲存于-8(TC下。對菌株ims0003的表征在合成培養基上厭氧分批發酵期間測定菌株ims0003的生長和產物形成，所述培養基含有30gr1葡萄糖、15gr1d-木糖和15gr1l-阿拉伯糖的混合物。在含有100ml含2e/。L-阿拉伯糖的合成培養基的搖瓶中，通過用菌株IMS0003的-80。C冷凍菌種接種并在30'C下孵育48小時，制備用于該厭氧分批發酵的預培養物。在圖7中，顯示了菌株IMS0003對30g1"葡萄糖、15gr1D-木糖和15gr1L-阿拉伯糖混合物的發酵模式。葡萄糖耗盡后開始消耗阿拉伯糖。在70小時內，葡萄糖、木糖和阿拉伯糖均被完全消耗。木糖和阿拉伯糖被同時消耗。從總糖中至少產生406mM乙醇，未計入乙醇的蒸發。從累計的C02生產計算的最終乙醇濃度為572mmolr1，對應于0.46gg"總糖的乙醇產率。與菌株IMS0002(圖5C)或菌株IMS0002和RWB218的混合培養物(圖5D)對葡萄糖、木糖和阿拉伯糖混合物的發酵相反，菌株IMS0003不產生可檢測量的木糖醇。表格表1:使用的》S.Cgrg由'"e菌株。_<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>qeth，ara:在阿拉伯糖上生長期間的乙醇比生產速率<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>參考文獻列表AndreasenAA,StierTJ(1954)Anaerobicnutritionof&cc/aram_ycesII.Unsaturatedfattyacidrequirementforgrowthinadefinedmedium.JCellPhysiol43:271-281AndreasenAA,StierTJ(1953)AnaerobicnutritionofSacc/^ramycescere由'fle.I.Ergosterolrequirementforgrowthinadefinedmedium.JCellPhysiol41:23-36BeckerJ,BolesE(2003)Amodified5"acc/zara，cascere由'aestrainthatconsumesL-Arabinoseandproducesethanol.ApplEnvironMicrobiol69:4144-4150GietzR.D.,SuginoA.(1988).Newyeast-￡^c/zen'Cco/fshuttlevectorsconstructedwithinvitromutagenizedyeastgeneslackingsix-basepairrestrictionsites.Gene74:527-534,Gietz,R.D.,andR.A.Woods.2002.Transformationofyeastbylithiumacetate/single-strandedcarrierDNA/polyethyleneglycolmethod.MethodsEnzymol.350:87-96.GuldenerU，HeckS，FielderT,BeinhauerJ,HegemannJH.(1996)Anewefficientgenedisruptioncassetteforrepeateduseinbuddingyeast.NucleicAcidsRes.1996Jull;24(13):2519-24.HaufJ,ZimmermannFK,MullerS.SimultaneousgenomicoverexpressionofsevenglycolyticenzymesintheyeastSaccharomycescerevisiae.EnzymeMicrobTechnol.2000Jun1;26(9-10):688-698.InoueH.,H.NojimaandH.Okayama,Highefficiencytransformationof五sc/^n'c/iz'aco/Zwithplasmids.Gewe96(1990),pp.23—28KuyperM,HartogMMP,ToirkensMJ,AlmeringMJH，WinklerAA,VanDijkenJP,PronkJT(2005a)Metabolicengineeringofaxylose-isomerase-expressing/S"acc/wra，cas1cerev^z'aestrainforrapidanaerobicxylosefermentation.FemsYeastResearch5:399-409KuyperM,ToirkensMJ,DiderichJA，WinklerAA，VanDijkenJP，PronkJT(2005b)Evolutionaryengineeringofmixed-sugarutilizationbyaxylose-fermenting5"accAaro附少cascerev/Waestrain.FemsYeastResearch5:925-934Sambrook，K.，Fritsch,E.F.andManiatis,I.(1989)MolecularCloning:ALaboratoryManual,2ndedn.ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY.VanUrkH,MakPR,ScheffersWA,VanDijkenJP(1988)MetabolicresponsesofSaccAaromycescereWw'aeCBS8066andCVmd/c/aM礎sCBS621upontransitionfromglucoselimitationtoglucoseexcess.Yeast4:283-291VerduynC,PostmaE，ScheffersWA,VanDijkenJP(1990)Physiologyof5"flcc/^函ycescereWWaeinanaerobicglucose-limitedchemostatcultures.JGenMicrobiol136:395-403VerduynC,PostmaE，ScheffersWA,VanDijkenJP(1992)Effectofbenzoicacidonmetabolicfluxesinyeasts:acontinuous-culturestudyontheregulationofrespirationandalcoholicfermentation.Yeast8:501-517WeusthuisRA,VisserW,PronkJT,ScheffersWA,VanDijkenJP(1994)Effectsofoxygenlimitationonsugarmetabolisminyeasts-acontinuous-culturestudyoftheKluyvereffect.Microbiology140:703-71權利要求1.能夠表達以下核苷酸序列的真核細胞，其中這些核苷酸序列的表達賦予細胞使用L-阿拉伯糖和/或將L-阿拉伯糖轉化為L-核酮糖和/或5-磷酸木酮糖和/或轉化為期望的發酵產物的能力(a)編碼阿拉伯糖異構酶(araA)的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列選自由以下組成的組i.編碼araA的核苷酸序列，所述araA包含與SEQIDNO1的氨基酸序列具有至少55％序列同一性的氨基酸序列，ii.核苷酸序列，其包含與SEQIDNO2的核苷酸序列具有至少60％序列同一性的核苷酸序列，iii.核苷酸序列，其互補鏈與(i)或(ii)的序列的核酸分子雜交，iv.核苷酸序列，其序列由于遺傳密碼子的簡并性而與(iii)的核酸分子的序列不同；(b)編碼L-核酮糖激酶(araB)的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列選自由以下組成的組i.編碼araB的核苷酸序列，所述araB包含與SEQIDNO3的氨基酸序列具有至少20％序列同一性的氨基酸序列，ii.核苷酸序列，其包含與SEQIDNO4的核苷酸序列具有至少50％序列同一性的核苷酸序列，iii.核苷酸序列，其互補鏈與(i)或(ii)的序列的核酸分子雜交，iv.核苷酸序列，其序列由于遺傳密碼子的簡并性而與(iii)的核酸分子的序列不同；(c)編碼L-核酮糖-5-P-4-差向異構酶(araD)的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列選自由以下組成的組i.編碼araD的核苷酸序列，所述araD包含與SEQIDNO5的氨基酸序列具有至少60％序列同一性的氨基酸序列，ii.核苷酸序列，其包含與SEQIDNO6的核苷酸序列具有至少60％序列同一性的核苷酸序列，iii.核苷酸序列，其互補鏈與(i)或(ii)的序列的核酸分子雜交，iv.核苷酸序列，其序列由于遺傳密碼子的簡并性而與(iii)的核酸分子的序列不同。2.根據權利要求1的細胞，其中所述ara^、"ra^和arai)核苷酸序列中的一個、兩個或三個來源于丄flctoZ^c說w的屬，優選地來源于丄acto6flc/〃ws//awtorwm的禾中。3.根據權利要求1或2的細胞，其中所述細胞是酵母細胞，優選地屬f以"F員t^":iSacc/arom少cas1、A7M_yverom_yc^s、C*awizV/a、/^'c/n'"、4.根據權利要求3的細胞，其中所述酵母細胞屬于以下種之一&/fldKmfl07.fl"ws或iC5.根據權利要求1到4中任一項的細胞，其中編碼araA、araB禾口/或amD的核苷酸序列與下述啟動子可操作地連接，所述啟動子引起相應的核苷酸序列在所述細胞中的充分表達，從而賦予細胞使用L-阿拉伯糖和/或將L-阿拉伯糖轉化為L-核酮糖和/或5-磷酸木酮糖和/或期望的發酵產物的能力。6.根據權利要求1到5中任一項的細胞，其中所述細胞顯示直接將木糖異構化為木酮糖的能力。7.根據權利要求6的細胞，其中所述細胞包含遺傳修飾，所述遺傳修飾能提高戊糖磷酸途徑的通量。8.根據權利要求6或7的細胞，其中所述遺傳修飾包括過表達戊糖磷酸途徑非氧化部分的至少一個基因。9.根據權利要求8的細胞，其中所述基因選自由以下組成的組編碼5-磷酸核酮糖異構酶、5-磷酸核酮糖差向異構酶、轉酮酶和轉醛酶的基因。10.根據權利要求8的細胞，其中所述遺傳修飾包括至少過表達編碼轉酮酶和轉醛酶的基因。11.根據權利要求8到10中任一項的細胞，其中該細胞還包括提高木酮糖激酶比活性的遺傳修飾。12.根據權利要求11的細胞，其中所述遺傳修飾包括過表達編碼木酮糖激酶的基因。13.根據權利要求8到12中任一項的細胞，其中被過表達的所述基因對所述細胞而言是內源的。14.根據權利要求5到13中任一項的細胞，其中所述細胞包含降低所述細胞中非特異性醛糖還原酶活性的遺傳修飾。15.根據權利要求14的細胞，其中所述遺傳修飾降低編碼非特異性醛糖還原酶基因的表達，或使所述基因失活。16.根據權利要求15的細胞，其中通過缺失所述基因的至少部分或通過破壞所述基因，使該基因失活。17.根據權利要求14或15的細胞，其中編碼非特異性醛糖還原酶的每個基因在所述細胞中的表達被降低或失活。18.根據前述權利要求中任一項的細胞，其中所述發酵產物選自由以下組成的組乙醇、乳酸、3-羥基-丙酸、丙烯酸、乙酸、琥珀酸、檸檬酸、蘋果酸、延胡索酸、氨基酸、1,3-丙垸-二醇、乙烯、甘油、丁醇、/3-內酰胺抗生素和頭孢菌素。19.包含下述核酸序列的核酸構建體編碼araA的核酸序列、編碼araB的核酸序列和/或編碼amD的核酸序列，所有所述的核酸序列均如權利要求1或2中所定義。20.用于生產選自下組的發酵產物的工藝，所述組由乙醇、乳酸、3-羥基-丙酸、丙烯酸、乙酸、琥珀酸、檸檬酸、蘋果酸、延胡索酸、氨基酸、1,3-丙烷-二醇、乙烯、甘油、丁醇、/5-內酰胺抗生素和頭孢菌素組成，所述工藝包括(a)用權利要求1到18中任一項中定義的經修飾的細胞來發酵培養基，所述培養基含有阿拉伯糖來源和可選的木糖來源，從而所述細胞將阿拉伯糖和可選的木糖發酵為發酵產物；和可選地(b)回收所述發酵產物。21.用于生產選自下組的發酵產物的工藝，所述組由乙醇、乳酸、3-羥基-丙酸、丙烯酸、'乙酸、琥珀酸、檸檬酸、蘋果酸、延胡索酸、氨基酸、1,3-丙垸-二醇、乙烯、甘油、丁醇、P-內酰胺抗生素和頭孢菌素組成，所述工藝包括(a)用權利要求1到18中任一項中定義細胞的和能夠使用木糖和/或顯示將木糖直接異構化為木酮糖的能力的細胞來發酵培養基，所述培養基至少含有阿拉伯糖來源和木糖來源，從而每種細胞都能將阿拉伯糖和/或木糖發酵為發酵產物；和可選地(b)回收所述發酵產物。22.根據權利要求20或21的工藝，其中所述培養基還含有葡萄糖來源。23.根據權利要求20到22中任一項的工藝，其中所述發酵產物是乙醇。24.根據權利要求23的工藝，其中所述乙醇體積生產力為至少每小時每升0.5g乙醇。25.根據權利要求23或24的工藝，其中所述乙醇產率為至少30%。26.根據權利要求20到25中任一項的工藝，其中所述工藝是厭氧的。27.根據權利要求20到25中任一項的工藝，其中所述工藝是需氧的，優選地在氧氣受限的條件下進行。全文摘要本發明涉及表達下述多核苷酸序列的真核細胞，所述序列編碼araA、araB和araD酶，從而這些核苷酸序列的表達賦予細胞使用L-阿拉伯糖和/或將L-阿拉伯糖轉化為L-核酮糖和/或5-磷酸木酮糖和/或轉化為期望的發酵產物如乙醇的能力。任選地，該真核細胞還能夠將木糖轉化為乙醇。文檔編號C12N1/18GK101522886SQ200780036866公開日2009年9月2日申請日期2007年10月1日優先權日2006年10月2日發明者亞倫·阿迪瑞安·文科勒,安東尼斯·杰若恩·阿迪瑞安·馬里斯·范,強漢斯·漢迪瑞克·溫迪·德,強漢斯·皮埃特·范迪肯,漢迪瑞克·烏特爾·威塞林克,雅各布斯·托馬斯·普若克申請人:帝斯曼知識產權資產管理有限公司