專利名稱：一種固定化酶法生產l-鳥氨酸鹽酸鹽的方法
技術領域：
本發明涉及一種生產L-鳥氨酸鹽酸鹽的方法，尤其是涉及一種固定化酶法生產 L-鳥氨酸鹽酸鹽的方法。
背景技術：
L-鳥氨酸鹽酸鹽是重要的醫藥工業基礎原料，是細胞中重要的代謝產物，對于生 物體內液態氨的排除有重要的調節作用。目前，國內外對于酶法轉化生產L-鳥氨酸鹽酸鹽的文獻報道不一。L-鳥氨酸鹽酸 鹽的制備方法主要有三種化學法、發酵法和酶法。1化學法目前工業上最常用的生產方法是采用化學法水解L-精氨酸制備L-鳥氨酸， 1966年Shell Int. Rearsch采用丙烯酸和氰化鈉作為主要原料化學合成L-鳥氨酸。 (GB1020492,1966)。2發酵法用腸桿菌中的某些菌如 Escherichia coli, Aerobacter aerogenes, Proteus rettgeri和Proteus mirabili的突變菌株，進行發酵生產L-鳥氨酸，發酵液中L-鳥氨 酸最高為 15mg/mL, (GB1098348,1968 ；US39668072,1972)，Shibuya 等利用 Arthrobacter citreus 23-2A的突變株發酵生產L-鳥氨酸，發酵72h，產率為35. 2g/L。3 酶法沈淑英等用糞鏈球菌ATCC8043，糞產堿桿菌ATCC21400，糞鏈球菌S-43游離細胞 轉化底物L-精氨酸制備L-鳥氨酸，轉化率為95-100 %，提取收率為85-90 % (天津微生 物，1981，3 :28-38)。1995年，M Kyriakos等利用從動物肝臟中提取的精氨酸酶水解L-精 氨酸用于多種L-鳥氨酸鹽的制備(US5405761，1995)。上述L-鳥氨酸酶法生產過程都是利用游離細胞轉化底物L-精氨酸，所以轉化液 中會含有少量菌體蛋白和其他雜質，不利于產物的分離純化；且轉化后要去除菌體，降低產 物得率，導致生產成本增加。
發明內容
本發明的目的就是為了克服上述現有技術存在的缺陷而提供一種操作簡單、精氨 酸轉化率高、產量高的固定化酶法生產L-鳥氨酸鹽酸鹽的方法。本發明的目的可以通過以下技術方案來實現，包括如下步驟一種酶轉化生產L-鳥氨酸鹽酸鹽的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟(1)固定化酶的制備取三乙醇胺陰離子苯乙烯樹脂，用碳酸鉀溶液浸泡6_18h后過濾，再將濾出的三 乙醇胺陰離子苯乙烯樹脂與碳酸鉀、溴化氫按質量比為1 (0.1-0.6) (0.2-0. 5)配制 成反應溶液，于冰浴中反應5-60min，調節pH值至7_10，再加入精氨酸酶，使其與三乙醇胺陰離子苯乙烯樹脂的質量比為(0.002-0.01) 1，于1-10°C反應12-48h，洗滌后用飽和食 鹽水浸泡0. 5-3h，再洗凈即制得固定化酶，保存于水中；(2)轉化條件的優化將步驟(1)中制得的固定化酶與精氨酸、乙酸錳按質量比 1 (1-3) (0.004-0.02)混合，溶于去離子水中，調節pH值至6-9，在30-50°C下，攪拌反 應得到混合液；(3)產物提取和精制將步驟(2)中的混合液過濾后，向濾液中加入活性炭，用鹽酸調節pH值至3-6，于 40-90°C下攪拌反應5-30min后，過濾，將濾出液濃縮至有結晶析出，停止濃縮，加入醇類， 攪拌0. 5-3h，析出L-鳥氨酸鹽酸鹽，過濾、干燥即得產品。所述的步驟(1)中的反應溶液含三乙醇胺陰離子苯乙烯樹脂質量為 40-60g/100ml。所述的步驟(1)中的碳酸鉀溶液的摩爾濃度為1-5M。所述的步驟(1)中的碳酸鉀是摩爾濃度為1-5M的溶液，所述的溴化氫是質量濃度 為l_4g/ml的溶液，所述的精氨酸酶是質量濃度為l_4g/l的溶液。所述的步驟(1)中的pH值采用摩爾濃度為0. 05-2M的冷碳酸氫鈉溶液調節。所述的步驟(1)中的洗滌是依次利用100_400ml，0. 05-0. 3M的碳酸氫鈉溶液， 0. 5-4M的氯化鈉溶液和去離子水洗滌2-5次。所述的步驟(2)中的pH值采用鹽酸調節。所述的步驟(2)中攪拌反應的攪拌速度為60_200rpm，反應時間為6_18h。所述的步驟(3)中活性炭的加入量為l_6g/100ml濾液。所述的步驟(3)中醇類包括甲醇、乙醇或正丙醇。與現有技術相比，本發明通過精氨酸酶轉化生產L-鳥氨酸鹽酸鹽。它包括(1)固 定化酶的制備(2)轉化條件的優化(3)產物提取和精制工藝步驟。具有生產成本低、生產 條件溫和、轉化體系中雜質較少、工藝步驟簡單、生產操作安全等優點，采用本發明生產的 L-鳥氨酸鹽酸鹽純度高，產量高，每升溶液中含有100g-130g的L-鳥氨酸鹽酸鹽。精氨酸 的轉化率可達到95%以上。L-鳥氨酸鹽酸鹽是重要的醫藥工業基礎原料，是細胞中重要的 代謝產物，對于生物體內液態氨的排除有重要的調節作用。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明進行詳細說明。實施例1一種酶轉化生產L-鳥氨酸鹽酸鹽的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟1、固定化酶的制法(1)原料用量三乙醇胺陰離子苯乙烯樹脂50g精氨酸酶400mg飽和食鹽水以能浸沒固酶為準(2)操作過程
將三乙醇胺陰離子苯乙烯樹脂50g，用2M碳酸鉀溶液浸泡12h，過濾。濾干后，加入 100ml2M碳酸鉀溶液，于冰浴下加入10ml溴化氫(2g/ml)于冰浴下反應15分鐘，用冷0. 1M 碳酸氫鈉洗至PH = 8. 5，加入精氨酸酶溶液100ml (約400mg) 4°C反應24h。依次用0. 1M碳 酸氫鈉、1M氯化鈉、去離子水洗滌3次，每次200ml。用飽和食鹽水浸泡固化酶1小時，洗凈至檢測不出氯離子，保存于水中，備用。
2、固定化酶制備L-鳥氨酸鹽酸鹽的方法
精氨酸60g
濕固酶50. 4g
純水120g
乙酸錳0. 2g
鹽酸根據pH確定用量
PH值7. 4 7. 6
溫度38 40
時間8小時
攪拌轉速80 120轉/分
在上述條件下，將步驟(1)中制得的固定化酶(濕固酶)50. 4g與精氨酸60g、乙
錳0. 2g混合，溶于純水中，采用鹽酸調節pH值至7. 4 7. 6，在38-40°C下，攪拌反應8小 時；精氨酸轉化率達到95 98%。每升發酵液中含約130g L-鳥氨酸鹽酸鹽。反應結束 后，過濾，濾餅(固相酶)保存于水中，下次備用。3、L-鳥氨酸鹽酸鹽的分離純化在步驟(2)反應結束過濾后的濾液中加入3g活性炭，調節pH = 4，70°C保溫攪 拌10分鐘，過濾，濾液濃縮至有結晶析出，停止濃縮，加入200ml乙醇，攪拌1小時，析出的 L-鳥氨酸鹽酸鹽經過濾，干燥，得53g L-鳥氨酸鹽酸鹽。實施例2(1)固定化酶的制備取三乙醇胺陰離子苯乙烯樹脂40g，用摩爾濃度為1M的碳酸鉀溶液浸泡8h后過 濾，濾干后，加入摩爾濃度為1M的碳酸鉀溶液10ml，質量濃度為lg/ml的溴化氫溶液5ml于 冰浴條件下反應5min，用摩爾濃度為0. 05M的冷碳酸氫鈉溶液調節溶液pH值至7，再加入 質量濃度為lg/1的精氨酸酶溶液50ml，于1°C反應12h，依次用摩爾濃度為0. 05M的碳酸氫 鈉溶液100ml、0. 5M的氯化鈉溶液100ml、去離子水100ml洗滌2次，最后用飽和食鹽水浸泡 0. 5h，洗凈即制得固定化酶，保存于水中；(2)轉化條件的優化將步驟(1)中制得的固定化酶與精氨酸、乙酸錳按質量比1 1 0.004混合溶 于100ml去離子水中，利用鹽酸調節溶液pH值至6，在30°C，攪拌速度60rpm的條件下，攪 拌反應6h，得到混合液；(3)產物提取和精制將步驟⑵中制得的混合液進行過濾，向濾液中加入lg活性炭，控制溶液pH = 3， 反應溫度40°C，攪拌5min后過濾，濾出液濃縮至有結晶析出，停止濃縮，加入100ml乙醇，繼 續攪拌0. 5h，析出L-鳥氨酸鹽酸鹽，經過濾，干燥后得到50g，精氨酸轉化率達95 %。
實施例3(1)固定化酶的制備取三乙醇胺陰離子苯乙烯樹脂50g，用摩爾濃度為2M碳酸鉀溶液浸泡12h后過濾， 濾干后，加入摩爾濃度為2M的碳酸鉀溶液100ml，質量濃度為2g/ml的溴化氫溶液10ml于 冰浴條件下反應15min，用摩爾濃度為0. 1M的冷碳酸氫鈉溶液調節溶液pH值至8. 5，再加 入質量濃度為4g/l的精氨酸酶溶液100ml，于4V反應24h，依次用摩爾濃度為0. 1M的碳酸 氫鈉溶液200ml、摩爾濃度為1M的氯化鈉溶液200ml、去離子水200ml洗滌3次，最后用飽 和食鹽水浸泡lh，洗凈即制得固定化酶，保存于水中；(2)轉化條件的優化將步驟(1)中制得的固定化酶與精氨酸、乙酸錳按質量比1 1.5 0.008混合 溶于120ml去離子水中，利用鹽酸調節溶液pH值至7. 5，在40°C，攪拌速度lOOrpm的條件 下，反應8h，得到混合液；(3)產物提取和精制將步驟⑵中制得的混合液進行過濾，向濾液中加入3g活性炭，控制溶液pH = 4， 反應溫度70°C，攪拌lOmin后過濾，濾出液濃縮至有結晶析出，停止濃縮，加入200ml乙醇， 繼續攪拌lh，析出L-鳥氨酸鹽酸鹽，經過濾，干燥后得到53g，精氨酸轉化率達98%。實施例4(1)固定化酶的制備取三乙醇胺陰離子苯乙烯樹脂60g，用摩爾濃度為5M碳酸鉀溶液浸泡18h后過濾， 濾干后，加入摩爾濃度為4M的碳酸鉀溶液150ml，質量濃度為4g/ml的溴化氫溶液20ml于 冰浴條件下反應60min，用摩爾濃度為2M的冷碳酸氫鈉溶液調節溶液pH值至10，再加入質 量濃度為2g/l的精氨酸酶溶液200ml，于10°C反應48h，依次用摩爾濃度為0. 3M的碳酸氫 鈉溶液400ml、摩爾濃度為4M的氯化鈉溶液400ml、去離子水400ml洗滌5次，最后用飽和 食鹽水浸泡3h，洗凈即制得固定化酶，保存于水中；(2)轉化條件的優化將步驟(1)中制得的固定化酶與精氨酸、乙酸錳按質量比1 2 0.02混合溶于 200ml去離子水中，利用鹽酸調節溶液pH值至9，在50°C，攪拌速度200rpm的條件下，反應 18h，得到混合液；(3)產物提取和精制將步驟⑵中制得的混合液進行過濾，向濾液中加入6g活性炭，控制溶液pH = 6， 反應溫度90°C，攪拌30min后過濾，濾出液濃縮至有結晶析出，停止濃縮，加入500ml乙醇， 繼續攪拌3h，析出L-鳥氨酸鹽酸鹽，經過濾，干燥后得到54g，精氨酸轉化率達96 %。
權利要求
一種酶轉化生產L-鳥氨酸鹽酸鹽的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟(1)固定化酶的制備取三乙醇胺陰離子苯乙烯樹脂，用碳酸鉀溶液浸泡6-18h后過濾，再將濾出的三乙醇胺陰離子苯乙烯樹脂與碳酸鉀、溴化氫按質量比為1∶(0.1-0.6)∶(0.2-0.5)配制成反應溶液，于冰浴中反應5-60min，調節pH值至7-10，再加入精氨酸酶，使其與三乙醇胺陰離子苯乙烯樹脂的質量比為(0.002-0.01)∶1，于1-10℃反應12-48h，洗滌后用飽和食鹽水浸泡0.5-3h，再洗凈即制得固定化酶，保存于水中；(2)轉化條件的優化將步驟(1)中制得的固定化酶與精氨酸、乙酸錳按質量比1∶(1-3)∶(0.004-0.02)混合，溶于去離子水中，調節pH值至6-9，在30-50℃下，攪拌反應得到混合液；(3)產物提取和精制將步驟(2)中的混合液過濾后，向濾液中加入活性炭，用鹽酸調節pH值至3-6，于40-90℃下攪拌反應5-30min后，過濾，將濾出液濃縮至有結晶析出，停止濃縮，加入醇類，攪拌0.5-3h，析出L-鳥氨酸鹽酸鹽，過濾、干燥即得產品。
2.根據權利要求1所述的一種酶轉化生產L-鳥氨酸鹽酸鹽的方法，其特征在于，所述 的步驟(1)中的反應溶液含三乙醇胺陰離子苯乙烯樹脂質量為40-60g/100ml。
3.根據權利要求1所述的一種酶轉化生產L-鳥氨酸鹽酸鹽的方法，其特征在于，所述 的步驟(1)中的碳酸鉀溶液的摩爾濃度為1-5M。
4.根據權利要求1所述的一種酶轉化生產L-鳥氨酸鹽酸鹽的方法，其特征在于，所述 的步驟(1)中的碳酸鉀是摩爾濃度為1-5M的溶液，所述的溴化氰是質量濃度為l-4g/ml的 溶液，所述的精氨酸酶是質量濃度為l_4g/l的溶液。
5.根據權利要求1所述的一種酶轉化生產L-鳥氨酸鹽酸鹽的方法，其特征在于，所述 的步驟(1)中的PH值采用摩爾濃度為0.05-2M的冷碳酸氫鈉溶液調節。
6.根據權利要求1所述的一種酶轉化生產L-鳥氨酸鹽酸鹽的方法，其特征在于，所述 的步驟(1)中的洗滌是依次利用100-400ml，0. 05-0. 3M的碳酸氫鈉溶液，0. 5-4M的氯化鈉 溶液和去離子水洗滌2-5次。
7.根據權利要求1所述的一種酶轉化生產L-鳥氨酸鹽酸鹽的方法，其特征在于，所述 的步驟(2)中的pH值采用鹽酸調節。
8.根據權利要求1所述的一種酶轉化生產L-鳥氨酸鹽酸鹽的方法，其特征在于，所述 的步驟(2)中攪拌反應的攪拌速度為60-200rpm，反應時間為6-18h。
9.根據權利要求1所述的一種酶轉化生產L-鳥氨酸鹽酸鹽的方法，其特征在于，所述 的步驟(3)中活性炭的加入量為l_6g/100ml濾液。
10.根據權利要求1所述的一種酶轉化生產L-鳥氨酸鹽酸鹽的方法，其特征在于，所述 的步驟(3)中醇類包括甲醇、乙醇或正丙醇。
全文摘要
本發明涉及一種L-鳥氨酸鹽酸鹽的制備方法。通過精氨酸酶轉化生產L-鳥氨酸鹽酸鹽。它包括(1)固定化酶的制備；(2)轉化條件的優化；(3)產物提取和精制工藝步驟。與現有技術相比，本發明具有生產成本低、生產條件溫和、轉化體系中雜質較少、工藝步驟簡單、生產操作安全、純度高、每升溶液中含有100-130g的L-鳥氨酸鹽酸鹽，產量高、精氨酸轉化率達95％以上等優點。
文檔編號C12N11/02GK101851646SQ20091004864
公開日2010年10月6日 申請日期2009年3月31日 優先權日2009年3月31日
發明者張建宇, 蘇建勇, 鄭南華 申請人:上海漢飛生化科技有限公司