專利名稱：：篩選ε-聚賴氨酸產生菌的方法
技術領域：
：本發明屬于微生物發酵工程領域，具體地說，本發明涉及一種S-聚賴氨酸產生菌的篩選方法。
背景技術：
：隨著人們生活水平的日益提高以及對食品安全性的認識和要求的逐步提高，化學防腐劑受到嚴峻挑戰，食品防霉防腐劑的天然化已成為今后的發展趨勢。天然食品防腐劑可分為微生物源防腐劑、動物源和植物源防腐劑。微生物食品防腐劑是指通過微生物發酵的方法，從發酵液中提取分離得到的有抑菌作用的物質。目前，國際上批準使用的微生物食品防腐劑僅有乳酸鏈球菌素、納他霉素和s-聚賴氨酸。乳酸鏈球菌素能有效抑制引起食品腐敗的許多革蘭氏陽性細菌，而對革蘭氏陰性菌、酵母菌和霉菌無效；而pH值、溫度、光照、氧化物及重金屬對納他霉素的穩定性影響較大，因此在一定程度上限制了它們的應用。s-聚賴氨酸(s-polylysine)是由微生物合成的L-賴氨酸同聚物，由s-氨基與ot-羧基通過肽鍵連接而成，其聚合度一般為2535。它是日本酒井平一和島昭二兩位博士大量篩選有價值的放線菌時發現的一種新型聚合物，進一步研究發現其具有強烈的抑菌能力，可以作為防腐劑用于食品的保鮮。作為新型的天然防腐劑，s-聚賴氨酸已于2003年IO月被FDA批準為安全食品保鮮劑。除了作為食品防腐劑，s-聚賴氨酸的應用已拓展至醫學、化妝品及高吸水性材料等。日本窒素公司已將s-聚賴氨酸的微生物發酵實現工業化，年產千噸s-聚賴氨酸的現代化工業裝置已建成投產，市場規模達數十億日元。但國內還處于實驗室研發階段，s-聚賴氨酸產生菌的篩選方法十分復雜，傳統的方法是從土壤中篩選，通過平板分離，獲得純培養物，然后對每個純培養物進行搖瓶發酵，從發酵液中檢驗是否成德拉根道夫(+)反應，再通過液相色譜的方法進一步驗證。這樣的篩選方法存在著篩選目標不確定、工作量大、周期長、篩選效率低等缺點。2002年，'Nishikawa等人采用一種簡便的方法篩選土壤中s-聚賴氨酸產生菌，在SG培養基中加入0.002%堿性染料美藍，s-聚賴氨酸與染料通過靜電作用而在平板上形成肉眼可見的特殊透明圈，從而簡化了篩選過程。但這種方法仍存在很多不足，美蘭對s-聚賴氨酸產生菌有很大的抑制作用，而且周期長。
發明內容針對上述現有技術的缺陷，本發明提供一種直觀、簡單、快速的s-聚賴氨酸產生菌的篩選方法，該方法能克服傳統篩選方法的不足，可高效直觀地將s-聚賴氨酸產生菌與其他微生物區分開來。本發明工藝簡單、工作量小、周期短、篩選效率較高。本發明的技術方案如下提供一種篩選S-聚賴氨酸產生菌的方法，該方法包括在培養基中添加帶電荷的指示劑的步驟，所述帶電荷的指示劑不是美藍。發明方法的原理是S-聚賴氨酸帶有很多正電荷，遇到帶負電荷的指示劑時，由于靜電作用異性相吸，因此形成色素聚集圈；而遇到帶正電荷的指示劑時，由于靜電作用同性排斥，因此形成色素透明圈，從而，通過在培養基中添加帶電荷的指示劑，可以選擇性地從不同樣品材料中篩選S-聚賴氨酸產生菌。所述帶電荷的指示劑可以選自帶負電荷的莧菜紅、誘惑紅、亮藍、擰檬黃、溴酚蘭或帶正電荷的中性紅。上述指示劑中，最優選的是中性紅。本發明方法中，所述帶電荷的指示劑優選以配制成溶液的形式加入培養基中。指示劑的濃度要適宜。如果指示劑的濃度太低,形成的聚集圈或透明圈不清晰明顯；但如果濃度太高，又會因為一定的毒性作用而抑制菌體生長。因此須確定合適的指示劑濃度，以此形成的聚集圈或透明圈既清晰明顯又不會對菌體的生長造成很大的抑制。培養基中通常還加入K2Cl"207溶液。由于土壤中除了放線菌外還有很多其他種類的菌，而S-聚賴氨酸產生菌通常是放線菌，因此&20207溶液作為選擇性分離放線菌的抑制劑。從目測效果和抑制程度方面考慮，發明人根據試驗結果，確定帶負電荷的指示劑中，莧菜紅的濃度可以是0.002%0.012%;誘惑紅的濃度可以是0.002%0.010%;亮藍的濃度可以是0.002%0.010%;擰檬黃的濃度可以是0.002%0.010%;溴酚蘭的濃度可以是0.002%0.010%。而帶正電荷的中性紅的濃度可以是0.0005%0.0025%，優選0.0015%。本發明方法所得的s-聚賴氨酸粗品對細菌、放線菌和酵母菌都有明顯的抑菌作用，其中對枯草芽孢桿菌的抑制最強。發明人對溴酚蘭、百里酚藍、溴百里酚藍、中性紅、甲基紅、酚紅、甲酚紅、酚酞、百里酚酞、亮藍、檸檬黃、誘惑紅和莧菜紅等帶電荷的指示劑做了研究。本發明方法的指示劑濃度的確定過程如下SG固體培養基的組成是(g/L):甘油10，瓊脂20，酵母膏0.10，NaH2P04'2H200.884，MgS04'7H200.25，(NH4)2S040.66，痕量礦物溶液140ml，水860ml，其中pH為7.0。所述痕量礦物溶液的組成是(g/L):NaCl1，FeS04'7H200.1，，CaCl2'2H200.1，明砜0.01，CuS04.5H200.01，CoCl2'6H200.1，H3B030.01，ZnSO47H2O0.1，NH4Mo7024.4H200.01)。指示劑溶液的配制0.1%溴酚蘭準確稱取0.1克溴酚蘭溶于100ml20%乙醇；0.1%百里酚藍準確稱取0.1克百里酚藍溶于100ml20%乙醇;0.05%溴百里酚藍準確稱取0.05克溴百里酚藍溶于100ml20%乙醇；0.1%中性紅準確稱取0.1克中性紅溶于100ml60%乙醇；0.2%甲基紅準確稱取0.2克甲基紅溶于100ml60。/。乙醇；0.1%酚紅準確稱取0.1克酚紅溶于100ml20%乙醇；0.1%甲酚紅準確稱取O.l克甲酚紅溶于100ml50。/。乙醇；0.1%酚酞準確稱取0.1克酚酞溶于100ml60%乙醇；0.1%百里酚酞準確稱取0.1克百里酚酞溶于100ml90%乙醇；0.8%亮藍準確稱取0.8克溴酚蘭溶于100ml無菌蒸餾水；0.8%檸檬黃準確稱取0.8克溴酚蘭溶100ml于無菌蒸餾水；0.8%誘惑紅準確稱取0.8克溴酚蘭溶于100ml無菌蒸餾水；0.8%莧菜紅準確稱取0.8克溴酚蘭溶于100ml無菌蒸餾水。將SG固體培養基12rC滅菌20min，滅菌后，待溫度降至6(TC左右時加入上述各指示劑溶液，使其終濃度均達0.002%，混勻后倒入90mm平板，制成各指示劑平板。將s-聚賴氨酸標準品配制成濃度為lg/L，并用無菌過濾膜過濾。滅菌后的牛津杯放置各指示劑平板中，牛津杯中加入200ul濃度為lg/L的s-聚賴氨酸標準品溶液及對照無菌水。室溫下放置，l天后觀察平板。由于s-聚賴氨酸是聚陽離子化合物，帶有很多正電荷，可以與帶電荷的指示劑發生靜電作用，在平板上顯現特殊現象，如表1所列。表l指示劑莧菜紅誘惑紅檸檬黃亮藍溴酚蘭中性紅特殊現象色素聚集圈色素聚集圈色素聚集圈色素聚集圈色素聚集圈色素透明圈清晰度+++++++++++++++++++++++++實驗結果表明在莧菜紅、誘惑紅、亮藍、檸檬黃、溴酚蘭平板上，裝有S-聚賴氨酸標準品的牛津杯周圍形成一個清晰明顯的色素聚集圈，因為S-聚賴氨酸帶有很多正電荷，而莧菜紅、誘惑紅、亮藍、擰檬黃、溴酚蘭帶負電荷，由于靜電作用異性相吸，故形成色素聚集圈；而在中性紅羊板上，裝有S-聚賴氨酸標準品的牛津杯周圍形成一個清晰明顯的色素透明圈，因為S-聚賴氨酸帶有很多正電荷，而中性紅帶正電荷，由于靜電作用同性排斥，故形成色素透明圈。在所有指示劑平板中裝有無菌水的牛津杯周圍沒有聚集圈及透明圈的形成。發明人還發現，采用例如百里酚藍、溴百里酚藍、甲基紅、酚紅、甲酚紅、酚酞或百里酚酞等指示劑，'也能在平板上形成色素聚集圈，但不夠清晰，因為百里酚藍、溴百里酚藍、甲基紅、酚紅、甲酚紅、酚酞、百里酚酞的解離程度很小，帶負電荷少，因此形成的色素聚集圈不夠清晰。因此，本發明選擇莧菜紅、誘惑紅、亮藍、檸檬黃、溴酚蘭或中性紅作為篩選模型的指示劑。指示劑的濃度太低，形成的聚集圈或透明圈不清晰明顯，但濃度太高，又會因為一定的毒性作用而抑制菌體生長。因此須6確定合適的指示劑濃度，以此形成的聚集圈或透明圈既清晰明顯又不會對菌體的生長造成很大的抑制。將SG固體培養基121'C滅菌20min,滅菌后，待溫度降至6(TC左右時分別加入莧菜紅、誘惑紅、亮藍、檸檬黃、溴酚蘭指示劑溶液，使其終濃度為0.0010.015%，加入中性紅指示劑溶液，使其終濃度為0.00020.0040%，混勻后倒入90mm平板，制成各濃度各指示劑的平板。將菌株S.albulusKCTC9669斜面孢子用無菌水洗滌，制成孢子懸浮液，經一系列稀釋后涂布上述各濃度各指示劑平板。根據平板上的菌株生長情況以及菌落數確定添加指示劑的濃度。試驗結果如下表2、3、4、5、6所示。其中作為對照的0.002%美藍對菌的抑制率為91.8%，菌第九天生長。表2中性紅濃度的確定<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>結果表明當中性紅的濃度為0.0005%0.0025%時，透明圈清晰明顯，而且對菌體的毒性作用小。表3莧菜紅濃度的確定<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>檸檬黃0.0010.0020扁0細0.0050.0070.0100.0120.015濃度(％)透明圈+-+++++++++++++++++++++++清晰程度菌體生第三第三第四第四第四第四第四第四第五長情況天生天生天生天生天生天生天生天生天生長長長長長長長長長抑制率5.148,2315.3118.7722.1826,8434.1846.2660.51(%)結果表明當檸檬黃的濃度為0.002%0.010%時，透明圈清晰明顯，而且對菌體的毒性作用小。表6亮藍濃度的確定亮藍濃0,0010.0020扁0據0.0050.0070.0100.0120.015度(％)透明圈+-+++++++++++++++++++++++清晰程度菌體生第三第三第四第四第四第四第四第四第五長情況天生天生天生天生天生天生天生天生天生長長長長長長長長長抑制率3.849.1013.1418.6423.4929.6737.1141.9765.32(%)結果表明當亮藍的濃度為0.002%0.010%時，透明圈清晰明顯，而且對菌體的毒性作用小。表7溴酚蘭濃度的確定9<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>結果表明當溴酚蘭的濃度為0.002%0.010%時，透明圈清晰明顯，而且對菌體的毒性作用小。本發明方法的具體操作過程如下(1)產正電物質菌株的篩選土壤樣品中加入滅菌蒸餾水，過濾后進行一系列稀釋。將SG固體培養基121。C滅菌20min，待溫度降至6(TC左右時分別加入配制好的指示劑溶液和^0:207溶液，混勻后制成平板。將稀釋后的土壤樣品涂至上述平板，3(TC培養。培養4天后，由于指示劑可以和微生物分泌出來的正電聚合物在平板上形成獨特的聚集圈瑪透明圈，因此可以產正電物質的菌株周圍形成了一個聚集圈或透明圈，不:產正電物質的菌株則沒有該現象，因此可以很靈敏地把產正電物質的菌株篩選出來。(2)產生物堿菌株的確定分離得到的產正電物質的菌株接于斜面中，培養5天。取一環孢子接種到裝有50mL發酵培養基的250mL三角瓶中，30。C培養3天。用Dragendorff試劑對發酵液進行檢測，有兩株菌對Dragendorff反應呈陽性。(3)產物組成成分的鑒定將2株生物堿呈陽性的菌株的發酵液進行提取，得到粗品，將粗品和e-聚賴氨酸標準品裝入安瓿管中,加入6mol/LHCl密封，于121'C水解24小時,用薄層層析法分析組成成分。薄層層析條件為硅膠60鋪板，展開劑為正丁醇冰醋酸吡啶水=4:i:i:2(體積比)；顯色劑為茚三酮。菌株發酵液的粗品和S-聚賴氨酸標準品在此展開劑中停留在薄層原位點，但與茚三酮反應呈陽性，而菌株發酵液的粗品和S-聚賴氨酸標品的鹽酸水解液，展開后只有一個斑點，其斑點位置與L-賴氨酸標品溶液的斑點一致，說，菌株發酵液的粗品為單一L-賴氨酸的聚合物。相對于用0.002%美藍作為指示劑篩選￡-聚賴氨酸產生菌，本發明的篩選方法可高效直觀地將s-聚賴氨酸產生菌與其他微生物區分開來，本發明工藝簡單、工作量小、周期短、篩選效率較高。圖l是以中性紅為指示劑的平板上形成的透明圈；圖2是以莧菜紅為指示劑的平板上形成的聚集圈；圖3是以誘惑紅為指示劑的平板上形成的聚集圈；圖4是以亮藍為指示劑的平板上形成的聚集圈；圖5是以檸檬黃為指示劑的平板上形成的聚集圈；圖6是以溴酚蘭為指示劑的平板上形成的聚集圈。具體實施方式實施例1(1)產正電物質菌株的篩選lg土壤樣品中加入10ml滅菌蒸餾水，過濾后進行一系列稀釋。將SG固體培養基121'C滅菌20min，待溫度降至6(TC左右時加入中性紅溶液(終濃度0.0015%)+K2Cr207(終濃度50mg/ml)，混勻后制成平板。將稀釋后的土壤樣品涂至上述平板，3(TC培養。培養4天后，由于中性紅可以和微生物分泌出來的正電聚合物在平板上形成獨特的透明圈，因此可以產正電物質的菌株周圍形成了一個透明圈，不產正電物質的菌株則沒有該現象，因此可以很靈敏地把產正電物質的菌株篩選出來。(2)產生物堿菌株的確定分離得到的產正電物質的菌株接于斜面中，培養5天。取一環孢子接種到裝有50mL發酵培養基的250mL三角瓶中，30。C培養3天。用Dragendorff試劑對發酵液進行檢測，有兩株菌對Dragendorff反應呈陽性。(3)產物組成成分的鑒定將2株生物堿呈陽性的菌株的發酵液進行提取，得到粗品，將粗品和s-聚賴氨酸標準品裝入安瓿管中，加入6mol/LHCl密封，于121。C水解24小時，用薄層層析法分析組成成分。薄層層析條件為硅膠60鋪板,展開劑為正丁醇冰醋酸吡啶水=4:i:i:2(體積比)；顯色劑為茚三酮。菌株發酵液的粗品和s-聚賴氨酸標準品在此展開劑中停留在薄層原位點，但與茚三酮反應呈陽性，而菌株發酵液的粗品和s-聚賴氨酸標品的鹽酸水解液，展開后只有一個斑點，其斑點位置與L-賴氨酸標品溶液的斑點一致，說明菌株發酵液的粗品為單一L-賴氨酸的聚合物。將菌株發酵所得的發酵液，利用圓濾紙片法對枯草芽孢桿菌、滕黃八疊球菌和畢赤酵母菌進行抑菌效果的研究。所得的s-聚賴氨酸粗品對此三種菌都有明顯的抑菌作用，其中對枯草芽孢桿菌的抑制最強。實施例2(1)產正電物質菌株的篩選lg土壤樣品中加入10ml滅菌蒸餾水，過濾后進行一系列稀釋。將SG固體培養基12rC滅菌20min，待溫度降至60。C左右時加入莧菜紅溶液(終'濃度0.005%)+K2Cr207(終濃度50mg/ml)，混勻后制成平板。將稀釋后的土壤樣品涂至上述平板，3(TC培養。培養4天后，由于莧菜紅可以和微生物分泌出來的正電聚合物在平板上形成獨特的聚集圈，因'此可以產正電物質的菌株周圍形成了一個聚集圈，不產正電物質的菌株則沒有該現象，因此可以很靈敏地把產正電物質的菌株篩選出來。(2)產生物堿菌株的確定分離得到的產正電物質的菌株接于斜面中，培養5天。取一環孢子接種到裝有50mL發酵培養基的250mL三角瓶中，3CTC培養3天。用Dragendorff試劑對發酵液進行檢測，有兩株菌對Dragendorff反應呈陽性。(3)產物組成成分的鑒定'將2株生物堿呈陽性的菌株的發酵液進行提取，得到粗品，將粗品和s-聚賴氨酸標準品裝入安瓿管中，加入6mol/LHCl密封，于12廠C水解24小時，用薄層層析法分析組成成分。薄層層析條件為硅膠60鋪板，展開劑為正丁醇冰醋酸吡啶7jc=4:i:i:2(體積比)；顯色劑為茚三酮。菌株發酵液的粗品和s-聚賴氨酸標準品在此展開劑中停留在薄層原位點，但與茚三酮反應呈陽性，而菌株發酵液的粗品和s-聚賴氨酸標品的鹽酸水解液，展開后只有一個斑點，其斑點位置與L-賴氨酸標品溶液的斑點一致，說明菌株發酵液的粗品為單一L-賴氨酸的聚合物。將菌株發酵所得的發酵液，利用圓濾紙片法對枯草芽孢桿菌、滕黃八疊球菌和畢赤酵母菌進行抑菌效果的研究。所得的s-聚賴氨酸粗品對此三種菌都有明顯的抑菌作用，其中對枯草芽孢桿菌的抑制最強。實施例3(1)產正電物質菌株的篩選lg土壤樣品中加入10ml滅菌蒸餾水，過濾后進行一系列稀釋。將SG固體培養基121'C滅菌20min，待溫度降至60'C左右時加入誘惑紅溶液(終濃度0.005%)+K2Cr207(終濃度50mg/ml),混勻后制成平板。將稀釋后的土壤樣品涂至上述平板，3CTC培養。培養4天后，由于誘惑紅可以和微生物分泌出來的正電聚合物在平板上形成獨特的聚集圈，因此可以產正電物質的菌株周圍形成了一個聚集圈，不產正電物質的菌株卿沒有該現象，因此可以很靈敏地把產正電物質的菌株篩選出來。(2)產生物堿菌株的確定分離得到的產正電物質的菌株接于斜面中，培養5天。取一環孢子接:種到裝有50mL發酵培養基的250mL三角瓶中，3(TC培養3天。用Dragendorff試劑對發酵液進行檢測，有兩株菌對Dragendorff反應呈陽性。(3)產物組成成分的鑒定將2株生物堿呈陽性的菌株的發酵液進行提取，得到粗品，將粗品和s-聚賴氨酸標準品裝入安瓿管中，加入6mol/LHCl密封，于121'C水解24小時，用薄層層析法分析組成成分。薄層層析條件為硅膠60鋪板，，開劑為正丁醇冰醋酸吡啶水=4:i:i:2(體積比)；顯色劑為茚f酮。菌株發酵液的粗品和s-聚賴氨酸標準品在此展開劑中停留在薄層原位點，但與茚三酮反應呈陽性，而菌株發酵液的粗品和s-聚賴氨酸標品的鹽酸水解液，展開后只有一個斑點，其斑點位置與L-賴氨酸標品溶液的斑點13一致，說明菌株發酵液的粗品為單一L-賴氨酸的聚合物。將菌株發酵所得的發酵液，利用圓濾紙片法對枯草芽孢桿菌、滕黃八疊球菌和畢赤酵母菌進行抑菌效果的研究。所得的S-聚賴氨酸粗品對此三種菌都有明顯的抑菌作用，其中對枯草芽孢桿菌的抑制最強。實施例4(1)產正電物質菌株的篩選lg土壤樣品中加入10ml滅菌蒸餾水，過濾后進行一系列稀釋。將SG固體培養基12rC滅菌20min，待溫度降至6(TC左右時加入擰檬黃溶液(終濃度0.005%)+K2Cr207(終濃度50mg/ml)，混勻后制成平板。將稀釋后的土壤樣品涂至上述平板，30'C培養。培養4天后，由于檸檬黃可以和微生物分泌出來的正電聚合物在平板上形成獨特的聚集圈，因此可以產正電物質的菌株周圍形成了一個聚集圈，不產正電物質的菌株則沒有該現象，因此可以很靈敏地把產正電物質的菌株篩選出來。(2)產生物堿菌株的確定分離得到的產正電物質的菌株接于斜面中，培養5天。取一環孢子接種到裝有50mL發酵培養基的250mL三角瓶中，30。C培養3天。用Dragendorff試劑對發酵液進行檢測，有兩株菌對Dragendorff反應呈陽性。(3)產物組成成分的鑒定將2株生物堿呈陽性的菌株的發酵液進行提取，得到粗品，將粗品和s-聚賴氨酸標準品裝入安瓿管中，加入6mol/LHCl密封，于121"C水解24小時，用薄層層析法分析組成成分。薄層層析條件為硅膠60鋪板，展開劑為正丁醇冰醋酸吡啶水=4:i:i:2(體積比)；顯色劑為茚三酮。菌株發酵液的粗品和s-聚賴氨酸標準品在此展開劑中停留在薄層原位點，但與茚三酮反應呈陽性，而菌株發酵液的粗品和s-聚賴氨酸標品的鹽酸水解液，展開后只有一個斑點，其斑點位置與L-賴氨酸標品溶液的斑點一致'，說明菌株發酵液的粗品為單一L-賴氨酸的聚合物。將菌株發酵所得的發酵液，利用圓濾紙片法對枯草芽孢桿菌、滕黃八疊球菌和畢赤酵母菌進行抑菌效果的研究。所得的s-聚賴氨酸粗品對此三種菌都有明顯的抑菌作用，其中對枯草芽孢桿菌的抑制最強。實施例5(1)產正電物質菌株的篩選lg土壤樣品中加入10ml滅菌蒸餾水，過濾后進行一系列稀釋。將SG固體培養基121。C滅菌20min，待溫度降至60'C左右時加入亮藍溶液(終濃度0.005%)+K2Cr207(終濃度50mg/ml),混勻后制成平板。將稀釋后的土壤樣品涂至上述平板，3(TC培養。培養4天后，由于亮藍可以和微生物分泌出來的正電聚合物在平板上形成獨特的聚集圈，因此可以產正電物質的菌株周圍形成了一個聚集圈，不產正電物質的菌株則沒有該現象，因此可以很靈敏地把產正電物質的菌株篩選出來。(2)產生物堿菌株的確定分離得到的產正電物質的菌株接于斜面中，培養5天。取一環孢子接種到裝有50mL發酵培養基的250mL三角瓶中，3(TC培養3天。用Dragendorff試劑對發酵液進行檢測，有兩株菌對Dragendorff反應呈陽性。(3)產物組成成分的鑒定將2株生物堿呈陽性的菌株的發酵液進行提取，得到粗品，將粗品和s-聚賴氨酸標準品裝入安瓿管中，加入6mol/LHCl密封，于121°。水解24小時，用薄層層析法分析組成成分。薄層層析條件為硅膠60鋪板,展開劑為正丁醇冰醋酸吡啶水=4:i:i:2(體積比)；顯色劑為茚三酮。菌株發酵液的粗品和s-聚賴氨酸標準品在此展開劑中停留在薄層原位點，但與茚三酮反應呈陽性，而菌株發酵液的粗品和e-聚賴氨酸標品的鹽酸水解液，展開后只有一個斑點，其斑點位置與L-賴氨酸標品溶液的斑點一致，說明菌株發酵液的粗品為單一L-賴氨酸的聚合物。將菌株發酵所得的發酵液，利用圓濾紙片法對枯草芽孢桿菌、滕黃乂乂疊球菌和畢赤酵母菌進行抑菌效果的研究。所得的s-聚賴氨酸粗品對此三種菌都有明顯的抑菌作用，其中對枯草芽孢桿菌的抑制最強。實施例6(1)產正電物質菌株的篩選lg土壤樣品中加入10ml滅菌蒸餾水，過濾后進行一系列稀釋。將SG固體培養基121'C滅菌20min，待溫度降至6(TC左右時加入溴酚蘭溶液(終濃度0.005%)+K2Cr207(終濃度50mg/ml)，混勻后制成平板。將稀釋后的土壤樣品涂至上述平板，3(TC培養。培養4天后，由于溴酚蘭可以和微生物分泌出來的正電聚合物在平板上形成獨特的聚集圈，因此可以產正電物質的菌株周圍形成了一個聚集圈，不產正電物質的菌株則沒有該現象，因此可以很靈敏地把產正電物質的菌株篩選出來。(2)產生物堿菌株的確定分離得到的產正電物質的菌株接于斜面中，培養5天。取一環孢子接種到裝有50mL發酵培養基的250mL三角瓶中，30。C培養3天。用Dragendorff試劑對發酵液進行檢測，有兩株菌對Dragendorff反應呈陽性。(3)產物組成成分的鑒定將2株生物堿呈陽性的菌株的發酵液進行提取，得到粗品，將粗品和s-聚賴氨酸標準品裝入安瓿管中，加入6mol/LHCl密封，于121。C水解24小時，用薄層層析法分析組成成分。薄層層析條件為硅膠60鋪板，展開劑為正丁醇冰醋酸吡啶水=4:i:i:2(體積比)；顯色劑為茚三酮。菌株發酵液的粗品和e-聚賴氨酸標準品在此展開劑中停留在薄層原位點，但與茚三酮反應呈陽性，而菌株發酵液的粗品和s-聚賴氨酸標品的鹽酸水解液，展開后只有一個斑點，其斑點位置與L-賴氨酸標品溶液的斑點一致,，說明菌株發酵液的粗品為單一L-賴氨酸的聚合物。將菌株發酵所得的發酵液，利用圓濾紙片法對枯草芽孢桿菌、滕黃乂、疊球菌和畢赤酵母菌進行抑菌效果的研究。所得的s-聚賴氨酸粗品對此三種菌都有明顯的抑菌作用，其中對枯草芽孢桿菌的抑制最強。1權利要求1.一種篩選ε-聚賴氨酸產生菌的方法，該方法包括在培養基中添加帶電荷的指示劑的步驟，所述帶電荷的指示劑不是美藍。2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述帶電荷的指示劑是莧菜紅、誘惑紅、亮藍、檸檬黃、溴酚蘭或中性紅。3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述帶電荷的指示劑是中性紅。4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述帶電荷的指示劑是配制成溶液的形式加入培養基中。5.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所添加的莧菜紅的濃度是0.002%0.012%。6.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所添加的誘惑紅的濃度是0.002%0.010%。7.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所添加的亮藍的濃度是0.002%0.010%。8.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所添加的檸檬黃的濃度是0.002%0.010%。9.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所添加的溴酚蘭的濃度是0.002%0.010%。10.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所添加的中性紅的濃度是0.0005%0.0025%。11.根據權利要求10所述的方法，其特征在于，所添加的中性紅的濃度是0.0015%。全文摘要本發明提供一種篩選ε-聚賴氨酸產生菌的方法，該方法包括在培養基中添加帶電荷的指示劑的步驟，所述帶電荷的指示劑不是美藍。本發明的篩選方法可高效直觀地將ε-聚賴氨酸產生菌與其他微生物區分開來，本發明工藝簡單、工作量小、周期短、篩選效率較高。文檔編號C12Q1/04GK101580866SQ20081003748公開日2009年11月18日申請日期2008年5月15日優先權日2008年5月15日發明者孫湘婷,巖王,陳少欣申請人:上海醫藥工業研究院