專利名稱：一種用α-酮戊二酸交聯固定纖維素酶的方法
技術領域：
本發明屬酶化學工程技術領域，特別是涉及一種用a-酮戊二酸交聯固定纖維素酶的 方法。
技術背景a-酮戊二酸是生物化學中被經常使用的一種試劑，它不僅對生物體無毒，且也同時是 非常有用的生物化學試劑。a-酮戊二酸是生物體內檸檬酸循環的重要中間體，也是異檸檬 酸脫氫酶、a-酮戊二酸脫氫酶復合體等多種酶的作用底物。最近研究發現a-酮戊二酸還具 有殺死癌細胞等多種功效，是一種重要的、常用的且具有極大市場潛力的生物試劑。纖維素酶的固定化研究，研究至今已有近十年的時間，但是在交聯劑的選擇上一直都 沒有很大的突破，大多數都采用的是化學試劑，而化學試劑容易使酶中毒，而使酶失活的 缺點。 發明內容本發明所要解決的技術問題是提供一種使用新的交聯劑固定纖維素酶的方法，該方法 的特點是無毒、具有生物相容性、反應條件溫和、反應簡單、載酶量高、比活高和催化效 率高，易從反應體系中分離、可回收反復使用、能提高酶的利用率和降低生產成本。本發明解決其技術問題所采用的技術方案是提供一種用a-酮戊二酸交聯固定纖維素 酶的方法，包括下列步驟(1) 利用質量分數為16%，以25%醋酸溶解的殼聚糖溶液，包裹磁性粉末制備磁性 納米微粒；(2) 用a-酮戊二酸與包裹上殼聚糖的磁性納米微粒反應，進行交聯，制得含有交聯 臂的磁性納米微粒；(3) 用配制好的濃度為l-15mg/ml的纖維素酶溶液，與磁性納米微粒反應，固定纖 維素酶；(4) 通過改變固定化的條件，優化固定化的條件，選擇最大限度地固定纖維素酶的 固定化的條件。所述的磁性納米微粒是指具有生物活性的磁性納米微粒，其直徑分布均勻，直徑均在 20-40nm左右。所述的a-酮戊二酸與包裹上殼聚糖的磁性納米微粒反應是，150-300mga-酮戊二酸，5-15ml磁性納米微粒，PH值6.5 7.0之間，100-150r/min， 20-50。C反應12-36小時。所述的步驟(3)的反應是，l-15mg/ml纖維素酶溶液，5-15ml具有交聯臂的磁性納米微粒，100-150r/min， 20-50。C反應2-8小時。所述的步驟(4)優化固定條件是指，改變溫度、纖維素酶的濃度、纖維素酶的用量、PH值，確定最佳固定條件。有益效果1) 本發明所得到的納米磁性微粒固定化酶，具有載酶量高、比活高和催化效率高的特 點。2) 本發明所得到的納米磁性微粒固定化酶，易從反應體系中分離、可回收反復使用， 這樣就可以達到提高酶的利用率和降低生產成本等優點。3) 本發明的操作簡單、反應溫和。不會因反應過度劇烈而使酶失活。4) 本發明所使用的交聯劑一a-酮戊二酸，無毒，具有生物活性和生物相容性。不會讓 酶中毒而失活，且對酶具有親和性。是一種很好的交聯劑。
圖1為具有生物相容性的納米磁性微粒的透視電鏡照片。 圖2為未包裹上殼聚糖的磁性粉末的FT-IR圖譜。 圖3為包裹上殼聚糖的納米磁性微粒的FT-IR圖譜。 圖4為酶濃度對酶固定化的影響。 圖5為PH值對酶固定化的影響。
具體實施方式
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明 而不用于限制本發明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之后，本領域技術 人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限 定的范圍。以殼聚糖包裹的納米磁性微粒的制備，具體步驟如下1) 在50'C下，用醋酸溶液(25wt。/。)溶解殼聚糖，制得殼聚糖溶液(16wt.%)。2) 10mlFe3O4中加入lml的Span-80，再將上述的殼聚糖溶液傾到入其中，在700r/min下 攪拌15min。然后超聲振蕩30min，再在700r/min下攪拌30 min。3) 在磁場存在的條件下，用蒸餾水洗3次，完成沉降過程。以(X-酮戊二酸為交聯劑的生物相容性磁性納米粒子的制備，具體步驟如下1) 用PH=5.6的醋酸緩沖溶液溶脹包裹了殼聚糖的納米磁性微粒.2) 在上述溶液中加入0.25ga-酮戊二酸，用6moI/lNaOH調PH值至4.5 5.0，然后緩慢 加入NaBH4 0.15g，用HC1 (15wt.%)調PH值至6.5 7.0，反應24h。3) 分別用乙醇(100wt.%)和無水乙醚，洗三次。 以纖維素酶固定納米磁性微粒的制備，具體步驟如下1) 用醋酸緩沖溶液溶解纖維素酶，以2: l的體積比，將纖維素酶溶液和納米磁性微粒反 應，在37'C， 120r/min下，反應4小時。2) 甩醋酸緩沖液清洗上述產物，直至洗脫液中再也沒有游離酶的存在。用紫外分光光度 計在280nm的波長下，監測游離酶的存在與否。3) 用醋酸緩沖液保存所制得的固定化酶。以羥甲基纖維素鈉鹽為底物的紫外分光光度法酶活的表征，具體步驟如下游離酶活的測定將纖維素酶溶解在0.2mol/L醋酸緩沖液(PH=5.6)中，制成濃度為 lmg/ml的酶溶液。取上述的酶溶液lml，加入4ml羥甲基纖維素鈉鹽(CMC-Na)，在50°C 下反應5min。然后立即加入lml 2mol/L氫氧化鈉溶液和2ml DNS溶液。搖勻后將上述的 混和溶液放入沸水浴中，5min后立即取出，流水冷卻，用蒸餾水定容至20ml。與520nm 波長下比色。固定酶活的測定在一定量的固定化酶磁性粒子中，加入4ml羥甲基纖維素鈉鹽 (CMC-Na)，按上述方法測定固定化酶的活力。以納米磁性微粒為載體的纖維素酶固定化的條件優化，具體步驟如下1) 酶溶液的濃度確定。取7組各5ml磁性微粒，分別加入濃度為lmg/ml、3mg/ml、6mg/ml、 7mg/ml、 9mg/ml、 10mg/ml、 11 mg/ml (PH=5.6)的纖維素酶溶液進行固定，并測定 酶的活力。最適的給酶濃度為10mg/ml。2) 反應Ph值的確定。取6組各5ml磁性微粒，加入酶溶液的Ph值分別為4.4、 4.8、 5.0、 5.4、 5.8、 6.0，進行固定，并測定酶的活力。當反應體系的Ph值為4.8時，酶活最高。
權利要求
1.一種用α-酮戊二酸交聯固定纖維素酶的方法，包括下列步驟(1)利用質量分數為16％，以25％醋酸溶解的殼聚糖溶液，包裹磁性粉末制備磁性納米微粒；(2)用α-酮戊二酸與包裹上殼聚糖的磁性納米微粒反應，進行交聯，制得含有交聯臂的磁性納米微粒；(3)用配制好的濃度為1-15mg/ml的纖維素酶溶液，與磁性納米微粒反應，固定纖維素酶；(4)通過改變固定化的條件，優化固定化的條件，選擇最大限度地固定纖維素酶的固定化的條件。
2. 根據權利要求1所述的一種用a-酮戊二酸交聯固定纖維素酶的方法，其特征在于所 述的磁性納米微粒是指具有生物活性的磁性納米微粒，其直徑分布均勻，直徑均在 20-40nm左右。
3. 根據權利要求1所述的一種用a-酮戊二酸交聯固定纖維素酶的方法，其特征在于所 述的a-酮戊二酸與包裹上殼聚糖的磁性納米微粒反應是，150-300mga-酮戊二酸, 5-15ml磁性納米微粒，PH值6.5 7.0之間，100-150r/min， 20-50。C反應12-36小時。
4. 根據權利要求1所述的一種用a-酮戊二酸交聯固定纖維素酶的方法，其特征在于所 述的步驟(3)的反應是，l-15mg/ml纖維素酶溶液，5-15ml具有交聯臂的磁性納米微 粒，100-150r/min， 20-50。C反應2-8小時。
5. 根據權利要求1所述的一種用a-酮戊二酸交聯固定纖維素酶的方法，其特征在于所 述的步驟(4)優化固定條件是指，改變溫度、纖維素酶的濃度、纖維素酶的用量、PH 值，確定最佳固定條件。
全文摘要
本發明涉及一種用α-酮戊二酸交聯固定纖維素酶的方法，該方法包括(1)磁性納米微粒的制備。(2)α-酮戊二酸與磁性納米微粒反應。(3)交聯固定纖維素酶。(4)優化纖維素酶的固定條件。本發明利用納米磁性粒子高比表面積，以及殼聚糖所具有的反應性氨基和生物相容性，可以得到具有載酶量高、比活高和催化效率高的納米磁性微粒固定化酶。該固定化酶具有易從反應體系中分離、可回收反復使用，以及其制備過程簡單，反應過程溫和，提高酶的利用率和降低生產成本等優點。特別是交聯劑α-酮戊二酸無毒，不會使酶失活，也不會因反應過度劇烈降低酶的活性。
文檔編號C12N11/02GK101275130SQ20081003498
公開日2008年10月1日 申請日期2008年3月21日 優先權日2008年3月21日
發明者何智妍, 周毓婷, 朱利民, 聶華麗, 勇 薛 申請人:東華大學