海灣扇貝g型溶菌酶基因和編碼蛋白及其克隆方法

專利名稱：海灣扇貝g型溶菌酶基因和編碼蛋白及其克隆方法
技術領域：
本發明涉及G型溶菌酶，特別是海灣扇貝G型溶菌酶基因(cDNA全序列和氨基酸序列)及從海灣扇貝cDNA中克隆出海灣扇貝溶菌酶的克隆方法。
背景技術：
溶菌酶是由弗萊明在1922年發現的(Proc.R.Soc.Lond.B.Biol.Sci.1922)。該酶全稱為1，4-β-N-溶菌酶，又稱粘肽N-乙酰基胞壁酰水解酶，能水解細菌細胞壁中N-乙酰氨基葡萄糖和N-乙酰胞壁酸之間的β-1，4-糖苷鍵，破壞肽聚糖支架，在內部滲透壓的作用下細胞脹裂開，引起細菌裂解，故又稱胞壁質酶，即N-乙酰胞壁質糖苷聚糖水解酶。有些革蘭氏陰性菌，如埃希氏大腸桿菌、傷寒沙門氏菌，也會受到溶菌酶的破壞。人和動物細胞無細胞壁結構亦無肽聚糖，故溶菌酶對人體細胞無毒性作用。溶菌酶是一種廣泛存在于自然界動物、植物和微生物中的小分子堿性蛋白，在機體中起非特異防御機制。正是用于溶菌酶的抗菌作用，無論在工業還是醫學上都具有重要的應用價值。首先溶菌酶可藥用，具抗菌、清除局部壞死組織、止血、消腫、消炎及恢復組織功能等作用，在醫學上可用來制消炎藥等。在食品工業上可用作防腐劑，還可添加在牙膏中作為防治齲齒的藥用牙膏。在發酵工業上是一種重要的溶菌劑，用于存作細胞壁，制備無菌體提取液。
溶菌酶可分為四型c型(雞卵清溶菌酶，chicken egg-white lysozyme，cly)、g型(鵝卵清溶菌酶，goose egg-white lysozyme，gly)、i型(invertebratelysozyme)、噬菌體溶菌酶。大部分溶菌酶都屬于c型，cly由130個氨基酸殘基組成，相對分子質量為14700。gly最早是由Jolles和Canfield發現的，約含有185個氨基酸殘基，相對分子質量為21000。Olsen，Nilson等報道的貝類i型溶菌酶與c型溶菌酶有一定的同源性。噬菌體溶菌酶位于各種噬菌體內，對溶解宿主菌起重要作用，它含有164個氨基酸殘基，相對分子質量為18700。目前在無脊椎動物中還沒有g-溶菌酶的報道，相關海洋生物報道的有Savan報道的鯉魚g-lysozyme，Rogerio報道的白蝦c-lysozyme，FengLiu報道的斑馬魚c-lysozyme，Hikima報道的牙鲆g-lysozyme，以及Olsen，Nilson等報道的與cly具有同源性的貝類i-lysozyme。
溶菌酶在海洋貝類抵御病原菌感染中扮演重要的角色，并且由于其此獨有的低溫、高鹽作用環境可使之區別于現有的哺乳動物溶菌酶，具有重要的應用前景，它可應用于海洋生物醫藥、海洋生物免疫、水產品低溫保存和運輸等不同領域。

發明內容
本發明利用構建cDNA文庫、EST分析、3’和5’RACE技術，對海灣扇貝G型溶菌酶基因進行了研究，首次從海灣扇貝中克隆到G型溶菌酶基因，該基因可以用于溶菌酶基因的體外重組表達和基因轉移，為醫藥產品開發、扇貝免疫學研究、遺傳選育和改良、病害防治以及保鮮品和防腐劑的開發奠定了基礎。
本發明從海灣扇貝中克隆到G型溶菌酶基因具有SEQ ID NO.1所示的堿基序列；其編碼蛋白具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
從海灣扇貝中克隆到G型溶菌酶基因的方法包括1)海灣扇貝總RNA的提取及mRNA的純化；2)海灣扇貝cDNA文庫構建；3)海灣扇貝cDNA文庫EST序列的大規模測定；4)海灣扇貝EST序列的同源性分析及海灣扇貝G型溶菌酶基因片段的篩選；5)用基因特異性引物AILyzF 5′-GAGCCACTTACTGTATCCAACC-3′和AILyzR 5’-TGACTCACGGCTGGCTAAGG-3’進行3’和5’RACE克隆到海灣扇貝G型溶菌酶基因cDNA全長序列。
所述的海灣扇貝總RNA的提取是從感染了鰻弧菌的海灣扇貝血淋巴中提取總RNA。
本發明克隆得到的海灣扇貝G型溶菌酶基因的cDNA序列和該基因編碼的氨基酸序列以及其中的部分序列，該基因cDNA全長659bp，有一個600bp的開放閱讀框，編碼200個氨基酸，5’非編碼區長18bp，3’非編碼區長41bp，有多聚腺苷酸加尾信號和多聚腺苷酸尾巴；該基因在扇貝免疫防御方面具有重要功能。
本發明利用表達序列標簽(EST)技術、cDNA3’和5’快速擴增技術(RACE)從海灣扇貝中克隆到G型溶菌酶基因，可用于溶菌酶的重組表達和基因轉移，并為海灣扇貝的病害防治、基因輔助選育及進一步開發為醫藥產品奠定基礎。所制得的海灣扇貝G型溶菌酶基因可在海灣扇貝遺傳選育中的應用；也可在細菌、酵母和昆蟲細胞系中的表達；同時其重組表達產物也可在藥物生產、飼料添加劑以及防腐劑和保鮮劑生產中的應用。
具體實施例方式
實施例1.一種克隆得到的海灣扇貝G型溶菌酶基因，具有以下序列(1)序列表中SEQ ID NO.1的信息序列特征長度659堿基對類型核酸鏈型雙鏈拓撲結構線形來源海灣扇貝(Argopecten irradians)序列描述GACGAGGCTGATTTGACAATGAATGCCCTAGTGGTTATAACGCTTCTTGCTTTCAGCACTGGCGCCTGGGCAGCGTCCTACACGTGCCATGGTGACGTCAGGCGTCTTCATCCAACCGGAGAGCACAACGGAGGTAACGCTGCCTCTCATAACGATGTTAAATATGACTACAACGACCTCCTTAACAAGAAGTCTTGTTACGACCAGGCTGGAGCCACTTACTGTATCCAACCATCGGTGATCGCTGCCTTAGCCAGCCGTGAGTCACGTGGTGGTCGCCTGTTGCATTCAACCAATGGATGGGGAGACCATCACCATGCTTACGGAATTTTACAGTGTGACATCCGTTACCACAGCTGTACCCAGCACGCATGGGACAGCTGTGCACACATTTCCCAGATGGTTCAAGAAGTCCTAGTGCCCTACATCAATCAGGTGGCCCACAAACATCCCACATGGTCAAAGGAGCAACAACTCCTAGGTGGAATCGCTGCTTATAACTCTGGAGTCGGAAACGTCCAGACCTGGAGTGGCCTTGACATTGGAACAACCGGAAATGACTACAGCAATGACGTAGTTGCACGTGCTCAATATCTCATCAGCCATTATGGATGGCATTAATAAAATATATGGCTACAGTTAAAAAAAAAAAAAAAAAA(2)序列表SEQ ID NO.2的信息序列特征長度200個氨基酸類型氨基酸鏈型單鏈拓撲結構線形來源海灣扇貝(Argopecten irradians)序列描述MNALVVITLLAFSTGAWAASYTCHGDVRRLHPTGEHNGGNAASHNDVKYDYNDLLNKKSCYDQAGATYCIQPSVIAALASRESRGGRLLHSTNGWGDHHHAYGILQCDIRYHSCTQHAWDSCAHISQMVQEVLVPYINQVAHKHPTWSKEQQLLGGIAAYNSGVGNVQTWSGLDIGTTGNDYSNDVVARAQYLISHYGWH實施例2.海灣扇貝G型溶菌酶基因的克隆方法1)海灣扇貝總RNA的提取和mRNA的純化用注射器從感染了鰻弧菌的海灣扇貝的閉殼肌中采集血淋巴，4℃ 700g離心10分鐘，利用Invitrogen公司的Trizol試劑并參照其說明從感染了鰻弧菌的海灣扇貝血淋巴中提取總RNA，利用QIAGENE公司的Oligotex mRNA純化試劑盒純化mRNA；2)海灣扇貝cDNA文庫構建利用Stratatagene公司cDNA Synthesis Kit和ZAP-cDNASynthesis Kit(Stratagene)并參照使用說明進行cDNA的合成，雙鏈cDNA經末端補平、EcoR I接頭連接、EcoR I末端磷酸化、Xho I內切酶酶切后利用QIAGEN公司QIAEX II Agarose Gel Extraction Kit對大于100bp的酶切片段進行回收，與Invetrogen公司Uni-ZAP XR vector載體連接，利用Stratagene公司的ZAP-cDNAGigapackIII Gold Cloning Kit試劑盒進行文庫包裝，利用Exassist Helper Phage和SOLR菌株從Uni-ZAPXR Vector上體外切割pBluescript成為質粒文庫；3)海灣扇貝cDNA文庫EST序列的大規模測定從文庫中篩選陽性克隆，使用載體通用引物T3在MegaBACE1000測序儀上進行序列測定，將得到的原始峰圖文件(*.abi，*.abd文件)數據經Phred程序處理轉化為序列文件(*.seq)和質量文件(*.seq.qual)，依據質量文件提供的數值確定獲得序列的誤差概率，去除低質量的堿基，用cross-mach程序屏蔽數據中的載體序列，從得到的數據中選取連續堿基質量大于Q13(準確率大于95％)且長度大于100bp的序列作為EST數據；4)海灣扇貝EST序列的同源性分析及海灣扇貝G型溶菌酶基因片段的篩選將獲得的全部有效的EST數據進行聚類拼接，生成Contigs和Singletons，分別將所獲的Contigs與Singletons在數據庫中進行BLASTn和BLASTx分析，根據相似性分析結果尋找出與G型溶菌酶基因同源的EST序列。
5)海灣扇貝G型溶菌酶基因cDNA全長序列的克隆(利用3’和5’RACE技術)根據與G型溶菌酶基因同源的EST序列設計基因特異性引物AILyzF 5′-GAGCCACTTACTGTATCCAACC-3′和AILyzR 5’-TGACTCACGGCTGGCTAAGG-3’，分別利用載體通用引物T3、T7與AILyzF、AILyzR進行3’和5’末端的擴增，PCR產物用1.5％瓊脂糖電泳進行檢測，用膠回收試劑盒(上海中科開瑞生物芯片公司)進行PCR產物的回收和純化，再與pMD-18T載體(大連寶生物工程有限公司)連接，轉化XL1-blue菌株，挑選陽性克隆提取質粒，用AILyzF和AILyzR引物和載體引物進行PCR檢測，確認插入片段大小后進行序列測定；測得的序列經CLUSTER分析拼接后得到全長序列；3’端PCR擴增所用體系以及反應條件25μl反應體系2.5μl 10×PCRbuffer，1.0μl MgCl2(2.5mM)，2.0μl dNTP(2.5mM)，1μl引物AILyzF(10pmol/μl)，1μl引物T7(10pmol/μl)，16.3μl of PCR-grade water，0.2μl(1U)Taq polymerase(Promega)，1μl cDNA模板；反應在PTC-100 Programmable Thermal Controller Cycler(MJ Research)中進行，反應條件為首先94℃預變性5分鐘，然后進入下列循環94℃變性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸50秒，共進行31個循環，最后72℃延伸10分鐘。
5’端PCR擴增所用體系以及反應條件25μl反應體系2.5μl 10×PCRbuffer，1.0μl MgCl2(2.5 mM)，2.0μl dNTP(2.5 mM)，1μl引物AILyzR(10pmol/μl)，1μl引物T3(10pmol/μl)，16.3μl of PCR-grade water，0.2μl(1U)Taq polymerase(Promega)，1μl cDNA模板；
反應在PTC-100 Programmable Thermal Controller Cycler(MJ Research)中進行，反應條件為首先94℃預變性5分鐘，然后進入下列循環94℃變性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸40秒，共進行34個循環，最后72℃延伸10分鐘。
實施例3.海灣扇貝G型溶菌酶基因的序列在海灣扇貝遺傳選育中的應用根據實施例1中序列表中SEQ ID NO.1的序列設計PCR和RT-PCR引物，對海灣扇貝不同個體G型溶菌酶基因的部分序列進行擴增和序列測定，比較不同個體在G型溶菌酶基因序列上的差異；同時比較不同個體G型溶菌酶基因mRNA表達水平的差異，以此指導海灣扇貝的遺傳選育。
實施例4.海灣扇貝G型溶菌酶基因的重組表達及重組表達產物的應用根據序列表SEQ ID NO.2中海灣扇貝G型溶菌酶對應cDNA序列設計引物，引入兩個不同的限制性內切酶突變位點，然后克隆到pQE系列，pET系列，pGEX-4T系列，pPIC系列，pGAPZ等系列表達載體，再將構建成的重組表達載體轉化大腸桿菌和酵母，篩選陽性克隆并以IPTG或甲醇誘導重組蛋白的表達。利用親和層析對表達產物進行多級純化，獲得體外表達的重組海灣扇貝G型溶菌酶。該產品可作為藥物、飼料添加劑、防腐劑和保鮮劑使用。
海灣扇貝SEQUENCE LISTING<110>中國科學院海洋研究所<120>海灣扇貝G型溶菌酶基因和編碼蛋白及其克隆方法<130>
<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>659<212>DNA<213>海灣扇貝(Argopecten irradians)<220>
<221>CDS<222>(19)..(618)<223>
<400>1gacgaggctg atttgaca atg aat gcc cta gtg gtt ata acg ctt ctt gct 51Met Asn Ala Leu Val Val Ile Thr Leu Leu Ala1 5 10ttc agc act ggc gcc tgg gca gcg tcc tac acg tgc cat ggt gac gtc 99Phe Ser Thr Gly Ala Trp Ala Ala Ser Tyr Thr Cys His Gly Asp Val15 20 25agg cgt ctt cat cca acc gga gag cac aac gga ggt aac gct gcc tct147Arg Arg Leu His Pro Thr Gly Glu His Asn Gly Gly Asn Ala Ala Ser30 35 40cat aac gat gtt aaa tat gac tac aac gac ctc ctt aac aag aag tct195His Asn Asp Val Lys Tyr Asp Tyr Asn Asp Leu Leu Asn Lys Lys Ser45 50 55tgt tac gac cag gct gga gcc act tac tgt atc caa cca tcg gtg atc243Cys Tyr Asp Gln Ala Gly Ala Thr Tyr Cys Ile Gln Pro Ser Val Ile60 65 70 75
海灣扇貝gct gcc tta gcc agc cgt gag tca cgt ggt ggt cgc ctg ttg cat tca291Ala Ala Leu Ala Ser Arg Glu Ser Arg Gly Gly Arg Leu Leu His Ser80 85 90acc aat gga tgg gga gac cat cac cat gct tac gga att tta cag tgt339Thr Asn Gly Trp Gly Asp His His His Ala Tyr Gly Ile Leu Gln Cys95 100 105gac atc cgt tac cac agc tgt acc cag cac gca tgg gac agc tgt gca387Asp Ile Arg Tyr His Ser Cys Thr Gln His Ala Trp Asp Ser Cys Ala110 115 120cac att tcc cag atg gtt caa gaa gtc cta gtg ccc tac atc aat cag435His Ile Ser Gln Met Val Gln Glu Val Leu Val Pro Tyr Ile Asn Gln125 130 135gtg gcc cac aaa cat ccc aca tgg tca aag gag caa caa ctc cta ggt483Val Ala His Lys His Pro Thr Trp Ser Lys Glu Gln Gln Leu Leu Gly140 145 150 155gga atc gct gct tat aac tct gga gtc gga aac gtc cag acc tgg agt531Gly Ile Ala Ala Tyr Asn Ser Gly Val Gly Asn Val Gln Thr Trp Ser160 165 170ggc ctt gac att gga aca acc gga aat gac tac agc aat gac gta gtt579Gly Leu Asp Ile Gly Thr Thr Gly Asn Asp Tyr Ser Asn Asp Val Val175 180 185gca cgt gct caa tat ctc atc agc cat tat gga tgg cat taataaaata 628Ala Arg Ala Gln Tyr Leu Ile Ser His Tyr Gly Trp His190 195 200tatggctaca gttaaaaaaa aaaaaaaaaa a 659<210>2<211>200<212>PRT<213>海灣扇貝(Argopecten irradians)<400>2Met Asn Ala Leu Val Val Ile Thr Leu Leu Ala Phe Ser Thr Gly Ala1 5 10 15Trp Ala Ala Ser Tyr Thr Cys His Gly Asp Val Arg Arg Leu His Pro20 25 30Thr Gly Glu His Asn Gly Gly Asn Ala Ala Ser His Asn Asp Val Lys35 40 45Tyr Asp Tyr Asn Asp Leu Leu Asn Lys Lys Ser Cys Tyr Asp Gln Ala50 55 60
海灣扇貝Gly Ala Thr Tyr Cys Ile Gln Pro Ser Val Ile Ala Ala Leu Ala Ser65 70 75 80Arg Glu Ser Arg Gly Gly Arg Leu Leu His Ser Thr Asn Gly Trp Gly85 90 95Asp His His His Ala Tyr Gly Ile Leu Gln Cys Asp Ile Arg Tyr His100 105 110Ser Cys Thr Gln His Ala Trp Asp Ser Cys Ala His Ile Ser Gln Met115 120 125Val Gln Glu Val Leu Val Pro Tyr Ile Asn Gln Val Ala His Lys His130 135 140Pro Thr Trp Ser Lys Glu Gln Gln Leu Leu Gly Gly Ile Ala Ala Tyr145 150 155 160Asn Ser Gly Val Gly Asn Val Gln Thr Trp Ser Gly Leu Asp Ile Gly165 170 175Thr Thr Gly Asn Asp Tyr Ser Asn Asp Val Val Ala Arg Ala Gln Tyr180 185 190Leu Ile Ser His Tyr Gly Trp His195 200
權利要求
1.海灣扇貝G型溶菌酶基因，其特征在于具有SEQ ID NO.1所示的堿基序列。
2.一種權利要求1所述的海灣扇貝G型溶菌酶基因編碼蛋白，其特征在于具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
3.一種權利要求1所述的海灣扇貝G型溶菌酶基因的克隆方法，其特征在于，包括1)海灣扇貝總RNA的提取和mRNA的純化；2)海灣扇貝cDNA文庫構建；3)海灣扇貝cDNA文庫EST序列的大規模測定；4)海灣扇貝EST序列的同源性分析及海灣扇貝G型溶菌酶基因片段的篩選；5)利用3‘和5’RACE技術克隆海灣扇貝G型溶菌酶基因cDNA全長序列。
4.按照權利要求3所述的海灣扇貝G型溶菌酶基因的克隆方法，其特征在于，所述的海灣扇貝總RNA的提取是從感染了鰻弧菌的海灣扇貝血淋巴中提取總RNA。
全文摘要
本發明涉及G型溶菌酶，特別是海灣扇貝G型溶菌酶基因和編碼蛋白及其克隆方法，海灣扇貝G型溶菌酶基因，具有SEQ ID NO.1所示的堿基序列，其編碼蛋白具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。本發明克隆到的海灣扇貝G型溶菌酶基因有多聚腺苷酸加尾信號和多聚腺苷酸尾巴，該基因在扇貝免疫防御方面具有重要功能，可用于溶菌酶的重組表達和基因轉移，并為海灣扇貝的病害防治、基因輔助選育及進一步開發為醫藥產品奠定基礎。
文檔編號C12N15/10GK1763202SQ20041005065
公開日2006年4月26日 申請日期2004年10月22日 優先權日2004年10月22日
發明者宋林生, 鄒慧斌, 胥煒, 相建海 申請人:中國科學院海洋研究所