專利名稱：人b淋巴細胞刺激因子突變體及其構建方法和編碼基因的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種人B淋巴細胞刺激因子突變體，尤其涉及一種重組水溶型人B淋巴細胞刺激因子突變體。本發明還涉及該突變體的構建方法和編碼基因。
目前，國內外的研究者對BlyS紛紛展開了生物功能研究及藥物開發，為臨床提供新一代的免疫調節劑起到了推波助瀾的作用。同時，與BlyS相關的專利也應運而生。經檢索分析，這些專利主要涉及用于診斷和預測疾病的BlyS結合蛋白、抗體、受體的結構及使用方法，重組人BlyS表達載體及構建方法以及治療或預防與BlyS有關的機體異常的方法等，但有關BlyS突變體專利的報道，國內外均未檢索到。同樣，國內外關于能提高BlyS活性的突變體的報道迄今尚未見到。
hBLyS在體內以膜結合型和水溶型兩種形式存在，后者是前者經蛋白酶切割釋放而得。重組水溶型hBLyS(recombinant soluble hBLyS，rhsBLyS)的功能片段在HEK293和CHO等真核細胞中的表達已有報道。國內外研究者也多采用rhsBLyS進行相關研究。
hsBLyS含有3個Cys，它們分別位于N端第146位，第232位及第245位，hBLyS分子在后兩個Cys之間形成了鏈內二硫鍵，第146位的Cys游離在二硫鍵外。在蛋白變性復性過程中，Cys146th很可能造成鏈內或鏈間二硫鍵的錯配，導致蛋白錯誤折疊從而形成無活性的hBLyS。另外，將hBlyS與TNF家族的其它成員進行氨基酸序列比較發現，在N端第146位40％左右是valine(Val)，40％左右是alanine(Ala)，根據進化理論，Val和Ala可能是進化選擇的結果。
獲得突變體基因片段后，經過EcoRI和BamHI雙酶切鑒定，構建測序載體。將構建的測序載體送交大連寶生物公司進行序列分析。
按CaCl2轉化法將表達載體pBV220/hsBlyS、pBV220/hsBY-V或pBV220/hsBY-A等轉化E.coli DH5α。采用42℃溫度誘導法在DH5α中誘導三種蛋白的表達，再經過變性、復性手段純化目的蛋白。
生物活性試驗結果表明，突變體hsBY-V的促B細胞增殖活性明顯高于野生型hsBLyS。
1.2從白細胞總RNA中釣取水溶型hsBlyS的基因根據文獻報道的hsBlyS cDNA序列，以第134-285位氨基酸所對應的cDNA序列為模板，在上游引物中加入EcoRI的酶切位點，在下游引物中加入BamHI的酶切位點。引物由上海博亞生物工程有限公司合成，序列如下上游引物5′cgg aat tca tgg ccg ttc agg gtc cag aag 3′下游引物5′cgg gat cct tat cac agc agt ttc aat gca cc 3′以白細胞總RNA為模板，用上述引物進行RT-PCR，擴增得到hsBlyScDNA序列。
1.3野生型hsBlyS測序克隆的構建RT-PCR產物用限制性內切酶EcoRI和BamHI消化，與經過同樣處理的載體pBV220連接，轉化E.coliDH5α，利用氨芐青霉素抗性篩選重組克隆。提取陽性克隆的質粒DNA，進行EcoRI和BamHI雙酶切鑒定及瓊脂糖凝膠電泳分析。初步鑒定正確的重組子克隆送交大連寶生物公司進行序列分析。其中質粒DNA的提取、酶切反應、連接反應、感受態的制備及轉化等操作均參照《分子克隆實驗指南》。
實施例2.突變體hsBY-V基因片段的獲得
圖1顯示了進行重疊延伸PCR法進行定點突變的過程。b和c分別為與靶序列一側末端互補配對的側翼引物(內引物)，a和d為不包含突變部位序列的外引物。重疊使每個片段中的一條鏈可以作為另一片段中一條鏈的引物，隨后的延伸則可產生定點突變產物，延伸得到的少量突變體片段在后續的PCR反應中得到大量擴增。引物序列如下內引物b5′gcaa aac gtc ttg agt gac tgt ttc ttc 3′內引物c5′aca gtc act caa gac gtt ttg caa ctg att gca gac ag 3′外引物a5′gct aaa aga tct ctc acc tac 3′外引物d5′cg gga tcc tta tca cag cag ttt caa tgc acc 3′PCR體系如下10×buffer 5μLdNTP4μL(終濃度200μM)引物a(或b) 0.5μL(終濃度0.5μM)
引物c(或d) 0.5μL(終濃度0.5μM)pBV220-hsBlyS1μLTaq酶0.25μL(5U/μL)水 加到50μL進行第一輪PCR反應，分別得到ac和bd片段，再以兩者為模板進行第二輪PCR。
10×buffer 5μLdNTP 4μL引物a 0.5μL引物d 0.5μLac 1μLbd 1μLTaq酶 0.25μL水 加到50μL兩次PCR反應參數均為 共35個循環實施例3.野生型hsBlyS及其突變體在大腸桿菌中的表達與純化按CaCl2轉化法[6]將表達載體pBV220/hsBlyS及pBV220/hsBY-V轉化E.coli DH5α。轉化菌落經30℃過夜活化，次日以2％比例接種于LB培養基，30℃培養至對數生長期(OD600＝0.4～0.6)，立即轉入42℃水浴搖床，200rpm培養4hr，誘導目的蛋白在E.coliDH5α中表達。誘導表達培養物于4℃，12,000rpm離心15min，將沉淀重懸于適量PB(100mmol/L Na2HPO4100mmol/LNaH2PO4)中，以超聲波破碎菌體，離心分別收取沉淀和上清，進行15％SDS-PAGE，分析目的蛋白在DH5α中的表達分布情況。結果表明目的蛋白在DH5α中以包涵體形式表達。超聲處理后得到的包涵體經2mol/L尿素洗滌2次，8mol/L尿素變性溶解，以Sephacryl-200(S-200)為柱填料，對溶解上清進行凝膠過濾層析，采用15％SDS-PAGE分析各洗脫峰對應的樣品純度。純化的樣品在復性緩沖液(100mmol/L Na2HPO4，100mmol/L NaH2PO4，0.1mmol/LGSSG，1mmol/L GSH，0.1％PEG)存在的情況下4℃稀釋復性72hr，之后以PEG 6000緩慢濃縮得到一定濃度的蛋白樣品。
實施例4.重組蛋白的促B淋巴細胞增殖的活性檢測用淋巴細胞分離液自健康人外周血中分離外周血單個核細胞(PBMC)，再用貼壁培養、過尼龍毛柱等方法得到外周血B淋巴細胞；用RPMI1640(含10％FBS)調細胞密度為1×106細胞/mL，在96孔培養板上每孔加50μL，再分組依次加入一定量的重組蛋白溶液及anti-IgM溶液，以不加anti-IgM和重組蛋白溶液的培養細胞為陰性對照，在37℃，5％CO培養箱中培養72hr，之后采用MTT法測細胞密度。
采用Bradford法測得三種蛋白濃度分別為rhsBLyS(57mg/L)，rhsBY-V(122mg/L)，rhsBY-A(239mg/L)，以anti-IgM(10g/L)為共增殖劑進行B淋巴細胞活性測定。結果如圖2所示(1)與陰性對照相比，單獨加入anti-IgM(30mg/L)時，B淋巴細胞的增殖無明顯變化；而隨著重組蛋白濃度的增加，B淋巴細胞的增殖加強，且在1mg/L時，三種蛋白的促B細胞增殖活性最高，之后活性開始下降，至2mg/L后，B細胞增殖出現平臺效應。
(2)在anti-IgM濃度一定的情況下，同樣的蛋白濃度，經rhsBY-V作用后的B細胞增殖最快，rhsBY-A次之，rhsBLyS最低；將所測OD值分別進行統計學檢驗表明rhsBY-V與野生型rhsBLyS的促B細胞增殖活性相比具有顯著性差異(P＜0.05)，前者活性顯著高于后者。說明rhsBLyS N端第146位Cys點突變成Val后，提高了促B淋巴細胞增殖的活性。突變體hsBY-A與野生型hsBLyS相比無顯著差異，這可能是蛋白純化時的變性、復性過程導致蛋白活性損失較大，此點尚須進一步研究確證。
序列表<110>中國人民解放軍軍事醫學科學院基礎醫學研究所<120>人B淋巴細胞刺激因子突變體及其構建方法和編碼基因<160>4<210>1<211>459<212>DNA<213>人<400>1GCCGTTCAGGGTCCAGAAGAAACAGTCACTCAAGACGTTTTGCAACTGATTGCAGACAGTGAAACACCAACTATACAAAAAGGATCTTACACATTTGTTCCATGGCTTCTCAGCTTTAAAAGGGGAAGTGCCCTAGAAGAAAAAGAGAATAAAATATTGGTCAAAGAAACTGGTTACTTTTTTATATATGGTCAGGTTTTATATACTGATAAGACCTACGCCATGGGACATCTAATTCAGAGGAAGAAGGTCCATGTCTTTGGGGATGAATTGAGTCTGGTGACTTTGTTTCGATGTATTCAAAATATGCCTGAAACACTACCCAATAATTCCTGCTATTCAGCTGGCATTGCAAAACTGGAAGAAGGAGATGAACTCCAACTTGCAATACCAAGAGAAAATGCACAAATAATCACTGGATGGAGATGTCACATTTTTTGGTGCATTGAAACTGCTGTGA<210>2<211>152
<212>PRT<213>人<400>2avqgpee tvtqdvlqli adsetptiqk gsytfvpwll sfkrgsalee kenkilvket gyffiygqvlytdktyamgh liqrkkvhvf gdelslvtlf rciqnmpetl pnnscysagi akleegdelq laiprenaqisldgdvtffg alkll<210>3<211>459<212>DNA<213>人<400>3GCCGTTCAGGGTCCAGAAGAAACAGTCACTCAAGACGCTTTGCAACTGATTGCAGACAGTGAAACACCAACTATACAAAAAGGATCTTACACATTTGTTCCATGGCTTCTCAGCTTTAAAAGGGGAAGTGCCCTAGAAGAAAAAGAGAATAAAATATTGGTCAAAGAAACTGGTTACTTTTTTATATATGGTCAGGTTTTATATACTGATAAGACCTACGCCATGGGACATCTAATTCAGAGGAAGAAGGTCCATGTCTTTGGGGATGAATTGAGTCTGGTGACTTTGTTTCGATGTATTCAAAATATGCCTGAAACACTACCCAATAATTCCTGCTATTCAGCTGGCATTGCAAAACTGGAAGAAGGAGATGAACTCCAACTTGCAATACCAAGAGAAAATGCACAAATATCACTGGATGGAGATGTCACATTTTTTGGTGCATTGAAACTGCTGTGA
<210>4<211>152<212>PRT<213>人<400>4avqgpee tvtqdalqli adsetptiqk gsytfvppwll sfkrgsalee kenkilvket gyffiygqvlytdktyamgh liqrkkvhvf gdelslvtlf rciqnmpetl pnnscysagi akleegdelq laiprenaqisldgdvtffg alkll
權利要求
1.人B淋巴細胞刺激因子突變體，其特征在于具有序列表中序列2所示的氨基酸序列。
2.編碼權利要求1的人B淋巴細胞刺激因子突變體的基因，其特征在于具有序列表中序列1所示的核酸序列。
3.人B淋巴細胞刺激因子突變體，其特征在于具有序列表中序列4所示的氨基酸序列。
4.編碼權利要求3的人B淋巴細胞刺激因子突變體的基因，其特征在于具有序列表中序列3所示的核酸序列。
5.構建權利要求1或3的人B淋巴細胞刺激因子突變體的方法，其特征在于將野生型人B淋巴細胞刺激因子的第146位半胱氨酸殘基點突變成其它氨基酸殘基。
6.根據權利要求5的方法，其特征在于將野生型人B淋巴細胞刺激因子的第146位半胱氨酸殘基點突變成纈氨酸殘基或丙氨酸殘基。
7.權利要求1或3的人B淋巴細胞刺激因子突變體在醫藥領域中的用途。
8.根據權利要求7的用途，其特征在于所說的醫藥領域是指常見的可變性免疫缺乏癥(common variable immunodeficiency，CVID)、獲得性免疫缺乏綜合征等免疫缺陷疾病或幫助腫瘤化療病人恢復等方面。
全文摘要
本發明涉及一種人B淋巴細胞刺激因子突變體。其突變體的氨基酸序列為序列表中序列2所示，核酸序列為序列表中序列1所示。該突變體在藥物和臨床診斷試劑開發等方面具有良好的應用前景。
文檔編號A61P35/00GK1448406SQ0211637
公開日2003年10月15日 申請日期2002年4月1日 優先權日2002年4月1日
發明者陳光宇, 王嘉璽 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院基礎醫學研究所