專利名稱：利用小鼠一氧化氮合成酶基因提高植物的抗旱性的制作方法
技術領域：
本發明屬于作物遺傳育種領域，具體地說利用農桿菌將小鼠一氧化氮合成 酶基因轉化到植物巾，使之能在植物中高效表達，提高植物的抗旱能力。
背景技術：
干旱是影響植物生長發育的主耍環境因子之一，干旱能影響植物的水分狀態，使植物缺水遭受傷害。據統計，世界干旱、半干旱地區占陸地面積的34. 9 %， 干旱對世界作物產量的影響，在諸多自然逆境中占首位，其危害相當于其它災 害之和。我國干旱、半干旱地區約占國土面積的52%，全國灌溉區年缺水約300 億立方。因缺水而少收糧食350 400億公斤；特別是我國主要產糧區如華北、 東北和西北，是我國缺水最嚴重的地區。在我國西部和北部地區，干旱脅迫還 嚴重地影響了地表植被的生長，導致了越來越嚴重的牛態問題。如草地退化、 土壤荒漠化等。因此了解干旱脅迫下細胞內保存水分的機制很重要。在干旱脅 迫條件下，植物會誘導表達一些基因，通過研究這些被干旱脅迫所誘導的基因， 可能找到植物對干旱脅迫的適應及抵御機理，并為植物抗早基因工程提供理論 支持。近年來，相繼從擬南芥等植物中克隆出了一些受干旱誘導的基因，如蛋 白激酶基因、光合基因、滲透調節基因、功能蛋白基因等，干旱脅迫信號經歷 一系列的傳遞過程，最后誘導這些特定基因的表達。同時也從高等植物中分離 出一系列調控干旱相關基因表達的編碼轉錄因子的基因，通過轉錄因子之間以 及與其它相關蛋白之間的相互作用，激活或抑制干旱等脅迫因子誘導的基因表 達。一氧化氮(NO)是近年來發現的一種非常重要的生物活性分子，它普遍存 在于原生動物、細菌、酵母、動植物屮。NO可以作為動物生理代謝過程中一種 關鍵的第二信使,參與血管松弛、神經傳導以及先天性免疫反應。NO是一種具有 自由基性質的氣體分子，它可以獲得一個電子或者失去一個電子形成N(T和NO—。 由于N0有一個不配對的電/，所以它很容易和氧氣(02)、超氧(()々 )和其 它化合物發生反應，在供氧充足的情況下N0可以與0—2'反應生成過氧化亞硝酸(0N00—)。自1996年后，越來越多的研究表明NO參與很多植物生理代謝調 節。NO可以作為植物抗逆反應的信號分于，同時參與植物的呼吸作用、光形態 建成、種子萌發、根的生長發育、果實組織的成熟和衰老。但總體來說，大多 數領域的研究仍處于起步階段，很多問題，諸如NO在植物生長發育中的作用、 N0與植物抗逆性、NO與植物內源激素的關系、NO的分子作用機制等，都有待進 一步深入探時。植物受到干旱脅迫時，體內活性氧的濃度發生了很大變化。解除活性氧種 類毒害的酶，例如谷胱甘肽還原酶、超氧化物歧化酶和抗壞血酸過氧化物酶， 在對干旱脅迫的反應中增加；降低葉片含水量和隨后的氣孔關閉均能產生超氧 陰離子自由基；在干旱過程中光呼吸活性也伴隨乙醇酸氧化酶活性的增加，提 高過氧化氫的合成。大量試驗證實了NO參與活性氧自由基的形成，并與活性氧協同作用誘導植 物抗逆反應。NO可以抑制煙草的過氧化氫酶和抗壞血酸酶的活性。N0通過抑制 順烏頭酸酶來參與植物的抗逆反應， 一方面是由于線粒體順烏頭酸酶被NO失活 后，降低經線粒體的電子傳遞鏈電子流，從而減少活性氧(R0S)的生成；另一方 面由T順烏頭酸酶活性被抑制后導致細胞內檸檬酸濃度升高，誘導與抗逆有關 的交替氧化酶(A0X)活性上升，而后者也可以減少ROS的產牛。Jiang等在玉 米干旱脅迫響應中，觀察到由于ABA誘導NADra氧化酶活性增強而使R0S水平 升高，這表明ABA、 R0S和N0之間關系緊密(植物2002) 。 Zhang等在研究外 源NO影響滲透脅迫下小麥種子萌發及活性氧代謝時，發現NO供體硝普鈉(SNP) 通過促進滲透脅迫下過氧化氫酶(CAT)、抗壞血酸過氧化物酶(APX)活性的上升 和脯氨酸含量的積累，抑制脂氧合酶(LOX)的活性，提高滲透脅迫下小麥種子萌 發過程中的抗氧化能力(植物學報2003)。NO可能通過脫落酸調節植物的抗旱反應。干旱脅迫能迅速在植物根系、葉 片等部位誘發植物激素脫落酸(ABA)的合成。早在上世紀60年代，Wright等證 明滲透脅迫可誘導細胞合成ABA，當植物受到干旱、低溫、鹽害等環境脅迫時(自 然雜志1969)，細胞迅速積累ABA。 ABA積累與植物品種間抗早性強弱有關，ABA含量可作為抗旱性鑒定的評價指標之一。Zhao等用離體小麥根尖為材料進行研究，發現干旱脅迫后20min， N0合成 酶活性明顯增髙；60min后ABA開始積累。這種積累能夠被N0合成酶抑制劑或 NO清除劑所阻斷，而且外源N0供體硝普鹽同樣可在根尖中誘導ABA的積累，這些結果說明NO參與水分脅迫下小麥根尖中植物激素ABA的合成(澳大利亞植 物生理學雜志2001) 。 Lamattinat等研究發現SNP預處理的植物葉片在干旱脅 迫后保持的相對含水量(RWC)較高，蒸騰速率和氣孔開度下降，離子滲漏減小； SNP的這些作用均能被NO的特異清除劑cPTIO所逆轉(植物生理學2004) 。 NO 可能通過環化鳥苷酸(cGMP)途徑參與植物的抗逆反應。動物細胞內，NO信號傳 導過程中鳥苷酸環化酶起關鍵作用，NO可通過與血紅素鐵結合或使半胱氨酸殘 基發生S-亞硝基化而激活胞內可溶性的鳥苷酸環化酶，導致cGMP 二級信號的迅 速增加，然后NO通過cGMP激活環式ADP-核糖(cADPR)合成酶，使cADPR大 量合成，cADPR可與胞內轉通道結合，促進鈣粒子從儲存的細胞器中釋放。NO 在植物體內存在和動物相似的信號傳導模式。利用NO處理煙草葉片或懸浮系細 胞均能誘發內源cGMP的大量積累；而cADPR可誘導液胞中鈣的釋放，NO處理 蠶豆保衛細胞也能增加細胞質中鈣離子濃度。有研究表明，ABA誘導的氣孔關 閉現象是通過NO調節保衛細胞中鈣離子來實現的，氣孔的開關有賴于細胞中的 鉀離子和氯離子濃度，ABA提高外向整流的氯離子通道活性和抑制內向整流的 鉀離子通道活性都依賴鈣離子，NO清除劑cPTIO能夠阻止ABA誘導氣孔關閉。 有研究表明，NO和ABA可以各自獨立誘導氣孔關閉，但也存在正協同效應，NO 是一個介導ABA誘導氣孔關閉的關鍵信號分子。以上研究結果都表明，NO可能 是楨物干旱脅迫下一個重要調節分子。作為一個滲透性很強的小分子，它可以 穿過若干層細胞長距離在細胞間穿梭和跨膜擴散，刺激細胞作出應答。在其行 使功能過程中，NO能與其他信號分子如cGMP、 Ca2+、 H202、 ROS和SA等構成 個復雜的信號網絡，并調控很多基因的轉錄。迄今為止，NO的研究結果大都是通過外源NO或者外加NO供體等體外試驗 獲得，前人的研究報道常出現一些矛盾的結果。本發明通過改變植物內源一氧 化氮含量，提高植物的抗旱性能。發明內容本發明的目的是提供一種小鼠誘導型一氧化氮合成酶基因，然后該基因轉 化入植物中，提高植物的抗旱能力。該基因消除誘導型一氧化氮合成酶基因中591位BamHI切點，763和1070 位EcoRI切點，399， 540和1008位Sacl的切點，故不能被B艦III、 EcoRI和 Sac I限制性內切酶切開。本發明將含有3435bp的小鼠誘導型一氧化氮合成酶基因(muiN0S) (麗一010927)(美國國立生物技術信息中心)進行改造，利用定點突變方法(Peng 2006，應用微生物和生物技術)將其巾的591位BamHI切點，763和1070位EcoRI 切點，399， 540和1008位SacI切點消除，獲得目的基因muiNOS。方法如下 分別在上述6個酶切位點設計正反兩個引物591位BamHI切點突變引物591Z:5， CCTCGCTGCA， TCGGCAGG AT， GCAG; 591F 5， CAGGTTGGAC，CACTGCATCC， TGCCGATG。763位EcoRI切點突變引物763Z:5' CAGGCTCTGG， ACTTCACAGC， TCATCC; 763F:5' GCTGTGAAGT， CCAGAGCCTG， AAG。1070位EcoRI切點突變引物:1070Z: 5， GTGGCCTCGA， CTTCCCAGC C， TGC; 1070F:5' CTGGGAAGTC' GAGGCCACCC， ACCTCCAG。399位Sacl切點突變引物399Z: 5 ， CAAGCCTACC， CCTCTGGAGG， AGGTCC TG; 399F:5' CAATGGCATG， AGGCAGGACC， TCCTC。540位SacI切點突變引物540Z:5， CTCACTCTGG，ATGACCTCAT，C; 540F:5， TGGCAAAGAT， GAGGTCATCC， AGAGTG。1008位Sacl切點突變引物1008Z:5， GAGTGGTTCC， AGGAGGTC GG，GTTG; 1008F:5 ， CACTTCAACC， CGACCTCCTG， GAACCAC 。利用相鄰位點的引物和基因兩端的引物分別擴增出小片段，擴增條件為 94°C預熱1 min; 94°C， 30 s， 60°C， 30 s， 72°C， 1 min。共25個循環，PCR 結束后，片斷用10%丙烯酰胺膠回收，將上述7個回收片斷取10-100 ng為模 板混合，以muiNOSZ和muiNOSF為引物將上述片斷拼接，擴增條件為94°C預 熱l min; 94°C, 30 s， 60°C， 30 s， 72°C， 4 min。共25個循環。本發明分別用BamHI和Sacl兩個限制性內切酶酶切定點突變的小鼠誘導型 一氧化氮合成酶基因，經測定，591位BamHI切點序列改為GGATGC， 763位 EcoR工切點序列改為GACTTC， 1070位EcoRI切點序列改為GACTTC， 399位 Sacl切點序列改為GACCTC， 540位Sacl切點序列改為GACCTC， 1008位Sacl 切點序列改為GAGGTC。然后，37。C酶切2 h，通過T4 DNA連接酶將酶切好的 小鼠誘導型一氧化氮合成酶基因(muiNOS)與含有雙35S啟動子的pYPX245 (AY178049)(美國國立生物技術信息中心)植物表達載體連接，酶切鑒定和序 列測定獲得了含有目的基因muiNOS的重組質粒pYPXmuiNOS。該表達載體還包含 GUS報告基因和帶內含子卡那霉素抗性標記基因(中國專利ZL 00 1 19754.8)。本發明利用電擊法將質粒導入根癌農桿菌中，根癌農桿菌菌株包括EHA105， LBA4404， GV3101, AGL-1 (購自美國菌種保藏中心)。農桿菌介導方法將小鼠 誘導型一氧化氮合成酶基因轉化水稻(劉巧全1998，植物生理學報)、煙草和 番茄等植物中(美國專利6323396)，農桿菌粘花法轉化將小鼠誘導型一氧化 氮合成酶基因轉化到擬南芥中(Clough 1998，植物學雜志)，驗證了轉基因植 物對干早的耐受性。本發明有益效果1. 小鼠誘導型一氧化氮合成酶基因能夠持續在植物中表達，該酶產牛的NO 對植物的抗性具有持久性。2. 小鼠誘導型一氧化氮合成酶基因安全穩定，對環境影響較小。
圖1小鼠誘導型一氧化氮合成酶基因改造方法圖。圖2小鼠誘導型一氧化氮合成酶基因植物表達載體構建。圖3轉化小鼠誘導型一氧化氮合成酶基因后水稻表現出抗旱能力的提高。
具體實施方式
實施例1:小鼠誘導型一氧化氮合成酶基因改造首先獲得小鼠一氧化氮合成酶基因。取約ioo克小鼠，宰殺后液氮速凍， 放置-7(TC冰箱中保存以備提取總RNA。 cDNA合成試劑盒為Clontech公司產品； DNA柱回收試劑盒購置Amersham公司；試劑RNA抽提試劑盒RNeasy Plant Mini Kit為QIAGEN公司產品；各種限制性內切酶和T4 DNA Ligase均購自上海Takara 公司。總RNA采用QIAGEN公司的RNeasy Plant Mini Kit提取。小鼠cDNA的合成按Clontech公司SMART cDNA Library Construction Kit 說明書操作進行第一鏈合成。以合成的cDNA第一鏈為模板，以muiNOSZ: 5' AAG GATCCATGGCTTGCCCCTGGAAGTTTCTCTTC和muiNOSF: AAGAGCTCTCAGAGCCTCGTGGCTT TG GGCTCCTC為引物，利用PCR進行cDNA擴增，擴增條件為94°C預熱1 min; 94°C， 30 s， 60°C， 30 s， 72°C， 3 min。共25個循環。PCR結束后，酚氯仿 抽提，再加入2倍體積的無水乙醇進行沉淀，沉淀用30W水溶解，獲得小鼠一 氧化氮合成酶基因片段。8其次對小鼠一氧化氮合成酶基因進行定點突變，突變方法如圖1。利用定點突變方法將591位BamHI， 763禾n 1070位EcoRI切點，以及399， 540禾Q 1008位SacI切點消除。591位BamHI切點突變引物591Z:5， CCTCGCTGCA， TCGGCAGG AT， GCAG; 591F 5' CAGGTTGGAC, CACTGCATCC， TGCCGATG。763位EcoRI切點突變引物763Z:5， CAGGCTCTGG， ACTTCACAGC， TCATCC; 763F:5' GCTGTGAAGT， CCAGAGCCTG， AAG。1070位EcoRI切點突變引物1070Z: 5， GTGGCCTCGA， CTTCCCAGC C， TGC; 1070F:5， CTGGGAAGTC， GAGGCCACCC， ACCTCCAG。399位Sacl切點突變引物399Z:5， CAAGCCTACC， CCTCTGGAGG， AGCTCC TG; 399F:5' CAATGGCATG， AGGCAGGACC， TCCTC。540位Sacl切點突變引物540Z:5， CTCACTCTGG， ATGACCTCAT，C; 540F:5' TGGCAAAGAT， GAGGTCATCC， AGAGTG。1008位Sacl切點突變引物1008Z:5' GAGTGGTTCC, AGGAGGTC GG，GTTG; 1008F:5 ， CACTTCAACC， CGACCTCCTG， GAACCAC 。取1W小鼠一氧化氮合成酶基因擴增片段為模板，以muiNOSZ和339F; 339Z 和540F; 540Z和591F; 591Z和763F; 763Z和1008F; 1008Z和1073F; 1073Z 和muiNOSF進行PCR擴增，擴增條件為94°C預熱1 min; 94°C, 30 s， 60。C， 30 s， 72°C， 1 min。共25個循環，PCR結束后，片斷用10%丙烯酰胺膠回收， 將上述7個回收片斷取10-100 ng為模板混合，以muiNOSZ和muiNOSF為引物 將上述片斷拼接，擴增條件為94°C預熱lmin; 94°C， 30 s， 60°C, 30 s， 72 °C， 4 min。共25個循環。PCR結束后，酚氯仿抽提，再加入2倍體積的無水乙醇進行沉淀。各加入 Sacl和BamHI酶切消化，DNA柱回收酶切片斷。將酶切處理好片段進行定向克 隆，高效轉化大腸桿菌DH5a感受態中(寶生物大連生物技術有限公司)。實施例2:小鼠誘導型一氧化氮合成酶植物表達載體構建將上述克隆含有改造過的小鼠誘導型一氧化氮合成酶基因片段的質粒，分 別用BaraHI和SacI進行雙酶切，回收DNA片段，通過T4 DNA連接酶將小鼠誘 導型-氧化氮合成酶基因與含有雙35S啟動子的pYPX245質粒連接(美國國立生 物技術信息中心)，BamHI和SacI雙酶切，片斷長度為3435bp。利用DNA測序儀進行序列測定，獲得了含有小鼠誘導型一氧化氮合成酶基因的重組質粒 pYPXmuiNOS。如圖示2。該表達載體還包含GUS報告基因和帶內含子卡那霉素 抗性標記基因(中國專利ZL 00 1 19754.8)。 實施例3:農桿菌培養和植物轉化農桿菌菌株為根癌農桿菌EHA105， LBA4404, GV3101, AGL-1菌株。質粒經 電擊法導入農桿菌中(購自美國菌種保藏中心)。挑取單菌到25 ml含50mg/1 利福平的YEB培養基中培養過夜，取5 ml菌液轉接到含50mg/l利福平的100 m丄 YEB培養基中，培養至0D600 二 0.7-0.8，菌液冰上放置10分鐘，5000 rpm離 心10 min ， 4°C，收集菌體，加入100 ml無菌雙蒸水清洗兩次。加入4 ml 10% 甘油懸浮菌體，轉到50 ml離心管。5500 rpm離心10 min ， 4°C。收集菌體， 加入500 W 10%甘油懸浮菌體，轉到1.5 ml離心管。取70W感受態細胞，加 入重組質粒pYPXmuiNOS。用去頭的黃槍頭混勻，轉到O. lcm電擊杯中。電 擊參數200Q， 1.7KV， 2.5F(美國伯樂公司)，電擊后立即加入800W SOC 培養液。培養1小時后，取100W涂抗性板篩選轉化子，28'C培養。擬南芥粘花法轉化含目的質粒的農桿菌菌株單菌落接菌到5毫升含對應抗生素的LB培養基中 2『C培養2天。將5毫升菌液轉到500毫升的液體LB培養基中28'C培養16-24 小時(0D=1. 5-2.0).液體可以在4。C保存30天。室溫下離心收集菌體，4000 g 離心10分鐘。用等休積5%的新鮮蔗糖溶液懸浮。加入0. 02%的Silwet-77混勻 后轉移到燒杯中。每個菌株用300毫升轉化，轉2-3缽。隔7天后再轉化1次。 將擬南芥倒置后浸入齒液中IO秒鐘。蓮座和花序都要侵染。侵染后將轉化植株 菌液空干3-5秒。用保鮮膜將轉化植株圈好，平放16-24小時。轉化后不要放 置在高溫和強光下。揭開保鮮膜，保持一定濕度，再生長1個月后收種子。利 用50 JLtg/mL潮霉素進行轉化植株篩選。煙草和番茄轉化挑選較飽滿的種子，用75%的酒精清洗1分鐘，次氯酸鈉加1滴十溫滅菌 IO分鐘，種子鋪在MSO培養基上，28度培養待發芽。將煙草幼葉，番茄子葉或 下胚軸剪成lcm2，放入MS0+NAAl(lug/ml)+BA2(4ug/ml)的培養基中，22度培養 l天。農桿菌培養ODO. 8-1. 0后離心5000 g離心8分鐘，無菌水清洗一次，等 體積MS培養液懸浮侵染8分鐘后，吸干放置在MS0+NAA1+BA2的培養基中，2210度共培養 3 天。然后轉入篩選培養基MS0+IAA1(0. lug/ml) 十ZT(2ug/ml)+Cb(500ug/ml)+Km(50ug/ml)培養2-3周，再轉入分化培養基 MS0十IAA1 (0. lug/ml) +ZT(2ug/ml)+ Cb(500ug/ml) +Km(100ug/ml)培養2-3周， 最后轉入生根培養基1/2MS+IAA1 (0. lug/ml)培養。 水稻轉化N6培養基為基本培養基，去殼的種子，授粉后12-15天的幼胚，經表面消 毒后接種到N6D2培養基中誘導愈傷組織(N6培養基，水解乳蛋A 500mg/L，蔗 糖30g/L, 2， 4-D 2mg/L，植物凝膠2. 5g/L， pH5. 8);培養4-7天后取愈傷組織進 行轉化。農桿菌培養ODO. 8-1. O后離心5000 g離心8分鐘，DDH20清洗一次， 等體積MS培養液懸浮侵染8分鐘后，吸干放置在MS0+NAA1+BA2的培養基中， 22度共培養3滅。然后轉入篩選培養基(加入頭孢Cb(500ug/ml)和潮霉素 HAT(50ug/ml)，轉化后的愈傷在含有和的抗性培養基上培養3 4代，轉入分化 培養基中(2 mg/L KT);幼芽長至2腿轉移到生根培養基(1/2MS+0. 5mg /L IBA)。以上培養基中分別加入500 mg/L酶水解乳蛋白(CH)， 0 700 mg /L谷氨酰胺或精氨酸，蔗糖30 S0 g/L，瓊脂6 g幾。pH 5. 8。繼代周期 為25 d。將淡黃色的胚性愈傷組織轉入分化培養基中，30 d左右分化出芽。光 照強度1 500 2 OOOlx， 12 14 h / d。從獲得的抗性植株中取一部分葉子，侵入含有X-GLUC的染色液中，篩選葉 片變藍的轉基因植株進行分子檢測，提取葉片總DNA，參照《分子克隆》的方法， 以muiNOSZ和muiNOSF為引物對對轉基因植株進行PCR檢測，擴增條件為94 。C預熱1 min; 94。C， 30 s， 6CTC， 30 s， 72°C， 4 min。共25個循環。從分 子水平i:證明目的基因是否導入。實施例4:小鼠誘導型一氧化氮合成酶基因轉化植物后的抗旱分析 將轉化植物自交純合3代，獲得純合轉化株，收取種子。播種后，移栽到 基本培養基中，培養20天，不澆水，等到植物萎蔫后，再進行.iH常澆水，觀察 植物的抗旱效果。圖示3顯示小鼠誘導型一氧化氮合成酶明顯提高單子葉植物 水稻的抗旱性能。
權利要求
1.一種消除小鼠誘導型一氧化氮合成酶基因中591位BamHI切點，763和1070位EcoRI切點，399，540和1008位SacI切點的基因序列如下591位BamHI切點序列改為GG ATGC763位EcoRI切點序列改為GACTTC1070位EcoRI切點序列改為GACTTC399位SacI切點序列改為GACCTC540位SacI切點序列改為GACCTC1008位SacI切點序列改為GAGGTC。
2. 根據權利要求1所述消除小鼠誘導型一氧化氮合成酶基因中591位BamHI 切點，763和1070位EcoRI切點，399， 540和1008位Sacl切點的基因序 歹'J，其特征在于它們的突變引物分別為591位BamHI切點突變引物591Z: 5'CCTCGCTGCA, TCGGCAGG AT,GCAG; 59IF 5'CAGGTTGGAC,CACTGCATCC, TGCCGATG;763位EcoRI切點突變引物763Z: 5'CAGGCTCTGG， ACTTCACAGC， TCATCC; 763F:5， GCTGTGAAGT,CCAGAGCCTG,AAG;1070位EcoRI切點突變引物1070Z: 5， GTGGCCTCGA,CTTCCCAGC C，TGC; 1070F:5， CTGGGAAGTC,GAGGCCACCC,ACCTCCAG;399位Sacl切點突變引物399Z:5， CAAGCCTACC,CCTCTGGAGG, AGCTCC TG; 399F:5， CAATGGCATG,AGGCAGGACC,TCCTC;540位Sacl切點突變引物540Z: 5， CTCACTCTGG， ATGACCTCAT， C; 540F:5， TGGCAAAGAT,GAGGTCATCC，AGAGTG;1008位Sacl切點突變引物1008Z: 5'GAGTGGTTCC,AGGAGGTC GG,GTTG; 1008F:5' CACTTCAACC,CGACCTCCTG,GAACCAC。
3. 根據權利要求1所述的消除小鼠誘導性一氧化氮合成酶基因中591位 BamHI切點，763和1070位EcoRI切點，399， 540和1008位Sacl切點的基因序列的制備方法包括如下步驟a.利用定點突變方法將591位BamHI， 763和1070位EcoRI切點，以 及399， 540和1008位Sacl切點消除；b. 將上述克隆含有改造過的小鼠誘導型一氧化氮合成酶基因片段的質粒，分別用Bamffl和Sacl進行雙酶切，回收DNA片段，用T4 DNA連接酶將小鼠誘導型一氧化氮合成酶基因與含有雙35s啟動子的 pYPX245質粒連接獲得重組質粒pYPXmuiNOS;c. 將上述改造后的小鼠誘導型一氧化氮合成酶基因(muiNOS)與植物 表達載體連接，獲得了含有小鼠誘導型一氧化氮合成酶基因的重組質 粒。
4.權利要求1所述消除小鼠誘導性一氧化氮合成酶基因中591位BamHI切 點763禾d 1070位EcoRI切點，399， 540禾B 1008位Sacl切點的基因序列 的用途在于該基因用于植物轉化，提高植物的抗旱能力。
全文摘要
本發明是提供一種小鼠誘導型一氧化氮合成酶基因，然后該基因轉化入植物中，提高植物的抗旱能力。本發明分別用BamHI和SacI兩個限制性內切酶酶切定點突變的小鼠誘導型一氧化氮合成酶基因，通過T4DNA連接酶將酶切好的小鼠誘導型一氧化氮合成酶基因(muiNOS)與含有雙35S啟動子的pYPX245(AY178049)植物表達載體連接，酶切鑒定和序列測定獲得了含有目的基因muiNOS的重組質粒pYPXmuiNOS。最后將小鼠誘導型一氧化氮合成酶基因轉化到植物中，獲得了具有干旱耐受性的轉基因植物。
文檔編號C12N15/52GK101260407SQ20081003634
公開日2008年9月10日 申請日期2008年4月21日 優先權日2008年4月21日
發明者付曉燕, 姚泉洪, 彭日荷, 賢 李, 熊愛生, 田永生, 永 薛, 偉 趙, 峰 高 申請人:上海市農業科學院