專利名稱：三黃雞B淋巴細胞刺激因子cDNA及其克隆方法和重組應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物基因工程領域，具體涉及三黃雞B淋巴細胞刺激因子cDNA 及其克隆、表達技術。
技術背景人B淋巴細胞刺激因子(hBAFF)是1999年新發現的一種與人體免疫調控 密切相關的腫瘤壞死因子家族成員，主要在外周血單核細胞、脾臟、淋巴結和骨 髓中表達。hBAFF具有很強的B細胞趨化性，體外它作為B細胞增殖和分化的 共刺激因子，能誘導活化的B細胞分泌大量的IgG、 IgA、 IgM等，對于休眠B 細胞，hBAFF雖不能獨立激活使之進入細胞周期循環，但通過上調細胞表面的抗 凋亡蛋白Bcl-2、 Bcl-XL的表達，延長休眠B細胞的壽命。體內它可以促進脾臟 內Tl-B細胞向T2-B細胞以及成熟B細胞的發育。hBAFF的正常表達是GC形 成、抗體親和力成熟、記憶性B細胞形成及B細胞正常發育的必須條件。BAFF-/-小鼠的次級淋巴器官囊外及過渡區B細胞完全缺失。hBAFF刺激B細胞增殖、 分化并分泌抗體，成熟的B細胞及其產生的抗體構成了機體抵御感染和抑制腫 瘤滋生的關鍵組分。由于hBAFF的免疫增強特異活性，自從被發現以來就顯示 了巨大的臨床應用前景。2000年11月，美國FDA已正式批準重組人hBAFF進 入人體臨床試驗，用于治療普通變異免疫缺乏癥(CVID)患者。根據GenBank、EMBL和DDBJ國際三大主要核酸序列數據庫搜索結果得知， 目前只有人、鼠、平原雞、鴨、鵝的BAFF cDNA已被克隆，并分別已在GenBank 數據庫中申請了序列號，序列號分別是AF116456、 AF119383、 AF506010、 DQ445092及DQ874394。三黃雞B淋巴細胞刺激因子(cycBAFF)cDNA還未被克 隆出來，關于三黃雞BAFF基因的研究在整個國內外還處于完全空白狀態。三黃 雞是有著十分重要經濟價值的禽類，由于B淋巴細胞刺激因子(BAFF)具有較強 的免疫增強能力，基因工程三黃雞BAFF蛋白有可能開發成一種能增強三黃雞類 免疫能力的生物制劑，用于體質弱、免疫功能低下的病三黃雞，增加三黃雞類抗病毒能力，尤其是在禽流感對人類己構成威脅的今天。近年來,隨著對細胞因子研究的不斷深入和分子生物學技術的發展，大量的禽類細胞因子得以克隆及重組表達，許多細胞因子基因工程藥物面市，給治療禽類疾病提供了新的手段,同時創造了巨大的經濟和社會效益，因此，重組三黃雞BAFF蛋白具有潛在的巨大市場應用價值。同時，B淋巴細胞刺激因子(BAFF)是新發現的免疫系統重要調控因子,對三黃雞BAFF的研究有助于探索三黃雞類的免疫調控機制，推動其免疫系統研究的發展。發明內容本發明針對現有技術的不足，提供一種從三黃雞提取的B淋巴細胞刺激因子cDNA，并提供三黃雞B淋巴細胞刺激因子cDNA的克隆方法及重組技術。 本發明從三黃雞中克隆到B淋巴細胞刺激因子cDNA,它具有SEQ ID NO.l所示的序列。三黃雞B淋巴細胞刺激因子，它具有SEQ ID N0.2所示的序列。 本發明的三黃雞B淋巴細胞刺激因子cDNA的克隆方法如下-(1) 根據平原雞，鴨B淋巴細胞刺激因子的保守序列設計引物 正義寡核苷酸引物cycBAFFl 5，- ATGAAATCCGTGGACTG -3， 反義寡核苷酸引物cycBAFF2: 5，- TCAGAGGAGTCTAACTGC -3，(2) 從三黃雞脾臟提取總RNA，(3) 通過RT-PCR方法，以上述引物cycBAFFl及cycBAFF2為特異性引 物，擴增出一段cDNA序列，克隆入pMD18-T載體，并對其堿基序列進行測定，上述三黃雞B淋巴細胞刺激因子cDNA的克隆方法具體操作如下(1) 根據B淋巴細胞刺激因子全長cDNA兩段高保守區域設計同源克隆的 正義寡核苷酸引物cycBAFFl (5'- ATGAAATCCGTGGACTG -3')與反義寡核 苷酸引物cycBAFF2 (5，- TCAGAGGAGTCTAACTGC -3，)，(2) 應用RNA抽提試劑TRIzol(Invitrogen公司)，按照操作手冊，提取出 三黃雞脾臟細胞的總RNA,(3) 應用RT-PCR方法，以上述cycBAFFl及cycBAFF2為特異性引物， 擴增出一段cDNA序列，全長為864bp，克隆入pMD18-T載體，并對其堿基序 列進行測定。RT-PCR的反應條件為以總RNA為模板，在50nl反應體系中， 加入5xRT-PCR反應緩沖液10^1、 25mM MgS042nl、 10mM dNTP混合物1^1、20nM的上下游引物各2.5^1、 AMV逆轉錄酶(Takara公司)1^1、 TflDNA聚合 酶1^1及RNA模板2^1，補水至50^1。 RT-PCR循環參數為48'C逆轉錄45min， 94'C變性2min，再進行29個PCR循環(94。C變性30s， 56。C退火30s, 72。C延 伸30s)，最后于72'C延伸7min。 RT-PCR產物用1 %的瓊脂糖凝膠電泳分離后， 用膠回收試劑盒回收約914bp的DNA條帶，克隆入pMD18-T載體，挑取8個 陽性克隆進行堿基序列測定。將所得序列與GenBank數據庫序列進行相似性搜索，發現與已知的鴨、平 原雞、人、鼠BAFF序列相似率最高，可以確定該序列是三黃雞B淋巴細胞刺 激因子(cycBAFF)的全長cDNA，其開放閱讀框如SEQ ID NO.l所示。對該基因的進一步研究表明該基因編碼的蛋白對三黃雞B淋巴細胞具有 明顯的促存活/增殖效應；充分表明本發明克隆得到的基因就是三黃雞B淋巴細 胞刺激因子(cycBAFF)的cDNA。上述三黃雞B淋巴細胞刺激因子(cycBAFF)的cDNA的重組應用，通過現有基 因工程方法，生產重組cycBAFF，作為三黃雞類免疫增強劑。所說的三黃雞B淋巴細胞刺激因子cDNA通過現有基因工程方法，轉入三 黃雞體內，增加其免疫力，在詞養中應用。
圖l是cycBAFF全長cDNA的克隆過程示意圖；箭頭代表引物位置；全長cDNA共914bp。圖2是cycBAFF全長cDNA堿基序列及推測編碼氨基酸序列。 圖3是cycBAFF與鴨、雞、人、鼠BAFF全長氨基酸序列同源性比較圖。其中陰影代表保守的氨基酸；箭頭所指代表弗林蛋白酶識別位點，切割后的C端為BAFF的胞外可溶功能區。圖4是融合蛋白His-cycsBAFF在BL21(DE3)中的誘導表達，Ni+柱純化的 SGS-PAGE鑒定及鼠抗His6-tag的western-blotting鑒定結果，A圖中條帶1是 未經IPTG誘導4.5小時后的全菌蛋白，2是經IPTG誘導的全菌蛋白，3是超聲 裂解后上清，4是超聲裂解后沉淀，5是經N產-NTA純化后的目的蛋白，6是經 Binding buffer(含6M Urea)溶解后的包涵體蛋白，7是復性后目的蛋白，8是經 Ni2+-NTA純化后目的蛋白的Western blot。圖5是本發明克隆的基因對三黃雞B淋巴細胞的促存活作用結果示意圖。圖說明不同濃度的His- cycsBAFF單獨刺激和與PMA共刺激相對于對照BSA和 PMA在作用三黃雞B淋巴細胞24小時后，對三黃雞B淋巴細胞可見顯著的促 存活作用，且呈劑量依賴效應。。
具體實施方式
在本發明中所使用的術語，除非有另外說明， 一般具有本領域普通技術人員 通常理解的含義。下面結合具體的制備實施例和應用實施例，并參照數據進一步詳細地描述本 發明。應理解，這些實施例只是為了舉例說明本發明，而非以任何方式限制本發 明的范圍。在以下的實施例中，未詳細描述的各種過程和方法是本領域中公知的常規方 法。所用到的引物，均在首次出現時標明，其后所用相同引物，均以首次標明的 內容相同。 實施例l:三黃雞(Chinese 3-Yellow chicken),人工飼養。(1) 引物設計應用ClustalX軟件對己克隆出的人、鼠、平原雞、鴨、鵝 B淋巴細胞刺激因子全長cDNA序列進行同源性比對分析，精心選取出兩段高保 守區域用來設計同源克隆的正義寡核苷酸引物cycBAFFl : 5'-ATGAAATCCGTGGACTG -3，；反義寡核苷酸引物cycBAFF2 : 5，-TCAGAGGAGTCTAACTGC -3'(2) 提取總RNA:應用RNA抽提試劑TRIzol (Invitrogen公司)按照其操作 手冊提取出約0.5克三黃雞脾臟細胞的總RNA，并通過甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳 鑒定其質量和純度，紫外分光光度計測定其濃度。(3) 應用RT-PCR方法，以上述cycBAFFl及cycBAFF2為特異性引物，擴 增出cycBAFFcDNA的一段序列，全長為864bp，克隆入pMD18-T載體，并對其 堿基序列進行測定。RT-PCR的反應條件為以總RNA為模板，在50nl反應體系 中，加入5xRT-PCR反應緩沖液10ti1、 25mM MgS042pl、 10mM dNTP混合物lnl、 20nM的上下游引物各2.5pl、 AMV逆轉錄酶(Takara公司)ljil、 Tfl DNA聚合酶 lpl及RNA模板2^1,補水至50nl。 RT-PCR循環參數為48'C逆轉錄45min， 94'C 變性2min，再進行29個PCR循環(94'C變性30s， 56'C退火30s, 72'C延伸30s), 最后于72'C延伸7min。 RT-PCR產物用1X的瓊脂糖凝膠電泳分離后，用膠回收試劑盒回收約914bp的DNA條帶，克隆入pMD18-T載體，經含Amp抗生素 (50mg/ml)的瓊脂糖平板篩選轉化子，挑取出8個陽性克隆送往上海英駿測序 公司進行堿基序列測定，得到如圖2所示的雞BAFF全長cDNA堿基序列及推測 編碼氨基酸序列。(6)同源檢索將所得序列向http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/提交克降 得到的cDNA序列在GenBank、 EMBL和DDBJ國際三大主要核酸序列數據庫進行 相似性搜索及同源性分析，如圖3所示，發現與已知的鴨(GenBank登錄號 DQ445092)、鵝(GenBank登錄號DQ874394)、人(GenBank登錄號AF116456)、 鼠(GenBank登錄號AF119383) BAFF氨基酸序列相似性最高(不包括其他種屬 BAFF的預測氨基酸序列)，分別是97%、 92%、 76%、 70%，可以確定該序列是三 黃雞B淋巴細胞刺激因子(gBAFF)的全長cDNA。并且其開放閱讀框具有SEQ ID NO.l序列，碥碼的蛋白的氨基酸序列如SEQIDNa2所示。 實施例2:可溶性cvcBAFF重組載體的構建及其在大腸桿菌中的誘導表達以實施例1得到的cycBAFF全長cDNA為模板，設計引物cycsBAFFl (5'CCAAGGCATATGTCTATTGTCAACGCAG 3' ) OWe /))及cycsBAFFl (5'ACGATT GAATTCTCAGAGGAGTCTAACTGC 3')(五co及/ ))擴增出 cycBAFF cDNA胞外可溶區段(cycsBAFF),引物分別引入酶切位點AWe/及 fcoW/，亞克隆入pET-28a載體，構建成重組載體pET-28a-cycsBAFF。將此重 組載體轉入大腸桿菌表達菌株BL21 (DE3)，胞漿內可高可溶性表達出目的蛋白 His-cycsBAFF，此融合蛋白經促存活與增殖試驗(圖6， 7)，活性檢測證實具有 cycsBAFF的高活性功能。 重組目的蛋白的包涵體的純化和復性IPTG誘導含有重組載體pET-28a-cycsBAFF的大腸桿菌表達菌株BL21 (DE3)4.5小時后，將500 ml誘導表達菌離心后收集的菌體用pH 8.0的TrisHCl 重懸，超聲裂解45 min后,12 000 r/min離心15 min,棄上清，沉淀先用緩沖液A(50 mmoI/L TrisHCl (pH8.0)， 0.01 mol/LNaCl， 2 mol/L Urea，lo/oTritonX-100)洗滌 3次，再用緩沖液B (50 mmol/LTrisHCl (pH8.0)， 0.01 mol/LNaCl)洗滌3次。 洗滌后的包涵體經含6 mol/L Urea的Binding buffer (5 mmol/L Imidazole, 0.5 mol/LNaCl， 20 mmol/L TrisHCl, pH 7.9)溶解過夜，12 000 r/min離心30 min，棄沉淀，留上清過Ni^-NTA柱。具體過程為先用3倍柱體積的滅菌ddH20和3 倍體積的Binding buffer平衡柱子，手動上樣含可溶性重組蛋白的上清之后，先 后用10倍體積的Binding buffer和6倍體積的Washing buffer (20 mmol/L Imidazole, 0.5 mol/LNaCl， 20 mmol/L TrisHCl，pH 7.9)洗去雜蛋白，最后用Elute buffer (1 mol/L Imidazole, 0.5 mol/LNaCl， 20 mmol/L TrisHCl，pH 7.9)洗脫目的 蛋白，分管收集。SDS-PAGE檢測各收集管蛋白純度和紫外分光光度計測定蛋白 濃度(圖4A)。經Ni2+-NTA柱純化后含目的蛋白的收集液在4'C條件下，采取分步透析降 低尿素濃度的方法,使變性的目的蛋白在此過程中自然復性(圖4B)。復性緩沖液 含50 mmol/L TrisHCl, 0.1 mol/L NaCl， 0.1 mmol/L DTT， 0.2 mmol/L GSSG， 1 mmol/L GSH,pH 8.0，Urea濃度分別為4 mol/L，2 mol/L，l mol/L,0.5 mol/L，0 mol/L。 western印跡分析Western-blot中所用一抗為羊抗His6單抗和兔抗His-gsBAFF多抗，二抗為 辣根過氧化酶標記的鼠抗羊和羊抗兔IgG。其簡要步驟是將誘導的產物先行 SGS-PAGE，然后以浸入式法將蛋白電轉移至硝酸纖維素膜(NC膜)上，用記 號筆標記蛋白marker各條帶，然而依次經5%脫脂奶粉室溫封閉lh，與一抗孵 育lh，與HRP標記的二抗IgG孵育lh，每步完成后均嚴格洗膜，最后加TMB 避光顯色。結果如圖5B所示在目的蛋白位置出現了特異性條帶。 eves BAFF對三黃雞法氏腔上囊B淋巴細胞促存活作用實驗無菌摘取雞法氏囊，于盛有PBS溶液的小平皿中剪碎，充分研磨后過200 目網篩，用PBS洗數次，加入淋巴細胞分離液進行分離得到法氏囊B淋巴細胞。 用RPMI 1640 (含10XFCS)培養液調整細胞濃度至約3 X 1(^個/ml，在96孔 板中每孔加入50 pi細胞，再分組依次加入重組蛋白及PMA溶液，重組蛋白的終 濃度分別為1、 2、 3、 4、 5ng/ml， PMA終濃度均為2 pg/ml;以加2ng/mlPMA (Cat no.P1585, Sigma)和不同濃度的BSA的培養細胞為對照，以不加重組蛋 白和PMA的培養細胞為空白對照。在37'C、 5XC02濃度條件下培養24h，在 體外通過MTT細胞毒試驗檢測cycsBAFF對三黃雞B淋巴細胞的促存活作用， 如圖5所示，結果表明本發明克隆得到的cycsBAFF對三黃雞B淋巴細胞具有 明顯的促存活效應，與鴨、鵝、人、鼠BAFF的生物學功能相同，且呈現劑量依賴效應，即當His-cycsBAFF為4ng/ml時cycBAFF的促增殖作用最強。同時， 2 ng/ml重組CycsBAFF與2 pg/ml PMA共刺激存活的細胞數比2 pg/ml PMA剌 激有明顯升高。實施例3:將實施例l獲得的三黃雞B淋巴細胞刺激因子cDNA通過現有基因工程方法， 生產重組雞BAFF，作為三黃雞類免疫增強劑。實施例4:將實施例1獲得的三黃雞B淋巴細胞刺激因子cDNA通過現有基因工程方 法，轉入三黃雞體內，增加其免疫力，在飼養中應用。按照本發明的方法可以通過現有基因工程技術，修飾三黃雞B淋巴細胞刺 激因子基因并用于所述研究和生產。SEQUENCE LISTING 〈110〉南京師范大學〈120>三黃雞B淋巴細胞刺激因子cDNA及其克隆方法和重組應用 <160>2<210>1<211>867<212>cDNA<213>三黃雞(Chinese 3-Yellow chicken)<400>13tgfl幼tCCgtggactgtgtgcacgtcatcgccccccccggtgctgcttcaggcaccacggcaatgctcctgtcctcttgtcttgcagca3C柳gCt3gaagctctgcgccatgagctgg柳ggCC8gccgtctcccctgatgacgagcaagcctctgC3gCtggtgCcaggcaggag3gtttCCg犯acgaaatctcg犯tgggagccagtgctgcaggcctgcttgcaacagaaagatgattc犯gcattgtccctctgg犯g犯catgg肌atea犯t3gtg3tCC2LggttttatC3tgtgtttggtgatgatctg3gcttggtgcagtcttatccg犯taattcttgctatactgaacttcaacttacaataccSLCg￡L￡Lg￡LCgSLttttttggtgccgtcagaictcttctgacaacagaaggataccgcctcctctccctct60ggacttttttctgtcacattcctgtggctt120gtgtctctttaccatgttctcaccctgaaa180atctacagggtccaggcaaggtctccgcta240aaagcgggtgcccctgtttcttccttcctg300aacaagcttcctggccctagcccagctgaa360gg卿鄉tctgtcgtccac420C犯Ctg8tCgctgacagcaa肌gtgatatc480tggcttctgagctttaaacgtggaacagct540gatattttttcatatatggc600atgggacatct肌tacagagg犯gaaggcc660acattatttcgctgcatacaa幼tatgcca720gctggcattgcaaaattag8780gCC￡L￡L￡L6Lt￡Ltccttggatggcgatggtact840867<210>2<211>288<212>PRT〈13〉三黃雞(Chinese 3-Yellow chicken) <400>2Met Lys Ser Val Asp Cys Val His Val lie Gin Gin Lys Asp Thr 15 10 15Ala SerSer ProSer Gly Pro Pro GlyAla Ala SerGly Thr Thr20 25 30Gly Leu Phe Ser Val Thr Phe Leu Trp Leu Ala Met Leu Leu Ser35 40 45Ser Cys LeuAla Ala ValSer Leu Tyr His Ala lieThr Leu LysThr GluAla ArgLys AlaGly AlaSer PheArg SerGin LeuSer SerLeu GluPhe PheMet GlyAsp LeuGin Ser匕eu GluAla LysArg Leu50Leu Glu Ala 65Ser Pro Leu 80Gly Ala Ser 95Arg Gin Glu 110Gin Thr Glu 125lie Val Asn 140lie Ala Asp 15555Arg AsnLeu GinGin GinLeu Arg Ser Glu Leu lie Tyr Arg Val 70Glu Gin Pro Pro ValSer Pro Gly Asp 85Val Ser Ser Phe LeuGinValSer Ala 100Asn Arg Leu Pro Gly ProSer Pro Ala 115lie Trp Asp Arg Asn 130Ala Glu GluThr Val 145Ser LysSer Asp lie 160lieValPro Trp Leu LeuSer Phe170 175 Glu Gin Gly Asn Lys lie Val lie185 190 lie Tyr Gly Gin Val Leu Tyr Thr200 205 His Leulie Gin Arg Lys Lys Ala215 220 Ser Leu Val Thr Leu Phe Arg Cys lie230 235 Tyr Pro Asn AsnSer Cys Thr Thr Ala Gly lie Ala245 250 Glu Gly Asp Glu Leu Gin Leu Thr lie Pro Arg Arg260 265 lieSer Leu Asp Gly Asp Gly Thr Phe Phe Gly Ala275 280Leu 288Lys Lys AspArgGluArgAlaLysGlyThrGly Cys Asp Thr GlyThr Thr PheHis Val Phe GlyGin Asn Met60 Arg75 Lys90 Ala 105 Glu 120 Arg 135 Leu 150 Asp 165 Ala 180 Tyr 195 Ala 210 Asp 225 Pro 240 Lys 255 Arg 270 Val 2851權利要求
1、三黃雞B淋巴細胞刺激因子cDNA，其特征在于，具有SEQ ID NO.1所示的序列。
2、 一種權利要求1所述的三黃雞B淋巴細胞刺激因子cDNA的克隆方法,如下(1) 根據B淋巴細胞刺激因子的保守序列設計引物 正義寡核苷酸引物cycBAFFl: 5'- ATGAAATCCGTGGACTG -3'， 反義寡核苷酸引物cycBAFF2: 5'- TCAGAGGAGTCTAACTGC -3，(2) 從三黃雞脾臟提取總RNA，(3) 通過RT-PCR方法，以上述引物cycBAFFl及cycBAFF2為特異性引物，擴增 出一段cDNA序列，克隆入pMD18-T載體，挑取陽性克隆進行堿基序列測定。
3、 一種權利要求1所述的三黃雞B淋巴細胞刺激因子cDNA的重組應用，是通過現 有基因工程方法，生產重組三黃雞B淋巴細胞刺激因子，作為三黃雞類免疫增強劑。
4、 三黃雞B淋巴細胞刺激因子，其特征在于，具有SEQIDNO,2所示的序列。
全文摘要
三黃雞B淋巴細胞刺激因子(cycBAFF)cDNA及其克隆方法和重組應用，涉及生物基因工程領域。三黃雞B淋巴細胞刺激因子的基因，具有SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的序列。其克隆方法如下根據B淋巴細胞刺激因子的保守序列設計引物；從三黃雞脾臟提取總RNA；通過RT-PCR方法，一步擴增出全長cDNA序列，克隆入pMD18-T載體，挑取陽性克隆進行測序。所述三黃雞B淋巴細胞刺激因子的cDNA可通過現有基因工程方法，生產重組cycBAFF，作為雞類免疫增強劑。
文檔編號C12N15/10GK101250527SQ20081002450
公開日2008年8月27日 申請日期2008年3月25日 優先權日2008年3月25日
發明者但文兵, 張雙全, 陳舒劼 申請人:南京師范大學